Дипломдық жұмыс: Алма гермоплазмасының криогенді коллекциясын жасау

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫҢ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ

 

ӘЛ-ФАРАБИ АТЫНДАҒЫ ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

 

 

Биология факультеті

 

 

Генетика және молекулалық биология кафедрасы

 

 

 

Бітіру жұмысы

 

 

 

Алма гермоплазмасының криогенді коллекциясын жасау

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Алматы — 2010

МАЗМҰНЫ

 

КІРІСПЕ	3
1. НЕГІЗГІ БӨЛІМ	4-29
1.1 Әдебиетке шолу	4-18
1.1.1 Криобиологияның дамуы	4-5
1.1.2 Өсімдік материалын криосақтаудың ерекшеліктері	5-6
1.1.3 Өсімдік клеткаларының төмен температураларға бейімделу жолдары	6-8
1.1.4 Криосақтаудың негізгі сатылары	8-14
1.1.5 Сұйық азотта сақтау	14
1.1.6 Еріту, криопротектордан тазарту және өсімдіктердің регенерациясы                                                                                  14
1.1.7 Криосақталған гермоплазманы бағалау әдістері	15
1.1.8 Алма гермоплазмасын криосақтау	15-16
1.1.9 Генетикалық ресурстарды сақтау үшін криоcақтау әдістерін пайдалану	17-18
1.2. Материалдар мен әдістер	19-23
1.2.1 In vitro жағдайына енгізу	19
1.2.2 Эксланттарды Viss ортаға тексеру	19-20
1.2.3 In vitro өсімдіктерді микроклональды көбейту	20
1.2.4 Апикальды меристемаларды бөліп алу	20
1.2.5 Апикальды меристемаларды криосақтау                               20-23
1.3 Нәтижелер мен оларды талқылау	24-29
1.3.1 Aлманың апикальды меристемарын бөліп алу әдісін жетілдіру	24
1.3.2 Алма меристемаларын криосақтау әдісінің оптимизациясы	25
1.3.3 Алма гермоплазмасының коллекциясын жасау	25-29
ҚОРЫТЫНДЫ	30
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ	31-33

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

КІРІСПЕ

 

    Жемісті культураларды генетикалық жақсартудың негізгі шарттарының бірі – шаруашылыққа құнды белгілерге ие өсімдіктердің жабайы формалары мен мәдени түрлерінің генофондын сақтау болып табылады. Қазіргі кезде өсімдіктердің генетикалық материалын сақтаудың бірнеше тәсілі бар. Бәрінен бұрын, бұл далалық гендер банкі мен помологиялық коллекциялар.

    Әлемдік практикада генетикалық материалды сақтаудың дәстүрлі формаларын толықтыру ретінде баяу жүретін метаболизмді қамтамасыз ететін, гермоплазма үлгілерін in vitro криоконсервациялаудың биоинженерлі әдістері кең қолданылады.

    Криоконсервацияның артықшылықтары: егу аудандарын үнемдеу, вирустар мен патогенді микроорганизмдерден таза өсімдік алу, көбею коэффициентін мың есе арттыру, сирек кездесетін және жоғалып бара жатқан өсімдіктердің сорттары мен формаларының генофондын ұзақ уақыт сақтау мүмкіндігі [1].

    Криосақтау – бұл өсімдік ұлпаларын, мүшелерін және клеткаларын терең мұздату және өте төмен температурада сақтау әдісі (-196⁰C). Бұл обьектілердің генетикалық сипаттамаларын кез келген мерзімде сақталуына мүмкіндік береді. Бұл әдіс арқылы әр түрлі материалдарды, бөліп алынған протопласттардан бастап ұрық пен тұқымдарға дейін сақтауға болады [2].

    Жұмыстың мақсаты алманың селекциялық құнды сорттары мен формаларының криогенді коллекциясын жасау және алма гермоплазмасын сұйық азотта сақтау ұзақтығының әсерін анықтау болып табылады.

Міндеттері:

— пробиркалық өсімдіктердің апикальды меристемаларын бөліп алу және культивирлеудің әдістемелерін жетілдіру;

— алма меристемаларын криосақтау әдісінің оптимизациясы;

— алма гермоплазмасының коллекциясын жасау.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. НЕГІЗГІ БӨЛІМ

 

1.1 Әдебиетке шолу

 

1.1.1 Криобиологияның дамуы

 

    Өсірілетін материалды сақтаудың ең тиімді және сенімді әдістері криогенді әдістер болып табылады. Температура өте қатты төмендегенде, яғни материал мұздағанда, зат алмасу толық тоқтап, сақтау кезінде молекулаларда айтарлықтай физико-химиялық өзгерістер болмайды [1,2].

    Өсімдік клеткаларын сақтаудың криогенді әдістері өткен ғасырдың алпысыншы жылдарында жасала бастады, алайда 1905 жылы-ақ сұйық азотта тұқымдар мұздатылған. Өсімдіктердің суыққа төзімділігін зерттеуді 1908 жылы академик Н.А.Максимов бастаған [3].

    Клеткалық және ұлпа культураларын ең алғаш 30 жыл бұрын мұздата бастады. Бұл жұмыстарды И.И.Туманов, Р.Г.Бутенко мен И.В.Оголевец жемісті дақылдардың каллустарымен жүргізді [4]. Каллустарды сұйық азот температурасына дейін мұздату мүмкіндігін А.Сакаи мен И.Сугавара терек ұлпасында, М.Такучи маршанция ұлпасында көрсетті [5]. Бұл жұмыстарда каллустарды алдын-ала шынықтырып, қант мөлшері көп орталарда өсірді. Суспензиялы культураларды зерттеуді Кватран зығыр клеткаларынан бастап, Латто, И.Сугавара, А.Сакаи мен Б.Финкль сәбіз, темекі, т.б.өсімдіктермен жалғастырды [3]. Б.Финкль мен Дж.Ульрих криопротекторлардың әр түрлі қатынасын пайдаланып, қант қамысының суспензиялы және каллус клеткалары культурасын сәтті мұздатуға қол жеткізді [6].

    Қазіргі кезде әр түрлі жеміс-жидекті дақылдардың меристемаларын криоконсервациялау әдістерін жетілдіру жұмыстары жүргізілуде. АҚШ-та криоконсервация бұрыннан бері жеміс-жидекті дақылдар мен жүзімнің генетикалық материалын сақтаудағы негізгі әдіс болып табылады. АҚШ-та өсімдіктер гермоплазмасын сақтаудың Ұлттық жүйесі құрылған. Мұнда 1983 жылдан бері суықта сақтау, ал 1987 жылдан бері криосақтау әдістері қолданылады.

    Қазақстанда криосақтау бағытындағы жұмыстар 2002 жылдан бастап Ұлттық Ғылым Академиясының академигі, профессор И.Р.Рахимбаевтың жетекшілігімен Өсімдіктер физиологиясы, генетикасы және биоинженериясы институтында жүргізіле бастады [7,8].

    Ресейдің Қиыр Шығысының 5 регионында өсетін өсімдіктердің 33 тұқымдасының 103 түрінің тұқымдарының криотөзімділігі зерттелген. Зерттелген түрлердің тұқымдарының 89,1%-ның криосақтау процесінде тіршілік қабілеті төмендемегені анықталды. Тұқымдардың төмен температураға жауап реакциясының популяция аралық өзгергіштігі алты түр үшін анықталды. Терең анабиозды тудыратын сұйық азотта тұқымдарды мұздату – оларды ұзақ уақыт сақтау режимі ретінде қолданылуы мүмкін. Генетикалық әртүрлілікті популяция деңгейінде алдын-ала бағалау түр генофондының мобилизациясын жүргізуге мүмкіндік береді. Алынған нәтижелер жабайы өсетін флораны сақтау және табиғи ресурстарды қалпына келтіру мақсатымен тұқымдар банкін жасауда маңызды саты болып табылады [9].

 

1.1.2 Өсімдік материалын криосақтаудың ерекшеліктері

 

    Қазіргі кезде клетка ұлпалары мен мүшелерді терең мұздату медицина мен мал шаруашылығында кең қолданылуда. Криосақтаудың қиыншылықтары өсімдік клеткаларының ерекшеліктерімен байланысты: өлшемі үлкен, вакуольдерінің болуы, судың көп мөлшері. Мұздату және қайта ерітіп алу кезінде клеткалардың осы ерекшеліктері арқасында клетка мембраналары күшті зақымдалады. Мұздату кезінде клетканың өлуі бірнеше себеппен болады. Клеткалардың зақымдалуы клетка ішінде де, сыртында да мұз кристалдарының түзілуімен байланысты. Мұз кристалдары алдымен клетка сыртындағы ерітіндіде, яғни клетка сыртындағы кеңістікте пайда болады. Цитоплазманың қату нүктесі -1⁰C, алайда клеткалар -10⁰C-15⁰C-қа дейін қатпайды, өйткені плазмалемма клетка сыртында түзіліп жатқан мұз кристалдарының клетка ішіне өтуіне кедергі жасап тұрады. Клека ішінде мұз кристалдарының түзілуі клетканың мембранасын зақымдайды [2].

    Егер температура баяу төмендесе, клеткадағы бос сулар клетка сыртына шығып, сыртқы кеңістікте түзіліп жатқан мұз кристалдарына қосылады. Жылдам мұздатқан кезде дегидратация процесі жүрмей, бос су клетка ішінде, яғни цитоплазмада мұз кристалдарына айналады. Баяу мұздату кезінде клетка ішінде мұз кристалдары мүлдем түзілмеуі мүмкін, алайда бұл кезде протоплазманың қысылуы және күшті дегидратация процесі жүреді. Клетканың сусыздануы мұз түзілуі нәтижесінде клетка сыртындағы ерітіндінің концентрленуінен жүреді. Плазмолиз және ол тудырған осмостық стресс клетканың өлуіне әкеліп соғады [10].

    Криозақымдалудың 2 факторлы гипотезасы бар. Бірінші фактор – мұздың түзілуі (мұздың клеткаішілік кристалдары тез мұздатқанда механикалық зақым келтіреді). Екінші фактор – мұздың түзілуімен байланысты клетканың сусыздануы, осмостық стресс.

    Әртүрлі зерттеулерде осмотикалық зақымдалу эффектісі клетка ішіндегі көлемнің азаюымен, клетка сыртындағы және клетка ішілік заттардың концентрациясы, рН өзгеруі және ферменттердің активтілігімен байланысты деп көрсетіледі.

    Бұл мәселені шешу үшін өсімдік ұлпаларын криоқорғаудың екі негізгі стратегиясы ұсынылады:

– криоқорғайтын заттарды қосу,

– қатуға, мұзға айналуға қабілетті судың көп бөлігін буландыру жолымен жою.

    Бұл екі стратегияның мақсаты – ұлпалардағы мұздың түзілуін азайту немесе болдырмау [11].

      Плазмолизге ұшыраған клетка

 

                                            Мұз кристаллдары

          А)                                                              Б)

Сурет 1. Клеткаларды мұздату: А) Жылдам, Б) Баяу

 

 

    Криосақтаудағы барлық тәсілдер осы зақымдаушы екі факторды баланстауға бағытталған.

    Терең мұздату үшін әр түрлі клеткалар, ұлпалар мен мүшелер, каллус және суспензиялық культуралар, протопласттар, эмбриоидтер, тұқымдар, сонымен қатар апикальды меристемалар қолданылады.

    Дәл осы апикальды меристемалар өсімдіктердің регенерациясын қамтамасыз етеді, өйткені бұлар бастапқы өсімдіктердің дәл генетикалық көшірмелері болып табылады.

    Апикальды меристемаларды in vitro жағдайда қоректік орталарда өсірілетін асептикалық өсімдіктерден, өркендерден бөліп алады.

 

1.1.3 Өсімдік клеткаларының төмен температураларға бейімделу жолдары

 

    Мұздатудың өсімдік организмінің құрылымдық және функционалдық бүтіндігіне әсерін зерттегенде, төмен температура өсімдік құрылымының әр түрлі деңгейінде комплексті өзгерістер тудыратыны анықталды.

    In vivo жағдайда табиғи суыққа төзімділік пен in vitro жағдайда криотөзімділік бойынша әр түрлі зерттеу нәтижелері өсімдіктер клеткаларында гипотермия кезінде, төмен температуралық факторға бейімделуге бағытталған белгілі бір механизмдер әсер ететінін көрсетеді [7].

    С.В.Климовтың статьясында [12] өсімдіктер құрылымының әртүрлі деңгейлерінде (организмнен молекулалық деңгейге дейін) өсімдіктердің төмен температураға бейімделуінің әртүрлі жолдарын бір стратегия аясында қарастырған.

    Организм деңгейінде бұл стратегия кеңістік пен уақытта өсімдіктердің бейімделіп орналасуы арқылы іске асады. Бұл активті және пассивті қорғаныс есебінен суықтың әсерін біршама жақсарту немесе болдырмауға; өсімдіктің жылуды сақтауына; қоршаған ортадағы жылуды жұтуға; т.б. мүмкіндік береді.

    Ұлпа деңгейінде мына механизмді бөліп көрсетеді: клетка аралық мұз түзу – клетканың беткі жағында немесе протопласт пен клетка қабырғасы арасында мұздың түзілуі болмайды, екінші жағынан, мұз түзілуі кезінде бөлінетін жылу әсерінен протопласт қызуы жүреді. Ұлпаны сусыздандыру – ұлпадағы су мөлшерін азайтып, төмен температуралық зақымдалулардың алдын алудың ең тиімді тәсілі.

    Ұлпаны салқындату – мұзға айналу болмаған кезде ұлпа сұйықтығының қату нүктесінен төмен, мұздауы, сууы.

    Төмен температураға бейімделудің клеткалық деңгейін майда, ұсақ клеткалық бағытында клеткалардың құрылымдық өзгеруі, клетка қабырғаларының қаттылау болуы, цитоскелеттің деполимеризациясы, протопласттағы судың азаюы, протопласт қызметінің өзгерістері құрайды.

    Субклеткалық деңгейде органеллалар саны мен өлшемдерінің өсуі бақыланады. Әсіресе бұл өзгеріс энергия беруші органеллалар – митохондрия мен хлоропластарға байланысты.

    Мембраналық деңгейде көптеген инвагинация мен қатпарлардың пайда болуы арқылы мембрананың жалпы ауданы өседі, липидті қосқабатта белокты бөлшектердің орналасу тығыздығы төмендейді. Мембрананың өз қызметін сақтап қалуы клетка үшін өте маңызды. Алайда төмен температуралар липидті қосқабаттың қатаюымен клетка үшін зиянды мембрананың сұйық кристалды күйден гель күйіне ауысуына әкеп соғады.

    Молекулалық деңгейде негізгі молекулалық және сандық өзгерістер болады. Полярлы липидтер, соның ішінде суды ұстап қалу қабілеті жоғары және зарядталған топтардың болуы тән фосфолипидтер де интенсивті синтезделеді. Сәйкесінше бейтарап липидтердің үлесі азаяды. Май қышқылдарының ішінде ұзын тізбекті қанықпаған қышқылдар көбірек синтезделеді. Суықпен шынықтыру кезінде мембрананың фосфолипидтерімен қанықпаған май қышқылдарымен баюы мембрананың фазалы ауысу нүктесін температура төмен аумаққа жылжытады.

    Қазіргі кезде организмнің төмен температураға бейімделуінде маңызды орынды мембрана липидтерімен қоса, белоктар да алады. Ферментативті бейімделудің негізгі типтері:

 1) модуляционды типті бейімделу – мұнда біріншілік құрылымы өзгермей, төмен температураларда фермент активтілігінің бейімделу өзгергіштігі туады;

 2) сандық бейімделу – фермент концентрациясында бейімделу өзгергіштігі пайда болады;

3) сапалық бейімделу – “изоферменттер” синтезделеді [13].

    Өсімдіктердің төмен температураға деген бейімделу реакциясының ең жақсы зерттелгені суда еритін көмірсулардың жиналуы: сахароза, фруктоза, глюкоза, т.б. Суда еритін көмірсулар өсімдіктердің төмен температураға төзімділігін клетканың мембраналық жүйесіне криопротекторлық әсері, энергия көзі ретінде метаболитті әсері, клетка ішінде мұздың түзілуін азайтатын осмостық әсері арқасында жоғарылатады.

    Соңғы кезде қанттар криопротекторлар ретінде әсер етіп қоймай, тікелей плазмалемманы модификациялайды деген мәліметтер бар [4].

    Суда еритін көмірсулардың жиналуы мүмкін әртүрлі құрылым деңгейінде өсімдіктердің төмен температураларға бейімделу тәсілдері мен жолдарын бастайды.

    In vitro криосақтау әдісі криотөзімділікті клеткалық деңгейде зерттеп, өсімдіктерді өте төмен температураларға бейімделу механизмдерін анықтау үшін қолданылады. Өсімдіктердің in vivo жағдайдағы бейімделу механизмдерін білу in vitro жағдайда төмен температураларға бейімделу тәсілдері мен жолдарын жасау үшін қажет.

 

1.1.4 Криосақтаудың негізгі сатылары

 

    Өсімдік клеткалары мен ұлпаларын криосақтаудың сатылары:

 1) Өсімдік материалын алдын-ала өңдеу

 2) Ұлпаларды криосақтаудың бір әдісімен мұздату

 3) Сұйық азотта сақтау

 4) Жылдам еріту

 5) Криопротектордан тазарту

 6) Меристемаларды рекультивирлеу және өсімдіктер регенерациясы (сурет 1).

    Сатылардың әрқайсысын толығырақ қарастырайық.

    Өсімдік материалын алдын-ала өңдеу. Мұздату кезінде өсімдік клеткаларының өлуінің себебі, жоғарыда айтылып кеткендей, клетканың ішінде мұздың түзілуі және оның мембраналарының механикалық зақымдалуы клетканың сусыздануы нәтижесіндегі осмостық стрестің әсері болып табылады. Криосақтауда қолданылатын тәсілдердің барлығы зақымдаушы факторлардың әсерін азайтуға бағытталған.

    Криосақтау кезінде өсімдік материалын алдын-ала өңдеу өсімдіктер криопротектордың әсерін және мұздату процедурасын жеңіл өткеру үшін қолданылады [14]. Өсімдіктерді алдын-ала өңдеудің басты мақсаты − жоғары концентрленген және көбінесе улы зат болып келетін криопротекторларды енгізгенге дейін клеткаларды сусыздандыру. Кейбір алдын-ала өңдеулерде сусыздандыру мен мембраналарды тұрақтандыру бірге жүргізіледі.

    Өсімдік материалын алдын-ала өңдеудің үш тәсілін бөліп көрсетеді: 1)Суықты акклиматизация; 2) Химиялық өңдеу; 3) Ұлпалардың дегидратациясы.

    Криосақтау тиімділігін жоғарылатудың бір тәсілі – in vitro жағдайдағы өсімдіктерді суықпен өңдеу немесе акклиматизациялау. Іn vitro жемісті дақылдардың акклиматизациясы үшін негізінен тұрақты температураларды пайдаланады: 5^oC, 8 сағат жарықта немесе 4^oC, қараңғы жағдайда. Алайда акклиматизация үшін әр түрлі температураларды пайдалану (22^oC/-1^oC) сұйық азотта мұздатудан кейін меристемалардың тіршілік қабілетін айтарлықтай жоғарылатады [15].

    Іn vitro өркендерді ауыспалы температурада (8 сағат 22⁰C, жарық 10мкмоль м^-2 c^-1/16сағат -1⁰C, қараңғыда) клима камерада жүргізу ұсынылады. Әр түрлі дақылдар үшін акклиматизацияның оптимальды үзақтығы 1-4 апта аралығында болады. Қарақат үшін 1-2 апта жеткілікті, ал таңқурайға – 2-3 апта, алмаға – 3-4 апта қажет [16].

    Алманың асептикалық өркендерін ұзақ уақыт суықпен өңдеудің криосақтаудың әр түрлі екі әдісін ( витрификация, инкапсуляция-дегидратация ) пайдаланғанда, криосақталған меристемаларға әсері зерттелді. Іn vitro өркендерді ауыспалы температурада (8 сағат 22⁰C, жарық 10мкмоль м^-2 c^-1/16сағат -1⁰C, қараңғыда) 3 апта бойы өсіргенде, криосақталған меристемалардан өркендердің пайда болуы жоғары пайызды көрсетті (50-80%) [17].

    Суықты акклиматизация тропикалық өсімдіктер үшін тиімді болмаса да, басқа өсімдіктер үшін тиімділігі жоғары тәсіл болып табылады. Бұл тәсіл крахмалды гранулалар, липидті қоспалар, қанттардың мөлшері мен клеткалардың құрғақ салмағын көбейтеді.

    Суықты акклиматизацияны өсімдіктің төмен температураларға төзімділігінің табиғи механизмдерін іске қосу үшін пайдаланады.

    Акклиматизацияланған өсімдіктерден бөліп алынған меристемалардың тірі қалу деңгейі криосақтаудан кейін 2 есе артады [18].

    Мембрананың зақымдалуы мұздату кезінде пайда болатын ең алғашқы белгілердің бірі болып табылады. Мұздату-еріту циклі кезінде акклиматизацияланбаған меристемалардың протопласттарында лизис жүреді. Өйткені дегидратация кезінде клетка мембраналары майда везикулалар түзетін заттан айырылып қалады. Осы везикулалар еріту кезінде қайта қосылмағандықтан, протопласттарда лизис жүреді. Акклиматизацияланған протопласттарда осы заттар қайта қосылып, клетка лизиске ұшырамайды, өйткені клетка ерітуден кейін өзінің қалыпты су құрамын қалпына келтіреді [5].

    И.Чанг пен Б.Ридтің жұмыстарында суықты акклиматизация алмұрт өркендерін мұздату кезінде меристемалардың криосақталуына әсері туралы мәліметтер берілген. Пробиркалық өсімдіктерді шынықтырудың әр түрлі режимдері зерттелген:

 1) ауыспалы температура (22⁰C, жарық, -1⁰C, қараңғы);

2) тұрақты температура (4⁰C, 8 сағаттық фотопериод). Акклиматизацияланбаған өсімдіктермен салыстырғанда суықты аклиматизацияның екі түрі де меристемалардың криосақтаудан кейінгі өсімдіктердің регенерациясын жақсартты. Ауыспалы температуралы акклиматизация біршама жақсы нәтижелер берді [19].

    Осы авторлардың жұмыстарында [20] суықты акклиматизациядан кейінгі (22⁰C, 16 сағат қараңғы) таңқурай меристемаларының регенерациясы жақсарғаны туралы мәліметтер келтірілген. Акклиматизация ұзақтығы 1-ден 3 аптаға дейін артқанда, тірі қалған меристемалардың үлесі 63% -дан 90%-ға, ал өркендердің түзілуі 25% -дан 75%-ға дейін өсті.

    Сонымен қатар криопротекторлармен – химиялық қосылыстармен өсімдік материалын алдын-ала өңдеу қолданылады. Криопротекторлар қату нүктесін төмендетіп, клетканың ішіндегі суды байланыстыра отырып, клетканы механикалық зақымданудан және осмостық стрестен сақтайды [2, 21]. Криосақтауда криопротекторлардың екі негізгі типі қолданылады: клеткаға енетін және енбейтін криопротекторлар. Клеткаға енбейтін криопротекторлар ретінде, әдетте, қанттардың жоғары молярлы ерітінділері, полиэтиленгликоль, маннит, сорбит пайдаланылады. Бұлар осмостық әсер көрсетіп, клеткадағы суды байланыстырады. Клеткаға енетін криопротекторлар – глицерин мен диметилсульфоксид (ДМСО) клеткаға еніп, клетканың сыртында және ішінде біркелкі таралады. Осылайша, бұлар осмостық стресс көрсетпейді және клетка көлемін өзгертпейді. Клеткаға енетін криопротекторларды пайдаланағанда клетка компартменттерінің екеуінде де сусыздану бірдей жүреді. Клеткаға енетін криопротекторлар өте төмен температураның зақымдаушы әсерін азайту үшін қату нүктесін төмендетеді [11].

    Ең көп қолданылатын криопротекторлардың бірі – диметилсульфоксид (ДМСО). ДМСО – меристема секілді ірі, тығыз құрылымдар үшін маңызды клеткаға ену қабілетіне ие. Әдетте, меристемаларға арналған алдын-ала өсіру ортасына 5% диметилсульфоксид (ДМСО) қосылады. Диметилсульфоксид бүкіл апекс бойынша тиімді криоқорғауды қамтамасыз етеді [7,22]. Осы әдіс бойынша түймедақ меристемаларымен тәжірибе жасағанда, жақсы нәтижелер алынды. Түймедақтың меристемаларын алдын-ала диметилсульфоксид (ДМСО) қосылған ортада өсірді, ал криопротектор ретінде диметилсульфоксид, глицерин мен сахарозаның қоспасы қолданылды [1,5].

    Сонымен қатар, сахароза да табиғи криопротекторлық қасиеттерге ие. А.Сакаи мен И.Сугавара сахароза капуста клеткалары үшін ең жақсы криопротектор екенін анықтады [5]. Сахароза клеткаларда осмостық агент ретінде қызмет етіп, мембрананың қосқабаты мен ферменттерін тұрақтандырып, мембрананы қорғайды. Сахарозамен алдын-ала өңдеу осмос көмегімен клетка ішіндегі суды төмендетеді [14]. Тұқымдар мен өсімдіктердегі табиғи криопротекторлы механизмдер алдын-ала өңдеу үшін қажет химиялық заттардың жаңа көзі болады. Стресс әсеріне жауап ретінде ген экспрессиясының өзгеруі нәтижесінде жаңа белоктар түзіледі. Олардың ішінде абциз қышқылының әсеріне жауап беретін белоктар да бар. Бұл белоктар гидрофильді және термотұрақты болып табылады. Абциз қышқылы гидраттаушы агент ретінде әсер етеді, иондар концентрациясы жоғары болғанда цитоулылықтың алдын алу үшін артық иондарды байланыстырады.

    Қант қамысының 6 генотипінің инкапсулденген апекстерінің тірі қалуына алдын-ала өсіру кезінде сахароза концентрациясының әсері зерттелген. Cусыздандырылмаған бақылау апекстерінің тірі қалу деңгейі барлық жағдайда 100%-ға жақын болды. Екі генотипте (В34104 және В69566) сахарозаның ең төмен концентрациясында (0,3 М) өсірілген бақылау апекстері алты сағаттық сусыздану периодына шыдамады. Нәтижесінде, сұйық азотта мұздатудан кейін апикальды меристемалардың тірі қалу деңгейі сызықты түрде сахароза концентрациясы өскен сайын өсіп отырды және оптимальды сахароза концентрациясы 0,75М болды. Бұдан жоғары концентрациялар тірі қалу деңгейін мулдем төмендетіп жіберді [23]. Зерттелген қанттардың ішінен ең жақсы криоқорғаушы әсерді сахароза мен сорбит көрсетті [24].

    Жоғарыда айтып өткендей, клетканың ішінде мұз кристалдарының түзілуі клетка үшін өте зиянды. Осы процестің алдын алу мақсатымен клеткалардың дегидратациясын жүргізу керек. Донор өсімдікті өсіру ұзақтығын ұзарту криосақтаудан кейін апекстердің тіршілік қабілетінің өсуіне қолайлы әсер етеді. Бұл – ұзақ уақыт басқа ортаға көшірілмеген донор өсімдіктерден бөліп алынған апекстердегі судың аз болуымен байланысты болуы мүмкін. Осы гипотезаны тексеру үшін қосымша тәжірибелер жүргізілуде [21].

    Осылайша, клеткалар мен ұлпаларды дайындау криосақтаудағы ең маңызды саты болып табылады. Бұл саты өсімдік клеткалары мұздату процедурасына төзімді болу үшін және криопротекторлардың улы әсерін азайту мақсатымен жүргізіледі.

    Криосақтаудың екінші сатысы өсімдік ұлпаларын мұздату болып табылады. Мұздатудың әр түрлі үш тәсілі бар:

1) Меристемаларды бақылап немесе баяу мұздату — өсімдік ұлпаларын бағдарламалы мұздатқышта (фризер) -40⁰C-қа дейін біртіндеп мұздатуға негізделген. Өсімдіктер алдын-ала суықты акклиматизациядан өтеді. Бөліп алынған меристемаларды құрамында 5% диметилсульфоксид (ДМСО) бар ортаға 48 сағатқа отырғызады, сосын криопротектормен өңдейді. Өйткені баяу мұздатқан кезде мұздың түзілуі клетка сыртындағы кеңістікте пайда болады, клеткалар біршама бос су мөлшерінен арылады. Мұздату процесі температура өте баяу төмендейтін (0,1-ден 1⁰C-қа минутына) программалы мұздатқыш көмегімен іске асады. Осы -40⁰C температураға жеткен соң ұлпаларды сұйық азотқа (-196⁰C) ауыстырады. Еріту бір минут бойы 45⁰C температурада, сосын екі минут бойы 25⁰C температурада су моншасында жүргізіледі. Меристемаларды 1,2M сұйық Мурасиге-Скуг ортасымен екі рет шайып, қалпына келтіретін немесе регенерацияға арналған ортаға отырғызады [11]. Бұл кезде витрификация әдісіне қарағанда, баяу мұздатуда криопротектордағы ДМСО концентрациясы төмендеу болады.

    Осы әдісте клеткадан шыққан су клетка сыртындағы ортада қатады, ал бұл дегидратация мен протопласттың қысылуына әкеп соғады. Дегидратацияны болдырмау үшін өте жылдам мұздату әдісін қолданады [1].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Сурет 2. Өсімдік клеткалары мен ұлпаларын криосақтаудың сатылары.

 

2) Витрификация әдісі – криопротектор қолданылатын, жақында жасалған криоконсервация әдісі. Криопротектор суды байланыстыра отырып, оны аморфты-гель күйіне келтіріп, кристалды формаға, яғни мұзға айналуына жол бермейді. Витрификация әдісінде қолданылатын ерітінділер өте улы заттар болғандықтан, концентрациясы мөлшерден артып кетсе, фотосинтез тежеледі, мембрана бүтіндігі бұзылады, плазмолизге ұшырайды. Витрификация алдында өсімдіктерді, ең аз дегенде бір апта, суықты акклиматизациядан өткізеді. Витрификация әдісін пайдаланғанда өсімдік материалын жоғары концентрленген криопротекторлар ерітіндісімен өңдеп, сұйық азотқа жылдам енгізеді. Баяу мұздатқан үлгілерді еріткендей ерітіп алады. Бұл жағдайда криопротекторы бар ерітіндіден меристемаларды жылдам алу керек.

    Бұл әдісті көптеген өсімдік түрлерінің апикальды меристемаларын криосақтау үшін пайдаланады [16].

3) Инкапсуляция-дегидратация – өсімдік ұлпаларын мұздатуға дейін кептіргенде клетка ішіндегі мұз кристалдары түзілмейтін әдіс. Меристемаларды альгинатты шариктерге енгізеді, жоғары молярлы сахароза ерітіндісінде біртіндеп сусыздандырып, ылғалдың белгілі бір мөлшері қалғанша кептіреді. Кептірілген шариктерді сұйық азотқа енгізеді. Пробиркаларды дьюардан алып, бөлме температурасында ерітеді. Бұл әдісті қолданғанда тірі қалу деңгейі өте жоғары болады. Криосақталған үлгілердің қалпына келуі каллус түзілуінсіз тікелей жүреді [11, 25].

    In vitro алма өсімдіктерінің үстіңгі бүршіктеріне осы үш әдістің (екі сатылы мұздату, витрификация, инкапсуляция-дегидратация) қайсысы тиімді екені және бастапқы өсімдіктерді өңдеудің әсері зерттелді. Бастапқы өсімдіктерді 3 апта бойы 5⁰C температурада суықты акклиматизациямен өңдеу криосақтаудың кез келген әдістемесін пайдаланғанда, өсімдіктердің регенерациясын жоғарылатты. Апекстерді бөліп алмай тұрып бастапқы өсімдіктерді стандартты ортада ұстау уақыты арттырғанда, үстіңгі өркендердегі су мөлшері 85-88%-дан 63-66%-ға дейін азайды. Ең жақсы нәтиже инкапсуляция-дегидратация әдісін қолданғанда алынды, яғни криосақтаудан кейін 86%-ға дейін каллус түзілуінсіз регенерация жүрді [26].

    Тыныштық күйіндегі алма бүршіктерінен бөліп алынған (Malus domestica Borkh, Голден Делишес сорты) апестерді пайдаланғанда өсудің қалпына келуінің ең жоғары деңгейін витрификация (60%) мен инкапсуляция-дегидратацияға (60%) қарағанда, екі сатылы мұздату әдісі көрсетті. Керісінше тыныштық күйдегі бүршіктерді екі сатылы мұздату әдісін пайдаланып сұйық азотқа батырып, кейін олардан үстіңгі бүршіктерді (өркендерді) бөліп алғанда, олар қалпына келудің төмен деңгейін көрсетті (16%) [27]. Витрификация және инкапсуляция-дегидратация әдістерінің сатылары кіретін комбинирленген әдісті пайдаланған кездегі мәліметтер бар. In vitro өскен жалбыздың қолтық бүршіктерінен алынған меристемалар альгинатқа енгізіліп, витрификация әдісі көмегімен сәтті криосақталған. Түйін сегменттерінен бөліп алынған меристемаларды 3 апта бойы 4°C температурада акклиматизациялады, инкапсулдеп, 2М глицерин және 0,4 М сахароза қоспасымен өңдеді. Осы меристемаларды жоғары концентрленген PVS2 витрификациялық ерітіндіде 3 сағат 0°C-та дегидратациялап, сұйық азотқа енгізді. Қоректік ортаға көшірген соң бір аптадан кейін меристемалардан каллус түзілуінсіз өркендер пайда болды. Орташа есеппен алғанда, меристемалардың 90%-да өркендердің түзілуі бақыланды. Осы әдіс жалбыздың басқа түрлеріне де сәтті қолданылды [28].

 

1.1.5 Сұйық азотта сақтау

 

    Өсімдіктердің үлгілері сұйық азотта -196°C температурада шексіз ұзақ уақыт сақтала алады. Гладиолустың 7 сортының криосақталған тозаңдарының тіршілік қабілеті және фертильдігін зерттегенде, криогенді әдістерді осы түрдің гаплоидты гендерін сақтауға қолдануға болатынын көрсетті. Тозаңдарды 1 және 10 жыл бойы криогенді сақтағанда тіршілік қабілетінің (in vitro) төмендеуі байқалмады. Криогенді сақтаудан кейін тозаңдармен егістікте тозаңдандыру жүргізгенде, капсула мен тұқымдардың түзілуін индукциялады. Гладиолустың тозаңдарын ұзақ криогенді сақтау селекция эффективтігін жақсартуы мүмкін. Аталық тозаң селекциялық бағдарламалар үшін жеткілікті болады. Осы түр үшін “тозаң криобанкін” жасау генетикалық әртүрліліктің гаплоидты деңгейде сақталуына ықпал етеді [29].

 

1.1.6 Еріту, криопротектордан тазарту және өсімдіктердің регенерациясы

 

    Еріту және дақылдың өсуін қалпына келтіру – криосақтау процесінің ең маңызды және критикалық сатылары болып табылады. Клеткаларды баяу еріткенде, онда зақымдайтын мұздың қайта түзілуі мүмкін. Жылдам еріту судың кристаллизациясын болдырмайды. Витрификация әдісін пайдаланғанда, еріту үшін пробиркаларды жылы су моншасына батырады. Еріткен соң криопротекторды алып тастайды. Баяу мұздату әдісін пайдаланғанда да, өсімдік материалын осы жолмен ерітіп алады. Инкапсуляция-дегидратация әдісімен мұздатқанда өсімдік материалын криопробиркаларда бөлме температурасында ерітеді. Клеткалардағы физикалық өзгерістердің негізгі бөлігі мұздату және еріту кезінде жүреді. Әсіресе, жаңа ерітілген клеткалар зақымдануға бейім болады, сондықтан ерекше күтімді, бағып-қағуды қажет етеді. Бұған криопротекторлардан тазартып, клеткаларды 1,2М сұйық Мурасиге-Скуг ортасымен 2 рет шайған соң, қалпына келтіретін ортаға отырғызу жатады [12]. Мұздату – еріту циклінен кейінгі өсімдіктердің регенерациясы криосақтау тиімділігінің көрсеткіші болып табылады. Крисақталған меристемалардың тіршілік қабілетін жасыл түсі мен өркендердің регенерациясы бойынша бағалайды.

 

 

1.1.7 Криосақталған гермоплазманы бағалау әдістері

 

    Материал криосақтауда тұрғанда дақылдың күйін бағалау мүмкін емес. Бағалау еріткеннен кейін жүргізіледі және дақылды пайдалану үшін қажет. Дақылдарды жылдам бағалау үшін тіршілік қабілетін тексеретін тесттер қолданылады.

    Тірі қалудың сандық бағалауы өсу болып табылады. Стандартты цитологиялық әдістер көмегімен ұлпаларда жүретін қалпына келу процестері мен зақымдану дәрежесін анықтауға болады. Бұдан да нақты мәліметтерді электронды микроскопта ультрақұрылымын зерттегенде алуға болады.

    Клеткалардың гетерогендігін және мұздатуға дайындалғанын ескере отырып, қандай да бір субпопуляция үшін селективті артықшылықтардың көріну мүмкіндігін толығымен жоқ қылуға болмайды. Сондықтан генетикалық, физиологиялық және биохимиялық тексерулер қажет.

    Рекультивирлеу сатысында, кейде мутантты суыққа төзімді клеткалардың селекциясын болдырмау үшін клетка өсуін интенсификациялаудың белгілі тәсілдерін қолданады. Сұйық азотта сақтаудың тіршілік қабілеті мен клетка культураларының жаңаруына ешқандай кері әсері болмайтыны анықталды. Жаңарған дақылдар өсу жылдамдығы мен морфогенетикалық, биосинтетикалық және биотрансформациялаушы потенциалдарының толық сақталуымен сипатталады. Сұйық азотта сақтаудан кейін рекультивирленген клетка культуралары бастапқы культурамен ұқсас және биотехнологиялық қолдануға жарайды. Терең мұздату тозаңдардың тіршілік қабілеті мен фертильдігін сақтайды. Осылайша, клеткалардың, меристемалардың, тозаңдардың криобанкі тек in vitro өсірілетін штамдар емес, сонымен қатар сирек және жоғалып бара жатқан түрлердің генофондының сақталуын қамтамасыз етеді. Өсімдіктердің in vitro генофонды – ғылыми зерттеулер мен технология үшін бағалы зерттеу материалы болып табылады. Сондықтан криобанктерді жасау бойынша жұмыстар бүкіл әлемде жүргізіліп жатыр [2].

 

1.1.8 Алма гермоплазмасын криосақтау

    Жаңа сорттарды шығару үшін әр түрлі өсімдік материалдары қажет, алайда ол жеткіліксіз. Генетикалық әртүрлілік өсімдіктердің зиянкестерге, ауруларға және стресс факторларға төзімді жаңа өсімдік сорттарын алуға мүмкіндік береді. Генетикалық әртүрлілікті толықтыру көздері өсімдіктердің жабайы өсетін формалары мен туыcтығы жақын өсімдік түрлері болып табылады. Алайда жабайы өсетін өсімдіктердің территориясы жыл сайын азайып барады және көптеген түрлері мәңгілікке жоғалып бара жатыр [30].

    Қазақстан территориясы климаты әр түрлі және өсімдік әлеміне бай табиғи зоналарға бай. Бұлардың ішінде кейбір жеміс-жидекті өсімдіктер топтанған Іле және Жоңғар Алатауларының тау бөктерлері ерекше орын алады. Н.И.Вавиловтың зерттеулері бойынша Қазақстан территориясы мәдени өсімдіктердің, соның ішінде алманың да, шыққан орталықтарының бірі болып табылады [31,32]. Өкінішке орай күшейіп келе жатқан антропогенді әсердің нәтижесінде жабайы жемісті ормандар ареалы, олардың түрлік және формалық сан алуандығы күннен-күнге қысқарып, олардың жоғалып кету қаупі бар [33].

    Әлемде вегетативті көбейетін өсімдіктердің гермоплазмасы сақталатын ген банктерінің саны көп [34,35,36]. Европаның көптеген елдерінде (Бельгия, Франция, Ұлыбритания, Венгрия) алманың жабайы өсетін түрлері мен сорттарының егістік коллекциялары бар [37,38,39,40]. АҚШ-та өсімдіктердің Ұлттық Гермоплазма Жүйесі бар. Ол әлемнің барлық елдерімен гермоплазманы алмасады. Осындай жүйені құру әлемдік өсімдіктердің әр түрлілігін сенімді сақтауға мүмкіндік береді [31].

    Алайда, мәні зор болғанымен, генофондты табиғи өсу ортасы, помологиялық және ботаника бақтарында сақтаудың мынадай кемшіліктері бар: 1) тірі коллекцияларда геномның тек бір бөлігі байқалады; 2) популяцияларда өзін-өзі тозаңдандыру жүріп, туыс түрлермен гибридизация жүруі мүмкін, нәтижесінде ген эрозиясына немесе генотиптің арнайылығының жоғалуына әкеліп соғады; 3) егістіктегі үлкен аудандардағы коллекцияларды ұстау үшін айтарлықтай материалды шығын және күтімді қажет етеді; 4) табиғи ортадағы коллекциялар қауіпті аурулармен (әсіресе, вирустық) инфекцияланып, әр түрлі зиянкестердің қолайсыз әсерінен өліп қалуы мүмкін [8].

    ХХ ғасырдың 70-ші жылдары әлемдік практикада өсімдіктерді in vitro жағдайда өсіру, көбейту, ұлпаларды сақтаудың биотехнологиялық әдістері қолданыла бастады. Бұл әдістер қазірдің өзінде де вегетативті көбейетін өсімдіктерді сақтаудың болашақтағы ең тиімді жолдарының бірі болып табылады.

    Бұл әдістер ex situ өсімдік генофондын сақтау және гермоплазма банкін жасау стратегиясының маңызды құрамды бөлігі болып табылады.

    Осы әдістердің принципті негіздері негізгі екі бағытта жүзеге асады:

— қалыпты дамудың кезеңді жаңаруын қажет ететін дақылдар өсуін шектеу;

— биологиялық материалды сақтау мерзімі шексіз болатын, өте төмен       (-196^°С) температура жағдайында өсу процестерін толық тежеу;

    Криоконсервация – вегетативті көбейетін өсімдіктердің гермоплазмасын in vitro сақтаудың ең тиімді және сенімді әдісі болып табылады [25].

 

 

 

1.1.9 Генетикалық ресурстарды сақтау үшін криоконсервация әдістерін пайдалану

 

    Криосақтау – тірі клеткалар, ұлпалар мен мүшелерді анабиоз жағдайында шексіз ұзақ уақыт сақтау мақсатымен жүргізілетін күрделі, көп сатылы процесс. Бұл мәселені шешудің ең сенімді жолы – қазірге тек сұйық азот (-196⁰C) көмегімен қамтамасыз етіледі. Бұл тәсілде қоректік ортаны кезеңді ауыстыру болмайды, алайда криогенді құрал-жабдықтың болуын, сұйық азоттың үнемі әкелініп тұруы, жақсы жетілдірілген криоконсервация технологиясы болуын талап етеді.

    Негізгі қиындықтар өсімдік клеткаларының ерекшеліктерімен және in vitro популяциясымен байланысты. Мұндай популяциядағы клеткалар генетикалық гетерогенді және асинхронды болып келеді.

    Меристемалық культура болса, жағдай бұдан да күрделенеді, өйткені әр меристема мөлшері 100-ден 500мкм микроорган болып табылады. Меристемалардың өлшемдері кішкентай, үлкен вакуольдері жоқ.

    Құрамында суы көп объектілерді криосақтаудың басты қиындығы – мұздату-еріту кезінде 40⁰C пен судың қату температурасы аймағынан тіршілік қабілетін жоғалтпай өту. Дәл осы температуралық аймақта мұздатудың зақымдаушы факторларының екеуі де әсер етіп, клетка ішілік мембрананың деструкциясы, артынан клетканың өлуі жүреді.

    Криосақтаудың бірінші міндеті – клетка ішінде мұз кристалдарының түзілуінің алдын-алу. Ол үшін мұздату жылдамдығын төмендетіп, клетканы алдын-ала сусыздандырады. Кейде клеткаларды алдын-ала сусыздандырғанда, дегидратация әсерінен зақымдануы мүмкін.

    Криосақтаудың екінші міндеті – дегидратация әсерінен туған стресс әсерлерін азайту болып табылады. Стресс әсерін әлсірету үшін криопротектор қоспасының оптимальды құрамы, мұздатудың оптимальды жылдамдығын, осы процестің бүкіл программасын оптимизациялау қажет.

    Қазіргі кездегі криосақтаудың сатылары бастапқы өсімдіктерді алдын-ала өңдеу, олардан бөлініп алынған меритемеларды алдын-ала криопротекторы бар ортада культивирлеу, мұздату, криогенді сақтау, еріту және меристемаларды рекультивирлеу болып табылады. Криоконсервация нәтижесі – әр сатыдағы мұздату жағдайларын сақтауға байланысты.

    Бұрыннан белгілі криопротекторларды дұрыс сәйкестендіру және олардың жаңа түрлерін іздеу – өсімдіктердің меристема клеткаларын сәтті мұздатудың басты шарты. Қанттар мен цитокининдердің әр түрлі қатынастары мен сәйкестіктерін пайдаланып, сұйық азотта сақталған меристемаларды ерітіп, каллус түзілмей, регенерант өсімдіктер алуға болады.

    Криопротекторды таңдаумен қатар, дәл осы объектілер үшін, мұздатудың оптимальды бағдарламасын табу өте маңызды. Кей жағдайда екі сатылы мұздатуды пайдаланады:

1) тұрақты жылдамдықпен температураны біртіндеп -35-70⁰C-қа төмендету,

2) тікелей сұйық азотқа батыру.

    Басқа жағдайларда үш сатылы немесе көп сатылы мұздату сәтті шығады.

    Жоғарыда айтылып кеткен мұздату жағдайларымен қоса, уақыт, дегидратация дәрежесі, криопротекторлардың концентрациясы мен қоспалары да тәжірибенің дұрыс шығуында маңызды орын алады.

    Қазіргі кезде әр түрлі өсімдік түрлерін криоконсервациялау әдістері ізделіп, жасалуда. Культивирленетін өсімдік клеткалары мен ұлпаларын криоконсервациялау, өсімдіктер генофондын шексіз ұзақ уақыт сақтаудың жалғыз мүмкіндігі – криобанктің технологиялық негізі бола алады [41].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.2 Материалдар мен әдістер

 

    Зерттеу обьектілері ретінде алманың (Malus domestica Bork.) Восход, Грушовка Верненская, Голден Делишес, Рояль Ред Делишес сорттары мен ҚР Іле Алатауы Ұлттық паркінен жиналған және ҚР Помологиялық бағы коллекциясынан алынған алманың жабайы TM-6 (Malus sieversii ( Ledeb.) M.Roem) формасы алынды.

 

1.2.1 In vitro жағдайына енгізу

 

    Сәтті криосақтау үшін асептикалық таза өсімдік материалы жеткілікті мөлшерде болуы керек. Сондықтан алғашқы сатыда бірінші эксплантты таңдау, оны залалсыздандырушы агенттермен өңдеу, эксплантты өсіруге оптимальды жағдайларды жасау маңызды орын алады.

    In vitro жағдайына енгізгенде бір жылдық сүректенген өсімдіктерден қыс кезінде бөліп алып, лабораториялық жағдайда өскен жасыл өркендер немесе көктемде егістік жағдайда өскен ағаштардан бөліп алынған жасыл өркендер қолданылады. Кесіп алынған өркендерді сабынды сумен және ағынды құбыр суымен (10-15 мин) жуып, құрамында хлор бар ерітіндіде 5 минут өңдейді. Өңдеп болған соң қоректік ортаға отырғызады. 3-4 аптадан кейін өскен өркендерді кесіп, қайтадан жуып, ламинар-боксында залалсыздандырушы агенттермен 3-4 минут 0,1% сулема ерітіндісімен және 3-5 минут ағартқыш ерітіндісінде өңдейді.

    Залалсыздандырғаннан кейін өлшемі 0,5-2,0 см өркен апекстерін микроклональды көбейту үшін қоректік орталарға енгізеді. Бұл кезде жидекті дақылдар үшін агар қосылған ортаны, ал алма өсімдіктері үшін сұйық ортаны пайдаланаған дұрыс. Өйткені алма өркендері фенолды қосылыстар бөліп, өзінің қалемшелерінің өлуіне ықпал етеді. Сондықтан некроздың алдын алу үшін алма өркендерін күн сайын жаңа ортаға отырғызу керек. 1,5-3 аптадан кейін асептикалық алма өркендерін агар қосылған ортаға ауыстырады.

    Өркендерді in vitro жағдайда 20г/л сахароза, 0,5-1,0 мг / л 6-бензила-минопурин (БАП), 0,1-0,5 мг/л индолилмай қышқылы (ИМҚ), 7г/л агар (Sigma), pH-5,7 Мурасиге-Скуг ортасында көбейтеді.

 

1.2.2 Эксланттарды Viss ортаға тексеру

 

    Өсімдіктерді микроклональды көбейтуді бастамас бұрын алдымен in vitro жағдайға енгізілген материалда микрофлораның жоқ екеніне көз жеткізу қажет. Экспланттардың вируспен, бактериямен зақымдалғанын тексеру үшін арнайы Viss орта қолданылады. Микроөркендерді жаңа қоректік ортаға отырғызу кезінде өркендердің астыңғы жағынан 0,3-0,5 см кесіп алып, Viss ортасы бар Петри табақшаларына отырғызады. Осы экспланттарды 25⁰С температурада 1-2 апта бойы өсіреді. Экспланттарда микрофлора болмаса, Viss орта мөлдір, таза болып қалады. Егер Viss ортаның түсі өзгеріп, колониянар өссе, бұл экспланттардың зақымдалғанын көрсетеді. Ары қарай өсімдіктерді микроклональды көбейтуді асептикалық таза өсімдіктермен жалғастырады.

 

1.2.3 In vitro өсімдіктерді микроклональды көбейту

 

    In vitro өсімдіктерді микроклональды көбейту үшін әр дақылға арнайы

таңдап алынған қоректік орталар пайдаланылады. Қоректік ортаға қойылатын негізгі талап көбеюдің жоғары коэффициентін қамтамасыз етуі болып табылады. Сонымен қатар қоректік ортаның құрамы мен өсу реттегіштерінің концентрациясы да маңызды орын алады. Өсімдіктерді in vitro жағдайда көбінесе Мурасиге-Скуг қоректік ортасында өсіреді (23-25⁰C температурада, жарық 25 мкмол м^-2с^-1, 16 сағаттық фотопериод). Әр 3-4 аптадан кейін in vitro жағдайындағы өсімдіктер жаңа қоректік ортаға отырғызылады.

 

1.2.4 Апикальды меристемаларды бөліп алу

 

    Өлшемі 0,8-1,0 мм апекстерді 3-4 апта бойы өсірілетін асептикалық өсімдіктерден бөліп алады. Өркендердің апекстері меристемадан (4-5 клеткалар қабатынан) және 2-3 бастапқы жапырақтардан тұрады.

    Апикальды меристемаларды ламинар-боксында МБС-9 бинокулярлы микроскопының көмегімен және меристеманы бөлуге арналған арнайы құралдармен асептикалық жағдайда бөліп алады. Өсімдік ұлпалары кеуіп кетпес үшін апикальды меристемаларды залалсыздандырылған сумен ылғалдандырған қағаз үстінде бөледі.

    Апикальды меристемаларды минералды тұздар мен витаминдері бар Мурасиге-Скуг ортасында өсіреді. Сонымен қатар, бұл ортаға 30% аммоний нитраты мен калий нитраты, 20г сахароза, 0,5мг 6-бензиламинопурин, 0,05мг индолилмай қышқылы, 3,5г агар, 1,45г джелрайт (Sigma) қосылады (pH-5,7).

 

1.2.5 Апикальды меристемаларды криосақтау

 

    Апикальды меристемаларды криосақтау үшін витрификация әдісінің екі түрі қолданылады. Бұл екі әдістің бір-бірінен айырмашылығы апикальды меристемаларды алдын ала өсіру ортасының құрамы және оларды өңдеу тәсілдері әр түрлі болады.

    Бірінші әдістемеге сәйкес, акклиматизацияланған өркендерден бөліп алынған меристемаларды екі күн бойы 5% диметисульфоксид (ДМСО) қосылған Мурасиге-Скуг қоректік ортасында суықты акклиматизация жағдайында өсіреді. 1% бұқаның сарысу альбумині (БСА) ерітіндісінде меристемаларды өңдеген соң, PVS2 криопротекторы (30% глицерин, 15% этиленгликоль, 15% диметилсульфоксид (ДМСО)) бар мұздағы криопробиркалардағы меристемаларды 0,4М сахарозалы Мурасиге-Скуг сұйық ортасында ұстайды. 20 минуттан соң криопробиркаларды сұйық азотқа батырады. Үлгілерді температурасы 45⁰C су моншасында 1 минут бойы, сосын 22⁰C температурадағы су моншасында 2 минут бойы ерітеді. Меристемаларды 2 рет 1,2М сахарозалы сұйық Мурасиге-Скуг ортасымен жуып, регенерация үшін Мурасиге-Скуг қоректік ортасына отырғызады.

    0,3М сахарозамен витрификация әдісі. Бұл әдістеме бойынша меристемаларды 2 күн бойы 0,3М сахарозалы Мурасиге-Скуг ортасында өсіреді. PVS2 криопротекторымен 80 минут 0⁰C температурада криопробиркалардағы меристемаларды өңдеген соң сұйық азотқа батырады. Үлгілерді бірінші әдістемеде еріткендей ерітіп алады.

    Бұл әдіспен меристемаларды криосақтау үшін алдын ала мына материалдар мен қоректік орталар дайындалады:

1. Меристемаларды бөліп алу үшін акклиматизацияланған пробиркалық өсімдіктер (-1⁰С, 16 сағат/+22⁰С, 8 сағат 1-4 апта) акклиматизацияланады.
2. Меристемаларды алдын-ала өсіретін ортасы бар Петри табақшалары (0,3М сахарозамен Мурасиге-Скуг ортасы).
3. Криопротекторды дайындау үшін 0,4М сахарозалы сұйық Мурасиге-Скуг ортасы (pH 5,8).
4. Меристемаларды шаюға арналған 1,2М сахарозалы сұйық Мурасиге-Скуг ортасы.
5. Меристемаларды бөліп алу үшін залалсыздандырылған ылғалды қағаз.
6. Меристемаларды кептіруге арналған фильтр қағаздары.
7. Криопротекторды залалсыздандыру үшін залалсыздандырылған фильтр, стакан, Петри табақшалары.
8. Меристемаларға арналған қалпына келтіретін қоректік орта.
9. Мұз үстінде қатырылған штатив.
10. 10. Криопротекторды мұздату үшін мұз.
11. Шприцтер, құрал-жабдықтар.

1). Меристемаларды бөліп алу және оларды алдын-ала өсіру. Бөлініп алынған меристемалар отырғызылған Петри табақшаларын 2 тәулікке акклиматизацияға клима камераға қою (1⁰C 16сағат/22⁰С 8 сағат).

 

                                                                                                    Кесте 1

  PVS2 криопротекторының құрамы

 

PVS2 криопротекторының компоненттері	25 мл-ге
Глицерин 30% (тығыздығы 1,2613)	7, 5 г
Этиленгликоль 15% (тығыздығы 1,1088)	3,4 мл
ДМСО 15% (тығыздығы 1,1)	3, 4 мл

2). Тәжірибенің екінші күні 50 мл криопротектор (PVS2) дайындалады. Тек қолғаппен жұмыс жасау керек. ДМСО-улы зат!

    Криопротектор компонеттерін цилиндрде араластырады. Цилиндрде 7,5г глицеринді өлшеп, автоматты пипетка (дозатор) көмегіме этиленгликоль мен ДМСО-ны қосады. Көлемін 0,4М сахарозалы сұйық Мурасиге-Скуг ортасымен 25 мл-ге жеткізеді. Цилиндрді парафильммен жақсылап жауып ерітіндіні байқап араластырады. Криопротекторды залалсыздандырылған фильтрден өткізіп, мұздатқышқа 4⁰С температураға 30 минутқа қояды. PVS2 криопротекторын сақтауға болмайды, тек жаңадан дайындалғанын пайдалану керек. Криопротектор дайындалған ыдыс, қолғап, фильтрді құбыр суы ағынында бірден шайып тастау керек. Криопротекторды дайындап жатқанда мүмкіндігінше басқа заттарды ұстамаған жөн.

    Мұздату сатылары:

3). PVS2 криопротекторы ерітіндісін Петри табақшасына құйып, мұзға қояды. Меристемалар салынған криопробиркаларды мұзды штативке ауыстырады да, оларға PVS2-ні 1 мл-ден асыра құяды. Дәл уақытын белгілеу керек. PVS2 криопротекторында өңдеу мерзімі 80 минут 0⁰С-та жүргізіледі. 40 минуттан соң залалсыздандырылған пипеткамен меристемаларға ауа жіберіп, PVS2 көлемін 1 мл-ге дейін жеткізеді (Сурет 3).

 

 

 

Сурет 3. Бөліп алынған алма меристемаларын PVS2 криопротекторында өңдеу.

 

4). Кіші дьюарға сұйық азот құйылады.

5). Алма меристемалары 80 минут криопротектормен өңделген соң, криопробиркаларды жақсылап жауып, ұстағыштарға орналастырып, сұйық азотқа енгізеді (Сурет 4).

 

 

 

Сурет 4. Алма меристемалары енгізілген криопробиркаларды сұйық азотқа батыру.

 

6) 0,3М сахарозамен витрификация әдісі арқылы криосақталған алма меристемаларын алдымен 1минут +45⁰C-та, кейін 1минут +25⁰C-тағы су моншасында ерітіп алады (Сурет 5).

 

 

 

Сурет 5. Криосақталған алма меристемаларын ерітіп алу сатысы.

 

7). Пробиркалардағы алма меристемаларын 1,2М сахарозалы сұйық Мурасиге-Скуг ортасымен 2 рет шайып, фильтр қағазына ауыстырған соң, қалпына келтіруші немесе регенерацияға арналған қоректік ортаға отырғызады.

8). 6 апта бойы апта сайын тірі қалған меристемалар санын арнайы кестеге жазып отырады [16].

    Осы берілген әдістеме бойынша меристемеларды бөліп алу мен культивирлеу тіршілік қабілетін сақтауға мүмкіндік беріп, экспланттардың 60-80% регенерациясын жүргізуге болады.

1.3 Нәтижелер мен оларды талқылау

 

1.3.1 Пробиркалық өсімдіктердің апикальды меристемаларын бөліп алу және өсіру әдістемелерін жетілдіру

 

       Криосақтау бойынша тәжірибелер үшін Восход, Грушовка Верненская, Голден Делишес, Рояль Ред Делишес сорттары және алманың жабайы TM-6 (Malus sieversii ( Ledeb.) M.Roem) формасы пробиркалық өсімдіктерінен бөліп алынған өркендердің төбе бүршіктерін пайдаланды. Өркендердің төбе бүршігі ұзындығы 1,0-1,2мм, ені 0,8-1,0мм болатын апикальды меристема мен 2-3 бастапқы жапырақтан тұрады. Апикальды меристема – бұл биіктігі 0,1мм, ені 0,25мм активті бөлінетін клеткалар конусы (Cурет 6). Апикальды меристеманы ешқандай зақымсыз бөліп алып, өсуін индукциялау өте қиын. Осыған байланысты меристеманы 1-3 жапырақтарымен қоса бөліп алады.

    Алманың меристемаларын асептикалық жағдайда ламинар-боксында МБС – 9 микроскопын пайдаланып бөліп алады. Өсімдік ұлпасы кеуіп кетпеу үшін апекстерді бөліп алуды залалсыздандырылған дистильденген сумен ылғалдандырылған қағаз үстінде жүргізеді. Бөліп алынған меристемаларды 30% аммоний нитраты мен калий нитраты, 20г/л сахароза, 0,5мг/л 6-бензиламинопурин, 0,05 мг/л индолилмай қышқылы, 3,5г/л агар, 1,45г/л джелрайт (Sigma), pH-5,7 Мурасиге-Скуг ортасына отырғызады.

Сурет 6. Алманың төбе бүршігінің көлденең кесіндісі.

Белгілеу: M – апикальды меристема; Л – жапырақ.

 

 

1.3.2 Алма меристемаларын криосақтау әдісінің оптимизациясы

 

    Aлма меристемаларын криосақтау үшін, Б.Ридтің модификацияланған витрификация әдісін қолданғанда сұйық азотпен әсер еткен соң, тіршілік қабілеті сақталған меристемалар қалмады. Алма меристемалары регенерациялық қабілетін сақтай алмады: еріткен соң екі-үш күн бойы қоректік орталарда өсіріліп жатқан ұлпалардың некрозы жүреді. Осыған байланысты, А.Сакаи ұсынған витрификация әдісін пайдаланған қолайлы.

    2 – кестеде витрификация әдісімен алма меристемаларын криосақтау тәжірибелері жүргізілгеннен кейін алынған нәтижелер берілген. Қалпына келтіретін ортада бақылау нұсқасында Грушовка Верненская сорты меристемаларының тіршілік қабілеті жоғары болды (84,6%). PVS2 криопротекторымен өңдеген соң тірі қалған меристемалар 60%-ды құрайды. Меристемаларды сұйық азотқа батырып, қайта ерітіп алғанда тіршілік қабілеті 54,5% болды.

                                                                                                       Кесте 2

Грушовка Верненская сортының меристемаларын витрификация әдісімен криосақтағаннан кейінгі регенерациясы

 

	Нұсқалар	Мерис- тема саны	Меристемадан шыққан өсімдіктер регенерациясы
			саны		%
1	Бөліп алынған меристемалардың бақылау нұсқасы	13	11	84,6
2	Криопротетормен 80 минут, 00С-та өңделген бақылау нұсқасы (ДМСО+глицерин+этиленгликоль)	10	6	60,0
3	Сұйық азотқа батырып, қайта ерітіп алған нұсқа	22	12	54,5

 

    Алынған нәтижелерді саралап, алма меристемаларын А.Сакаи ұсынған витрификация әдісімен криосақтағанда, тіршілік қабілеті жоғары болды және төмен температураның жемісті өсімдіктерге әсерінің физиологиялық заңдылықтарын зерттеуді жүргізуге болады.

 

• Алма гермоплазмасының коллекциясын жасау

 

    Криосақтау әдістерінің артықшылығы – үлгілердің тіршілік қабілеті мен генетикалық тұрақтылығының ұзақ уақыт өзгермей сақталу мүмкіндігі. Қажет жағдайда кез келген уақытта криосақталған ұлпалардан бүтін организм регенерациялап алуға болады.

    Су моншасында ерітіп алынған алма меристемалары қалпына келтіретін қоректік ортаға отырғызылды (Сурет 7).

 

 

                                    А)                                       Б)

Сурет 7. Алма меристемаларын регенерациялау үшін қоректік ортаға отырғызу: А). Восход сорты, Б). Грушовка Верненская сорты

 

    Қалпына келтіретін қоректік ортаға отырғызылған меристемалардан мынадай өркендер регенерацияланды (Сурет 8).

 

 

                                     А)                                    Б)

Сурет 8. 0,3М сахарозамен витрификация әдісі арқылы криосақталған алма меристемаларының регенерациясы: А). Грушовка Верненская сорты, Б). Голден Делишес сорты

 

    Меристемалардың тіршілік қабілетін 6 апта бойы мына көрсеткіштер бойынша бағалайды: жасыл түсі мен өркендердің регенерациясы. Осы регенерацияланған алма меристемаларынан мынадай өркендер дамиды (Сурет 9).

 

 

Сурет 9. Восход сортының криосақталған меристемаларынан өсіп шыққан өркендер.

 

    Дамыған өркендерді табиғи өсу жағдайларына ауыстырып, бүтін алма ағашын өсіруге болады.

    Сұйық азотта сақтау ұзақтығы бойынша тәжірибелер 0,3М сахарозамен витрификация әдісімен жүргізілді. In vitro жағдайда ауыспалы температурада (22⁰ С, 8 сағат, 10µE·м^-2·с^-1/-1⁰ С, 16 сағат қараңғы) 3 апта акклиматизацияланған өсімдіктерден апикальды меристемалар (0,8-1,0 мм) бөлініп алынды. PVS2 криопротекторымен өңделген меристемалар өте төмен температурада 20 минут, 6 ай, 1жыл бойы сақталды.

    Нәтижесінде мына мәліметтер алынды: өте төмен температурада өркендердің апекстерін 20 минут бойы сақтағанда, сұйық азотта ұзақ уақыт сақтағаннан айрықша ерекшеліктері байқалмады. Ерітіп алу процестерінен кейін, 20 минут және ұзақ уақыт 6 ай, 1 жыл сұйық азотта сақталған алманың апикальды меристемалары қоректік ортада тез дамып, 2-3 аптадан кейін жетілген өркендер түзілді. Восход сортында сұйық азотта 20 минут сақтағаннан кейін меристемалардың -79,6%, 6 ай сақтағаннан кейін -73,6%, 1 жылдан соң -76,7%; Грушовка Верненская сортында: 20 минут -71,1%, 6 ай -71,2%, 1 жыл -69,8%; Рояль Ред Делишес сортында: 20 минут — 66,7%, 6 ай -63,4%, 1 жыл -58,2%; Голден Делишес сортында: 20 мин -72,3%, 6 ай -69,4%, 1 жыл — 71,7%; алманың жабайы формасы ТМ-6: 20 мин -79,1%, 6 ай -74,3%, 1 жыл -81,8% регенерацияланды (Сурет 10).

    Алынған нәтижелер мен әдебиеттік мәліметтерді негізге алып, сұйық азотта сақтау ұзақтығы алма меристемаларының регенерация қабілетіне әсер етпейтіндігі анықталды. Статистикалық анализ бойынша алманың зерттелген сорттары мен формаларында гермоплазманың қысқа және ұзақ мерзімге сақталған нұсқалары арасында айырмашылық байқалмады.

 

 

 

Сурет 10. Алма меристемаларын сұйық азотта 20 минут, 6 ай және 1 жыл сақтағаннан кейінгі регенерация деңгейі. Белгілеу: 1 – жабайы форма ТМ-6, 2 – Восход, 3 – Голден Делишес, 4 – Грушовка Верненская, 5 – Рояль Ред Делишес

 

    Алма меристемаларының сұйық азотта ұзақ уақыт сақталуымен қатар, мұнда генотип бойынша орташа регенерациялану қабілеті де зерттелді. Зерттелген генотиптер бойынша регенерация жиілігі алманың жабайы ТМ-6 формасында (78,4%) ең жоғары деңгейді, ал ең төменгісін Рояль Ред Делишес сорты (62,7%) көрсетті (Сурет 11).

 

 

 

Сурет 11. Алма генотиптерінің орташа регенерациялану қабілеті.

Белгілеу: 1 – жабайы форма ТМ-6, 2 – Восход, 3 – Голден Делишес, 4 – Грушовка Верненская, 5 – Рояль Ред Делишес

    Вегетативті жолмен көбейетін жемісті және жидекті дақылдардың ұлпаларын терең мұздату үшін көбінесе асептикалық өсімдіктерден бөліп алынған апикальды меристемалар мен тыныштық күйдегі бүршіктер қолданылады. Осылайша криосақталған ұлпалар сұйық азот құйылған дьюар ыдыстарында ұзақ уақыт сақталады (Сурет 12).

 

 

 

Сурет 12. Сұйық азот құйылған дьюар ыдысы (10 л).

 

    Сонымен қатар, коллекцияны сұйық азотта сақтау әр түрлі вирустық, бактериялық инфекциялармен зақымдану қаупі мен қоршаған ортаның қолайсыз факторлары әсерінен өліп қалудан сақтайды. Кішкентай лабораториялық ауданда гермоплазма үлгілерінің әжептеуір мөлшері, саны сақталуы мүмкін. Криосақтау генофондты сақтаудың тек сенімді емес, сонымен қатар экономикалық тиімді әдісі болып табылады. Өйткені коллекцияны егістік дала жағдайында ұстау шығындары азаяды.

    Осы жасалынып жатқан криоколлекция табиғи және мәдени мұраның сақталуына қызмет етеді және әр түрлі елдердің ботаника мекемелері арасында алмасу үшін қолданылады. Бұл биологиялық зерттеулердің кең спектрін жүргізуге, оның ішінде, ең алдымен, тек алманы ғана емес бірқатар маңызды өсімдіктердің мәдени түрлері мен сирек кездесетін және жоғалып бара жатқан түрлерін, дәрілік өсімдіктерді сақтаудың сенімді әдістемелерін жасауға негіз болады.

 

 

 

 

 

ҚОРЫТЫНДЫ

 

1. Негізгі биотехнологиялық әдістер игерілді: өсімдіктерді микроклональды көбейту; алманың апикальды меристемаларын бөліп алу; өсімдік меристемаларын криосақтаудың витрификациялық әдісі.
2. Жеміс-жидекті дақылдардың ұлпаларын криосақтау туралы ғылыми әдебиеттер жиналып, талданды.
3. Алма меристемалары үшін А.Сакаи ұсынған витрификация әдісі ең қолайлы.
4. Алма меристемаларының тіршілік қабілетіне сұйық азотта сақтау ұзақтығының әсері зерттелді. Сұйық азотта сақтау ұзақтығы алма меристемаларының регенерация қабілетіне әсер етпейтіндігі анықталды.
5. Генотиптер бойынша регенерациялану қабілеті алманың жабайы ТМ-6 формасында (78,4%) ең жоғары деңгейді, ал ең төменгісін Рояль Ред Делишес сорты (62,7%) көрсетті.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ

 

1. Стрибуль Т.Ф. Обзор методов криоконсервирования культуры растительных клеток// Проблемы криобиологии. – 2000 . — № 1. -С. 52-68.
2. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений. -Алматы,1996. -С. 257-263.
3. Попов А.С. Криогенное хранение культуры клеток растений//Культура клеток растений. -Москва, -1981. -C.150-165.
4. Туманов И.И., Бутенко Р.Г., Оголевец И.В. Изучение морозостойкости на клеточном уровне// Физиология растении. -1978. -C.749-752.
5. 5. Sakai A., Sugavara Y.// Plant and cell physiology. -1973. P.1201.
6. Finkle B., Ulrich J. –In: Abstr. 4^th Intern. Congr. Plant Tissue and Cell Cultures. Calgary (Can), -1978. P. 103.
7. 7. Турдиев Т.Т., Бижанова А.Б., Кушнаренко С.В., Ковальчук И. Ю. Влияние дегидратации на криосохранения меристем черной смородины// Сборник посвященный памяти Байтынова М.С. -Алматы, -C.142-146.
8. 8. Рахимбаев И.Р., Ковальчук И.Ю., Кушнаренко С.В. Биотехнология криосохранения гермоплазмы плодовых растений// Сохранение и устойчивое использование растительных ресурсов. Мат. межд. симп. г.Бишкек, 26-29 авг. -2003,Бишкек. -2003. -С. 234-238.
9. Холина А.Б., Воронкова Н.М. Сохранение генофонда дальневосточных растений методом криоконсервации семян// Растительные ресурсы. -2001. -T. 37. Выпуск 2. -C. 39-40.
10. Попов А.С. Некоторые механизмы криоповреждений клеток растений in vitro и особенности их криосохранения// Физиология растений. М., -1983. -Т. 40. -№3. -С. 485-494,
11. Reed.B. Cryobiology 34. Corvallis-1997.P. 240-243.
12. Климов С.В. Пути адаптации растении к низким температурам //Успехи современной биологии. Наука. -2001.том 121. -№1. -C.3-17.
13. Хочачка П., Самесо Жд. Стратегия биохимической адаптации. -Москва, Мир 1988г.
14. 14. Reed B.M., Luo J. Abscisic acid-responsive protein, bovine serum albumin, and praline pretreatment improve recovery of in vitro currant shoot-tip. V 34, P.240-250.
15. Kushnarenko S.V., Romadanova N.V., Reed B.M. Cold acclimation improves regrowth of cryopreserved apple shoot tips // CryoLetters. – 2009 . – V . 30. – No. 1. – P. 47-54.
16. Кушнаренко С.В., Ковальчук И.Ю., Ромаданова Н.В., Турдиев Т.Т., Рид Б.М., Рахимбаев И.Р. Криосохранение апикальных меристем плодовых и ягодных культур. Методические рекомендации. – Алматы, — 2008. – C.11-35
17. Ромаданова Н.В., Кушнаренко С.В. Влияние холодовой обработки побегов in vitro на криосохранение апикальных меристем яблони // Биотехнология. Теория и практика. – 2007, – № 3. – С. 39-44.
18. Reed B.M. et al. Cryopreservation and long-term storage of pear germplasm // In vitro cell Dev. Biol. — Plant. — 1998. V.34. — P. 256-260.
19. 19. Chang Y., Reed B. Extented alternating-temperatur cold acclimftion and culture duration improvepear shoot cryopreservation // Cryobiology 40. — P. 311-322.
20. 20. Chang Y., Reed B. Extented cold acclimation and recovery medium alteration improve regrowth of Rubus shoot tips following cryopreservation // Cryoletters 20. — P. 371-374.
21. 2 Reed B.M. The basics of in vitro storage and cryopreservation // National Clonal Germplasm Repository, Corvallis, O.R. USA.-2001. — P. 12-25.
22. 22. Gonzales Arnao M.T., Engelmann P., Huet C., Urra C. Cryopreservation of encapsulated apices of sugarcane: effect of freezing procedure and histology // CryoLetters – 1993. – V.14. — P. 303-308.
23. Bagniol S., Engelmann F., Michaux – ferriere N. Histo-citological study of apices from in vitro plantlets of date palm (Phoenix dactylifera L.) during a cryopreservation process // CryoLetters. – 1992.- V. 13.- P. 305-368.
24. Paul H., Daigny G., Sangwan-Norreel B.S. Cryopreservation of apple (Malus x domestica Borkh.) shoot tips following encapsulation-dehydration or encapsulation-virtification // Plant Cell Reports. – 2000. – V.19. – P. 768-774.
25. Reed B. M. The basics of in vitro storage and cryopreservation // National Clonal Germplasm Repository, Corvallis, O.R. USA. -2002. -P.34-36.
26. Wu Y., Engelmann F., Zhao Y., Zhou M., Zhang D., Chen S. Cryopreservation of apple shoot tips: importance of cryopreservation technique and of conditioning of donor plant // CryoLetters. – 1999. – V.20. – P. 121-130.
27. Wu Y., Zhao Y., Engelmann F., Zhou M., Zhang D., and Chen S. Cryopreservation of apple dormant buds and shoot tips // CryoLetters 22. -2001.- P. 372-380.
28. Hirai D., Sakai A. Cryopreservation of in vitro-grown axillary shoot-tips meristems of mint (Mentha Spicata L.) by encapsulation-vitrification // Plant Cell Reports. -1999.- V. 19.-P. 150-155.
29. Rajasekharan P.E., Rao T.M., Janakiram T., Ganeshan S. Freeze preservation of gladiolus pollen // Euphytica. – 1994.- V. 80.- P. 105-109.
30. 3 Seeds for Our Future. The U.S. National Plant Germplasm System // United States Department of Agriculture. Agricultural Research Service. – 1996. – Р. 20.
31. Вавилов Н.И. Дикие родичи плодовых деревьев азиатской части СССР // Тр.по прикл. ботанике, генетике и селекции. – Л., -1931. – Т. 16, вып. 3.
32. 32. Вавилов Н.И. Избранные труды. Генетика и селекция. М. — 1966
33. Джангалиев А.Д., Салова Т.Н., Туреханова Р.М. Дикие плодовые растения Казахстана. – Алматы,2001. – 135 с.

34.Fischer M., Geibel M., Fischer C., Hohlfeld B., Richter K. Sortenempfehlungen für Kern und Steinobstsorten auf der Grundlage von Resistenzprüfungen in der Genbank obst Dresden-Pillnitz // Gesunde Pflanz. – 1998. – 50, -№ 6. — P. 165-171.

35. 35. Pannović S., Jašić K., Mratinić E., Nikolić M., Ogašanović D., Ognianov V., Stanisavljević M., Radoš L., Radulović M. Banka gena vočka jugoslavije Jenetičeski zesursi i mogučnost konzervacije germplazme vočaka // Ref 10 kongr vočara Jugosl., čačk, J nov. 1996 Jugosloven vocar. – 1996. — 30, -№ 1-2. — P. 39-50.
36. Kask Kaju. Cultural diversity and germplasm maintenance of tree fruit and small fruit crops of Estonian origin // Bot. Lithuam. – 1999. – V.2. – P. 135-138.
37. Lateur M. Review of the present status of the Malus collections in Belgium // Case H.J. editor. European Malus Germplasm. Proceeding of a workshop. -Р. 21-24.
38. Laurens F. Review of French collections // Case H.J. editor. European Malus Germplasm. Proceeding of a workshop, 21-24 June 1995, Wye College, University of London. International Plant Genetic Resources Institute, Rome. – 1996. — P. 26-28.
39. Szabó T., Inántsy F., Apostol J. Malus germplasm collection status and policy in Hungary // Case H.J. editor. European Malus Germplasm. Proceeding of a workshop, 21-24 June 1995, Wye College, University of London. International Plant Genetic Resources Institute, Rome. – 1996. — P. 33-34.

40.Case H. Status and police of the UK national fruit collections // Case H.J. editor. European Malus Germplasm. Proceeding of a workshop, 21-24 June 1995, Wye College, University of London. International Plant Genetic Resources Institute, Rome. – 1996. — P. 46-47.

41. Рыжкова Н.С. Стабильность растений земляники садовой (Fragaria ananassa Duch.) после длительного хранения in vitro. http://www.nauka – shop.com/mod/shop