Важные новости

В Иране будут перевоспитывать женщин, снимающих хиджабы

Мировые цены на нефть продолжают падать

Нурила Асанкызы стала первой в истории казахстанской…

Казахстанские спортсмены продолжают радовать победами на международной…

Москву массово атаковали беспилотники

Число беженцев в мире перевалило за 123…

Елена Рыбакина обыграла первую ракетку мира

Кто победил на выборах США, согласно мнению…

ВЫБИРАЕМ ПЫЛЕСОС LG ДЛЯ ДОМА: НАДЕЖНЫЙ ПОМОЩНИК…

В сторону земли движется мощная магнитная буря

АЛТЫНОРДА
Новости Казахстана

Дипломная работа: Клонирование гена atdreb1a arabidopsis thaliana

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. АЛЬ-ФАРАБИ

 

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

 

КАФЕДРА ГЕНЕТИКИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

 

 

 

 

 

 

ВЫПУСКНАЯ РАБОТА

 

 

Клонирование гена atdreb1a arabidopsis thaliana

 

 

 

 

 

 

Исполнитель

 

 

Е.А.Ерискина

Научный консультант:

 

 

к. б. н.

 

 

 

­­­­­

О.В.Карпова

 

 

 

 

 

Научный руководитель:

д. б. н.

профессор

 

 

Б.К. Искаков

 

 

 

 

Допущена к защите:

 

 

зав.кафедрой генетики и молекулярной биологии

доктор  биологических  наук, профессор

 

 

 

 

 

 

З.Г.Айташева
       

 

 

 

 

Алматы, 2010.

 

 

 

Реферат

 

 

 

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА DREB Arabidopsis thaliana

Выпускная работа, 32 с., 24 источника, 6 рисунков, 2 таблицы, 2схемы.

Объектом данной работы являлся генетический материал растений Arabidopsis thaliana, а именно ген DREB.

 

Цель: выделить из растений Arabidopsis thaliana и клонировать ген DREB, который отвечает за устойчивость растений к засухе, холоду и высокому содержанию соли.

 

Выделение тотальной ДНК, содержещей ген DREB, отвечающий за устойчивость растений к засухе, холоду и высокому содержанию соли, проводилось из растений Arabidopsis thaliana cv. Colombia. В результате данной работы был клонирован ген DREB. Так как большинство растений Казахстана подвержено стрессам окружающей среды, то клонированная конструкция может быть использована для снижения потерь культивируемого урожая.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Оглавление

 

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………………. 4

  1. Обзор литературы…………………………………………………………………………. 5
    • Растения Arabidopsis thaliana…………………………………………………….. 5
    • Преимущества растений Arabidopsis thaliana………………………………. 5
    • Геном растений Arabidopsis thaliana…………………………………………… 5
      • Секвенирование генома Arabidopsis thaliana………………………… 5
      • Индивидуальные гены, кодирующие белки………………………….. 6
      • Гены арабидопсиса…………………………………………………………… 7
      • Особенности генома арабидопсиса……………………………………… 7
    • Функции генов арабидопсиса……………………………………………………. 8
    • Таксономатика………………………………………………………………………… 9
    • Дополнительные сведения………………………………………………………… 9
    • Регуляторная роль транскрипционных факторов DREB в

       устойчивости растений к стрессам окружающей среды………………… 9

  • Влияние стрессов окружающей среды на растения…………………….10
  • Классификация растительных генов по функциям, которые выполняют продукты, кодируемые этими генами…………………………………..10
    • Продукты генов первой группы…………………………………….10
    • Продукты генов второй группы…………………………………..10

1.10.Характеристика гена rd29A……………………………………………..11

1.11. Транскрипционные факторы DREB…………………………………..12

  1. Материалы и методы……………………………………………………………………… 19
    • Материалы………………………………………………………………………………. 19
      • Рстительный материал………………………………………………………. 19
      • Плазмиды………………………………………………………………………… 19
      • Праймеры……………………………………………………………19
      • Модель «pl – GUS»…………………………………………………19
    • Методы………………………………………………………………………………….. 21
      • Выделение тотальной ДНК из растений Arabidopsis thaliana…. 21
      • Амплификация ДНК с помощью ПЦР……………………………….. 22
      • Элюция фрагментов???????????????????……………………………… 22
      • Клонирование………………………………………………………23
        • Рестрикция плазмиды «pl – GUS»………………………….23
        • Рестрикция наработанной ДНК…………………………….23
      • Лигирование…………………………………………………………23
      • Трансформация…………………………………………………….23
      • Транскрипция in vitro………………………………………………12
      • Тест ПЦР……………………………………………………………12
      • Рестрикционный анализ……………………………………………23

2.2.10. Трансляция in vitro………………………………………………..12

  1. Результаты и обсуждение…………………………………………………………….. 25

   3.1.      Амплификация сегмента ДНК гена AtDREB1A……………………. 25

  • Элюция…………………………………………………………………………….. 25
  • Лигирование…………………………………………………………………….. 26
  • Трансформация
  • Тест ПЦР
  • Рестрикционный анализ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………………………. 29

 Приложения

Список использованной литературы…………………………………………………….. 30

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение.

 

Arabidopsis thsliana – горчица малая – мелкое растение из семейства крестоцветных (Brassicaceae), маленькое сорняковое растение, которое является «белой лабораторной мышью» для ученых (т.е. Arabidopsis – важная модельная система для определения генов и их функций). Это первое растение, геном которого был полностью секвенирован.

Стрессы окружающей среды, такие как засуха, холод и высокое содержание соли, являются причиной большой потери урожая. Хотя стрессы окружающей среды проявляются в различных формах, но все они имеют общее действие на водное состояние растений. Засуха, холод и высокое содержание соли уменьшает содержание воды в клетках растений и таким образом повреждает всё растение целиком. При более неблагоприятных стрессовых условиях окружающей среды может происходить смерть растения. Согласно последним данным, многие растительные гены вызваны засухой, холодом и высоким содержанием соли. Именно к таким генам относятся гены группы DREB, выделенные из растений Arabidopsis thаliana.

Ген rd29А Arabidopsis кодирует гидрофильные белки, и экспрессия его вызвана стрессами засухи, холода и высокого содержания соли. В области промотора гена rd29А имеются 2 DRE элемента, которые образуются при стрессах окружающей среды. Транскрипционные факторы DREB специфично связываются с DRE-элементами и контролируют экспрессию репортерного гена, который отвечает за устойчивость в засухе, холоду и высокому содержанию соли. Функция транскрипционных факторов DREB и DRE-элемента состоит в сигнальной трансдукции стрессов засухи, холода и высокого содержания соли. Один транскрипционный фактор DREB может контролировать экспрессию нескольких функционально-сложных генов в устойчивости к засухе, холоду и высокому содержанию соли.

Таким образом, это может быть эффективно использовано для улучшения растений в сфере их устойчивости к стрессам путем клонирования и переноса гена DREB.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • Растения Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thsliana (рис.1) – горчица малая – мелкое растение из семейства крестоцветных (Brassicaceae), маленькое сорняковое растение, которое является «белой лабораторной мышью» для ученых (т.е. Arabidopsis – важная модельная система для определения генов и их функций). Это первое растение, геном которого был полностью секвенирован. Он содержит набор генов, необходимый для построения цветкового растения.

 

 

Рис.1. Внешнее изображение растений Arabidopsis thsliana

Ученые уверены, что они смогут использовать полученную информацию для улучшения плодового и пищевого качества хлебных злаков, а также для уменьшения вредного воздействия пестицидов и гербицидов.

 

1.2. Преимущества растений  Arabidopsis thaliana

Основанием для выбора арабидопсиса послужили не только небольшие размеры его генома, но и мелкие размеры организма, что позволяет выращивать его в лабораторных условиях. Принимают также во внимание его короткий репродуктивный цикл, благодаря чему можно быстро проводить опыты по скрещиванию и отбору, детально изученную генетику, легкость осуществления манипуляций со сменой условий произрастания (изменение солевого состава почвы, добавление разных питательных веществ и т.д.) и с испытанием действия на растения различных мутагенных факторов и патогенов (вирусы, бактерии, грибы). Арабидопсис не имеет хозяйственной ценности, поэтому его геном, наряду с геномом мыши, получил название справочного, или, что менее точно, модельного.

 

  • Геном растений Arabidopsis thaliana

1.3.1. Секвенирование генома Arabidopsis thaliana

Интенсивная работа по секвенированию генома арабидопсиса была начата в 1996 г. международным консорциумом, в который вошли научные учреждения и исследовательские группы из США, Японии, Бельгии, Италии, Великобритании и Германии. В декабре 2000 г. стала доступной обширная информация, подводившая итоги определения первичной структуры генома арабидопсиса. Для секвенирования использовали иерархическую технологию: сначала изучали отдельные небольшие участки генома, из которых составляли более крупные участки (контиги), а на финальном этапе – структуру индивидуальных хромосом. Ядерная ДНК генома арабидопсиса распределена между пятью хромосомами. В 1999 г. были опубликованы результаты секвенирования двух хромосом, а появление в печати сведений о первичной структуре остальных трех завершило секвенирование всего генома. Из 125 млн. пар нуклеотидов определена первичная структура 119 млн., что составляет 92 % всего генома. Лишь 8% генома арабидопсиса, содержащих крупные блоки повторяющихся участков ДНК, оказались недоступными для изучения. По полноте и тщательности секвенирования геномов эукариот арабидопсис остается пока в тройке чемпионов наряду с одноклеточным дрожжевым организмом Saccharomyces cerevisiae и многоклеточным организмом животного Caenorhabditis elegance.

 

1.3.2. Индивидуальные гены, кодирующие белки

В геноме арабидопсиса обнаружено около 15 тыс. индивидуальных генов, кодирующих белки. Приблизительно 12 тыс. из них содержатся в виде двух копий на гаплоидный (единичный) геном, так что общее число генов составляет 27 тыс. Число генов у арабидопсиса не сильно отличается от числа генов у таких организмов, как человек и мышь, однако размеры его генома в 25-30 раз меньше. С этим обстоятельством связаны важные особенности в структуре отдельных генов арабидопсиса и общей структуры его генома.

 

1.3.3. Гены арабидопсиса

Гены арабидопсиса компактны, содержат лишь несколько экзонов (участков, кодирующих белки), разделенных короткими (около 250 п.н.) некодирующими отрезками ДНК (интронами). Промежутки между отдельными генами составляют в среднем 4.6 тыс. пар нуклеотидов. А  гены  человека содержат многие десятки и даже сотни экзонов и интронов, а межгенные участки имеют размеры от 10 тыс. пар нуклеотидов и более. Ученые считают, наличие небольшого компактного генома способствовало эволюционной устойчивости арабидопсиса, поскольку его ДНК в меньшей степени становилась мишенью для воздействия различных повреждающих агентов, в частности, для внедрения в геном вирусоподобных повторяющихся фрагментов ДНК (транспозонов).

 

1.3.4. Особенности генома арабидопсиса

Из других молекулярных особенностей генома арабидопсиса следует отметить обогащенность экзонов гуанином и цитозином (44% в экзонах и 32% в интронах) по сравнению с генами животных, а также присутствие дважды повторенных (дуплицированных) генов. Предполагают, что такое удвоение произошло в результате четырех одномоментных событий, заключавшихся в удвоении (повторении) части генов арабидопсиса, или слияния родственных геномов. Эти события, имевшие место 100-200 млн. лет назад, — проявление общей тенденции к полиплоидизации (кратному увеличению числа геномов в организме), характерной для геномов растений. Однако некоторые факты показывают, что у арабидопсиса удвоенные гены неидентичны и функционируют по-разному, что может быть связано с мутациями в их регуляторных участках.

 

  • Функции генов арабидопсиса

Что касается функции генов растений, то о них известно менее одной десятой того, что известно науке о генах человека. Даже у арабидопсиса, геном которого по степени изученности намного превосходит геном человека, функция почти половины его генов, общих с животными, имеется значительное число генов, специфичных только (или, по крайней мере, преимущественно) для них. Речь идет о генах, вовлеченных в транспорт воды и синтез клеточной стенки, отсутствующей у животных, о генах, обеспечивающих образование и функционирование хлоропластов, фотосинтез, фиксацию азота и синтез многочисленных ароматических продуктов. Этот перечень можно продолжить, но уже сейчас ясно, сколь сложная задача стоит перед функциональной геномикой растений (рис.2).

 

 

 

Рис.2. Классификация функций генов арабидопсиса

1 –гены роста, деления и синтеза ДНК; 2 – гены синтеза РНК (транскрипция); 3 – гены синтеза и модификации белков; 4 – гены развития, старения и смерти клеток; 5 – гены клеточного метаболизма энергетического обмена; 6 – гены межклеточного взаимодействия и передачи сигнала; 7 – гены обеспечения прочих клеточных процессов; 8 – гены с неизвестной функцией.

 

Полное секвенирование генома дает близкие к истинным сведения об общем количестве генов данного организма, позволяет поместить в банки данных более или менее подробные и достоверные сведения об их структуре, облегчает работу по выделению и изучению индивидуальных генов. Однако секвенирование генома отнюдь не означает установление функции всех генов. Один из наиболее перспективных подходов функциональной геномики базируется на выявлении работающих генов, на которых идет транскрипции (считывание) мРНК. Этот подход, в том числе испозьзующий современную технологию микрочипов, позволяет одновременно выявлять до десятков тысяч функционирующих генов. Недавно с помощью такого подхода начато изучение геномов растений. Для арабидопсиса удалось получить около 26 тыс. индивидуальных транскриптов, что резко облегчает возможность определения функции практически всех его генов. У картофеля удалось выявить около 20000 тыс. работающих генов, важных для понимания как процессов роста и формирования клубня, так и процессов заболевания картофеля. Предполагается, что это знание позволит повысить устойчивость одного из важнейших пищевых продуктов к возбудителям заболеваний.

 

  • Таксономатика

Систематическое положение арабидопсиса указано в талице 1:

 

Царство

Растения

Plantae

Подцарство

Сосудистые растения

Tracheobionta

Тип

Покрытосемянные (Цветковые растения)

Magnoliophyta

Класс

Двудольные

Magnoliopsida

Подкласс

Дилленииды

Dilleniidae

Порядок

Каперсовые

Capparales

Семейство

Крестоцветные

Brassicaceae

Род

Арабидопсис

Arabidopsis

Вид

Арабидопсис Таля

Arabidopsis thaliana

 

 

1.6 Дополнительные сведения

  1. Русское название: Резуховидка Таля, Арабидопсис.
  2. Геном был полностью секвенирован в 2000 году.
  3. Размер генома составляет 114,5 Мb (в 61 раз меньше, чем размер генома человека.

 

  • Регуляторная роль транскрипционных факторов DREB в устойчивости растений к стрессам окружающей среды

Ген rd29А Arabidopsis thaliana кодирует гидрофильные белки, и экспрессия его вызвана стрессами засухи, холода и высокого содержания соли /1/. В области промотора гена rd29А имеются 2 DRE элемента, которые образуются при стрессах окружающей среды. Транскрипционные факторы DREB специфично связываются с DRE-элементами и контролируют экспрессию репортерного гена, который отвечает за устойчивость в засухе, холоду и высокому содержанию соли. Функция транскрипционных факторов DREB и DRE-элемента состоит в сигнальной трансдукции стрессов засухи, холода и высокого содержания соли. Один транскрипционный фактор DREB может контролировать экспрессию нескольких функционально-сложных генов в устойчивости к засухе, холоду и высокому содержанию соли. Таким образом, это может быть эффективно использовано для улучшения растений в сфере их устойчивости к стрессам путем переноса гена DREB /2/.

 

  • Влияние стрессов окружающей среды на растения

Стрессы окружающей среды, такие как засуха, холод и высокое содержание соли, являются причиной большой потери урожая. Хотя стрессы окружающей среды проявляются в различных формах, но все они имеют общее действие на водное состояние растений /3/. Засуха, холод и высокое содержание соли уменьшает содержание воды в клетках растений и таким образом повреждает всё растение целиком. При более неблагоприятных стрессовых условиях окружающей среды может происходить смерть растения /4/. Наземные растения растут в почве, и они не могут передвигаться самостоятельно, поэтому они очень чувствительны к неблагоприятным стрессовым условиям окружающей среды, и им необходимо приспосабливаться к этим условиям и избегать или уменьшать вред водного дефицита на клетку. Современные исследования сосредоточены на молекулярных ответах растения, когда оно находится в состоянии водного дефицита /5/.

 

1.9 Классификация растительных генов по функциям, которые выполняют продукты, кодируемые этими генами

Согласно последним данным, многие растительные гены вызваны засухой, холодом и высоким содержанием соли. Эти гены классифицируют на две группы, согласно функциям, которые выполняют продукты, кодируемые этими генами.

 

1.9.1. Продукты генов первой группы

Продукты генов первой группы включают функциональные белки, которые сразу защищают макромолекулы и мембраны (LEA-белки, осмотин, мРНК-связывающие белки); которые обеспечивают движение воды через мембрану (водно-канальные белки и мембранные переносчики); ферменты, которые катализируют биосинтезы различных осморегуляторов (пролин, бетаин и сахара). Устойчивость растений к засухе и высокому содержанию соли может быть улучшена путем переноса генов, которые кодируют LEA-белки, пролин-синтетазу или бетаин-синтетазу и т.д. Многие сообщения указывают на то, что продукты этих генов действительно выполняют определенную функцию в устойчивости к стрессам.

 

1.9.2. Продукты генов второй группы

Продукты генов второй группы включают транскрипционные факторы (bZIP, MYC, MYB и DREB); протеин-киназы (МАР-киназа и СDР-киназа, рецептор протеин-киназы, рибосомально-белковая киназа и транскрипционно-регуляторная белковая киназа и др.); протеиназы (фосфоэстераза и фосфолипаза С), которые включаются в сигналы трансдукции стрессов и в контроль экспрессии генов устойчивости к стрессам. Недавно двухкомпонентная система генов была обнаружена в Arabidopsis и табаке. Двухкомпонентный ген кодирует протеин-киназу, которая состоит из «сенсора» и «ответного регулятора» и вовлекает трансдукцию стресс-сигналов. Два из этих генов протеинкиназы- ATRR1 и ATRR2 Arabidopsis — вызваны засухой, холодом и высоким содержанием соли /6/. NTK1, двухкомпонентная система генов табака, вызвана высоким содержанием соли /7/.

До сих пор непонятен молекулярный механизм — как относятся клетки растений к водному дефициту, происходящему в результате засухи или холода; как эти стрессовые сигналы преобразовались в клеточные транскрипционные факторы; и как в дальнейшем контролировалась экспрессия функциональных генов. Таким образом, изучение экспрессии генов второй группы и функций кодируемых ими продуктов становится важным исследовательским элементом в молекулярной биологии растений. Здесь рассмотрен молекулярный механизм ответа растений на засуху, холод и высокое содержание соли и проанализирована контрольная роль транскрипционных факторов DREB в ответе растений на эти стрессы и, соответственно, экспрессия гена rd29А арабидопсиса /8/ и функция дегидратации ответного цис-элемента (DRE) /9/ и транскрипционных факторов DRE-связывающего белка (DREB) /10/.

 

1.10. Характеристика гена rd29А

Ген rd29А был первоначально изолирован из засухо-любивого растения Arabidopsis путём дифференциальной гибридизации скрининг-методом. Экспрессия гена rd29А вызвана при условиях засухи, холода и высокого содержания соли или при обработке экзогенной абсцизовой кислотой (АБК). Экспрессия гена rd29А отлична от другого гена rd (responsive to dehydration-ответ на дегидратацию) /11/. Были проанализированы их промоторы и определен DRE цис-элемент (TACCGACAT), вовлеченную в первую быструю экспрессию гена rd29А при стрессах засухи, холода и высокого содержания соли, а также проанализирован ABRE (АБК ответный элемент) цис-элемент, вовлеченный во вторую медленную экспрессию гена rd29А при этих стрессовых условиях. Ген  rd29А может также быть вызван этими стрессами, когда  ABRE-цис-элемент удаляется из области промотора /12/.  Там, в промоторе rd29А, имеется 2 DRE цис-элемента. Известна центральная последовательность DRE-CCGAG. DRE –цис-элемент или его центральная последовательность была найдена в генах Arabidopsis rd17, kin1 и cor6.6, которые также вызваны стрессами засухи, холода и высокого содержания соли /13/. Подобная модель (С-повтор, TGGCCGAC) была найдена в области промотора гена cor15а в Arabidopsis thaliana, вызванного холодом /14/.  Центральная последовательность CCGAC также была найдена в промоторе вызванного холодом гена BN115 в  Brassia rapus , выраженная элементом, отвечающим на низкую температуру (LTRE) /15/. Эти данные говорят о том, что DRE цис-элемент (или его центральная последовательность) – это широко распространенные в растениях гены, вызванные стрессами засухи, холода и высокого содержания соли.

 

1.11. Транскрипционные факторы гена DREB

Для понимания молекулярного механизма как различные стрессовые сигналы передавались в растительные клетки для активации DRE – зависимой транскрипции и генной экспрессии при стрессах  засухи, холода и высокого содержания соли, исследователи клонировали 5 – кДНК, кодирующих DRE – связывающие белки (названные DREB1A – C, DREB2A – B), используемые DRE – цис-элементами промотора rd29А с помощью метода одно-гибридного скрининга /16/. DREB1A, DREB1B и DREB1C были изолированы из библиотеки кДНК холодолюбивого Arabidopsis thaliana,  и DREB2A и DREB2B были изолированы из библиотеки кДНК обезвоженного Arabidopsis thaliana /17/.

Нуклеотидная последовательность мРНК гена DREB1A представлена на схеме 1:

  1. cctga actag aacag aaaga gagag aaact attat ttcag caaac catac caaca aaaaa
  2. gacag agatc tttta gttac cttat ccagt ttctt gaaac agagt actct tctga tcaat
  3. gaact cattt tctgc ttttt ctgaa atgtt tggct ccgat tacga gtctt cggtt tcctc
  4. aggcg gtgat tatat tccga cgctt gcgag cagct gcccc aagaa accgg cgggt cgtaa
  5. gaagt ttcgt gagac tcgtc accca atata cagag gagtt cgtcg gagaa actcc ggtaa
  6. gtggg tttgt gaggt tagag aacca aacaa gaaaa caagg atttg gctcg gaaca tttca
  7. aaccg ctgag atggc agctc gagct cacga cgttg ccgct ttagc ccttc gtggc cgatc
  8. agcct gtctc aattt cgctg actcg gcttg gagac tccga atccc ggaat caact tgcgc
  9. taagg acatc caaaa ggcgg cggct gaagc tgcgt tggcg tttca ggatg agatg tgtga
  10. tgcga cgacg gatca tggct tcgac atgga ggaga cgttg gtgga ggcta tttac acggc
  11. ggaac agagc gaaaa tgcgt tttat atgca cgatg aggcg atgtt tgaga tgccg agttt
  12. gttgg ctaat atggc agaag ggatg ctttt gccgc ttccg tccgt acagt ggaat cataa
  13. tcatg aagtc gacgg cgatg atgac gacgt atcgt tgtgg agtta ttaaa actca gatta
  14. ttatt tccat tttta gtacg atact tttta tttta ttatt atttt tagat ccttt tttag
  15. aatgg aatct ncatt atgtt tgtaa aactg agaaa cgagt gtaaa ttaaa ttgat tcagt
  16. ttcag tat

 

Эксперименты in vivo в клетках дрожжей и в протопластах листьев и in vitro анализы показывают, что продукты DREB1A и DREB2A, специфично взаимодействующие с  DRE – цис-элементами, активируют GUS – репортер к экспрессии. Все эти 5 DREB-белков содержат основные области в их N-терминальных участках, главная функция которых в ядерной локализации сигнала (NLS) и регион кислотной активации (AAR) в C-терминальной области. Вдобавок, все DREB-белки содержат ДНК-связывающую область  (EREBP/AP2 область), которая состоит из 58 аминокислотных остатков и присутствует в большом семействе растительных генов, кодирующих транскрипционные факторы. Экспрессии генов DREB1A и DREB2A ученые анализировали и сравнивали с экспрессией гена rd29A /18/. DREB1A был вызван в течении 10 минут при 4°С. DREB2A также был вызван в течение 10 минут при засухе или обработке высоким содержанием соли-250 mmol/L NaCl. Кроме того, оба гена DREB1A и DREB2A не были вызваны экзогенной АБК /19/.

По сравнению с генами DREB, отдельное увеличение в экспрессии rd29А случается в 40 минут, когда объект находится в состоянии стресса засухи, холода и высокого содержания соли. Данные исследования предполагают, что экспрессия гена rd29А Arabidopsis при низкой температуре засухи и высоком содержании соли регулировалась трансктрипционными факторами DREB1A и DREB2A в двух отдельных сигналах трансдукционноых путей, соответственно /20/. При описании транскрипционноых факторов DREB трансгенного растения Arabidopsis, трансформированного по DREB1A и DREB2A, увеличивали их устойчивость к холоду, засухи и высокому содержанию соли. Трансгенные растения с увеличением устойчивости к холоду полученные трансформацией гена CBF1 (названный DREB1B) в  Arabidopsis thaliana Jaglo-Ottosen и др. /21/.

LEA-белки появляются в дальнейших стадиях развития эмбрионов, и их содержание увеличивается с высыханием и зрелостью семян. LEA-гены также вызваны стрессами засухи, холода и высокого содержания соли в вегетативных тканях некоторых растений /22/.  LEA-белки гидрофильны и сразу защищают макромолекулы и мембраны от вреда этих стрессов для клеток. Среди известных генов Arabidopsis thaliana, вызванных засухой, холодом и высоким содержанием соли,  rd29A кодируют гидрофильный белок, подобный  LEA-белку /23/, оба гена rd17 и erd10 кодируют группу 2  LEA-белков; и оба гена kin1 и cor6.6 кодируют белки, которые структурно схожи с антифризовыми белками рыб, которые богаты аланином /13/. Эти сходства в белковой структуре, свойствах и характере генной экспрессии предполагают, что продукты этих генов могут иметь сходные функции, связанные с устойчивостью растений к засухе, холоду и высокому содержанию соли. Другой, вызванный холодом ген Arabidopsis thaliana cor15a кодирует белок, который расходится в стромальном отделении хлоропластов и может усиливать устойчивость протопластов листьев к замораживанию /23/. Поэтому DRE-элемент (или его центральная последовательность) находится в промоторах этих генов вызванных стрессами. Предполагается, что если один из пяти DREB-генов может экспрессироваться при нормальных условиях или эта экспрессия в дальнейшем усиливается при стрессовых условиях, то этот  DREB-транскрипционный фактор может одновременно активировать экспрессию генов rd29A, rd17, kin1, cor6.6, cor15A и erd10 при нормальных условиях или дальнейшем усилении их экспрессии при стрессовых условиях, которая будет в результате иметь многочисленные улучшения растений в устойчивости к стрессам. Исследователи использовали  35S-pro вируса мозаики цветной капусты (CaMV) для управления геном  DREB1A в трансгенных растениях  Arabidopsis thaliana. Имеются подтверждения анализа экспрессии DREB1A и его мишень генов (rd29A, rd17, kin1, cor6.6,  cor15a и erd10) и исследования устойчивости трансгенных растений к засухе, холоду и высокому содержанию соли. В экспериментах DREB1A, rd29A, rd17, kin1, cor6.6, и  cor15a не экспрессировались в диких видах при нормальных условиях. Однако, в DREB1A – трансгенных растениях сверхэкспрессия DREB1A не только активируют экспрессии  rd29A, kin1, cor6.6, cor15A и erd10 при нормальных условиях, но также в дальнейшем усиливает экспрессию rd29A, rd17, kin1, cor6.6, cor15a и erd10 при условиях засухи и холода в отличие от диких видов. Эти предположения, что транскрипционные факторы DREB1A трансгенных растений специфично взаимодействуют с DRE-элементами (или DRE-центральной последовательностью) и вызывают экспрессию этих стресс-устойчивых генов, показывают, что в результате возникают многочисленные улучшения растений в устойчивости к засухе, солевой нагрузке и замораживанию /11/.  В противоположных экспериментах некоторые гены, вызванные засухой (такие как P5CS, erd1, rd22 и  rd29B), которые содержат не DRE-элементы в своих промоторах, не вызваны сверхэкспрессией DREB1A в трансгенных растениях. При трансформации гена cor15a, вызванного холодом, были замечены улучшения устойчивости к замораживанию в трансгенных растениях Arabidopsis thaliana /23/.

   Хотя, устойчивость к засухе, холоду и высокому содержанию соли в трансгенных растениях  Arabidopsis thaliana были улучшены перемещением гена rd29A, вызванного этими стрессами, их эффект не очень удовлетворителен /9/.

  Перемещение гена другим одиночным геном, таким как пролин-синтетазный ген или бетаин-синтетазный ген, может усиливать устойчивость растения к высокому содержанию соли, но не может сделать растение устойчивым к многочисленным стрессам. В сравнительной характеристике растений, которые устойчивы к различным насекомым и заболеваниям с растениями, которые устойчивы к стрессам, было показано, что механизм устойчивости к стрессам намного сложнее. Способность растений к устойчивости к засухе, холоду и высокому содержанию соли не зависит от одиночных функциональных генов; характер стресс-устойчивых растений влияет на многие функциональные гены. Таким образом, эти данные могут быть использованы для усиления контроля за устойчивостью растений к засухе, холоду и высокому содержанию соли.

     Схема 2 показывает регуляторную функцию транскрипционного фактора DREB и серию событий, произошедших из-за сигналов стрессов засухи, холода и высокого содержания соли и трансдукционного сигнала к транскрипционному контролю транскрипционного фактора DREB и DRE – цис-элементами, а также экспрессию генов мишени с  DRE-элементом, накопление продуктов стресс-вызванных генов, физиологическая и биохимическая регуляция, усиление устойчивости растений к стрессам. Изучение транскрипционных факторов DREB прадполоагает, что транскрипционный фактор может контролировать экспрессию различных генов /24/.

                        Стрессы засухи, соли или холода

 

Восприятия клеткой

водного дефицита

 

 

 

 

 

 
   

 

 

 

 

                                                                     Сигнальная трансдукция

 

 

                                                                      Транскрипционная регуляция                               

 

 

 

DRE цис-элементы                                    Стресс-устойчивые гены

 

           DRE-любивые  цис-элементы

 

           Стресс-устойчивые гены

 

DRE-любивые цис-элементы                    Стресс-устойчивые гены

 

 
   

 

 

                                                                                                    Экспрессия

 
   

 

 

       rd17          rd29A       kin1    erd10       cor6.6   cor15a

       
     
 
   

 

 

 

 

 
 

   Накопление продуктов вызванных генов

 

 

 

 

 

 

 
 

        Физиологическая и биохимическая регуляция

 

 

 

         Физиологическая и биохимическая регуляция

 

 
   

 

 

 

 

 
 

      Усиление устойчивости к стрессам

 

 

 

 

 

 

 

Схема 2. Стесс-регулируемый транскрипционный фактор DREB может активировать экспрессию DRE-содержащего элемента мишень-генов, вовлеченных в устойчивость растений к засухе, холоду и высокому содержанию соли.

  1. Материалы и методы.

 

2.1. Материалы

2.1.1. Растительный материал

          В работе использовали растения Arabidopsis thaliana. Семена были привезены из Германии, а растения выращены самостоятельно.

 

2.1.2. Плазмиды.

 

В работе были использованы плазмиды, «pl – GUS» ??????????????????????????????????

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.1.3. Праймеры

 

Использованные праймеры: #18 и #19. Была взята нативная последовательность с внесенными мутациями для удобства:

18 – А=С

19 – Т=С

Применяли антисмысловую последовательность.

 

Праймер #18 для ПЦР гена DREB1А:

 

5′-CTCTTCTGAT CAATGAACTC ATTTTCTGCT-3′ (нативная форма)

5′-CTCTTCTGAT CCATGGACTC ATTTTCTGCT-3′ (мутированная форма)

                                  ↑        ↑   

                                 NcoI

 

Праймер # 19 для ПЦР гена DREB1A:

 

5′-TTTTATTATT ATTTTTAGAT CCTTTTTTAG-3′ (нативная форма)

5′-TTTTATTATT ATTTCTAGAT CCTTTTTTAG-3′ (мутированная форма)

                                        ↑

 

5′-CTAAAAAAGG ATCTAGAAAT AATAATAAAA-3′ (антисмысловая 

                                       ↑                                                        последовательность)

                                    XbaI

 

 

Олиг 18    0.055 о.е.

Олиг 19    0.058 о.е.

 

2.1.4. Модель «pl —  GUS» изображена на схеме 3:

 

 

 

2.2 Методы        

 

2.2.1. Выделение тотальной ДНК из растений Arabidopsis thaliana cv. Colombia.

 

Выделение тотальной ДНК из листьев растений.

Были использованы листья растений  Arabidopsis thaliana cv. Colombia.

 

Приготовление STE-буфера: конечная концентрация количества стоков (на 100 µl):

 

5 ml      1 M     трис     рН=7.5       трис HCl      рН=7.5-8.0    50 mM

2 ml      5 M     NaCl                                NaCl                           100 mM

200µl    0.5 M  ЕДТА  рН=8.0                ЕДТА                         1 mM

 

Выделение тотальной ДНК.

  1. Собираем по 2 диска листьев растений в стерильные пробирки, с заранее насыпанным в них кварцевым песком.
  2. Экстракционный буфер готовим непосредственно перед использованием:

 

12 ml STE + 8 µl MET (14M) + 500 µl 20 % SDS = Буфер № 1

6 ml STE + 4  µl MET (14M) + 500 µl  10 % SDS

  1. Используем жидкий азот для быстрого замораживания листьев. 

         Гомогенизируем листья стеклянной палочкой, придерживая пробирку

         стерильной бумагой. Приготовить заранее лёд. К размолотому

         листовому порошку добавляем  600 (400, а у нас было 500 на 2) буфера

         № 1. Продолжаем гомогенизировать массу, пока она не станет

        однородной. Ставим на лёд.

  1. Добавляем 600 µl фенола и 600 µl хлороформа.
  2. Тщательно всё перемешать (Vortex). Центрифугируем 2 минуты при 10-12 тыс. об/мин (max).
  3. Берём водную фазу и смешиваем с 500 µl  изопропанола. Выдерживаем 15 минут при комнатной температуре.
  4. Центрифугируем 10 минут при 12 тыс.об/мин.
  5. Промывка 70 % этанолом. Тщательно всё перемешать (Vortex). Центрифугируем 5 минут при 12 тыс.об/мин. Сушим ( в вакууме, 10 минут). Растворяем в 50-100 µl ТЕ или воды.
  6. Электрофорез в 1 %-агарозе.

 

Электрофорез в агарозном геле.

0,65 г агарозы  добавляют к 65мл ТВЕ 0,5X (трис-боратного буфера), прогревают взвесь до полного растворения агарозы, добавляют бромистый этидий до концентрации 0,65 мкг/мл. Заливают гель, помещают его в горизонтальную электрофорезную камеру с буфером ТВЕ 0,5x. Раствор ДНК вносят в лунки геля. Электрофорез проводят при напряженности 10V/см. Идентификацию полос проводят в проходящем ультрафиолетовом свете.

ТВЕ 5X содержит 50мМ tris-HCl, 50мМ борной кислоты, 1мМ EDTA, рН 8,0.

 

2.2.2.Амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

 

Для амплификации кДНК проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР). 

Реакционная смесь объемом 20 мкл содержит 0,5 мкл раствора ДНК, 2,0 мкл буфера для Taq-полимеразы, 4,0 мкл 25 мМ MgCl2, 0,1 мкл dNTP(10 мМ), 0,5мкл bsa (бычий сывороточный альбумин, 1 мг/мл), 0,2 мкл Taq-полимеразы (5 ед/мкл, фирмы «Fermentas»), по 0,2 мкл прямого и обратного праймеров, 12,3 мкл воды.

ПЦР-амплификацию проводят в следующем температурном режиме:

 

Стадия 1 — 94°С 2 мин, 94°С 30 сек, 64ºС 30 сек, 72ºС 1 мин — 30 циклов.

Стадия 2 — 72°С 2 мин — 1 цикл.

 

 

Известно, что Taq-полимераза допускает 56 % ошибок, по сравнению с Pwo-полимеразой.

 

Буфер для Tag – полимеразы содержит: 10 mM Tris – HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, pH 8,3 (20º)

 

Буфер для  Pwo – полимеразы  содержит: 100 mМ Tris – HCl, pH 8,85 (20ºC), 250 mM KCl, 50 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4

 

 

 

2.2.3. ЭЛЮЦИЯ и электрофорез тяжелого и легкого фрагментов.

 

Элюция ДНК – фрагментов из агарозного геля

 

  1. Провести электрофорез в ТВЕ 1х
  2. Вырезать фрагмент скальпелем и перенести в заранее взвешенный эппендорф
  3. Добавить 300µl буфера №2 на 100 mg агарозного геля

водяная баня?????????????????

  1. Ресуспендировать раствор №1 до гомогенного состояния (можно добавить воды). Добавить 10µl суспензии к пробе (если проба содержит более, чем 2,5 µg ДНК – увеличьте количество силиконовой суспензии: 4 µl на каждые дополнительные µg ДНК
  2. Инкубируйте 10 минут при 56-60ºС (Водяная баня) и перемешивайте каждые 2-3 минуты на Vortex
  3. Центрифугируйте 30 сек при максимальной скорости (13 тыс об) и отбросьте супер
  4. Ресуспендируйте матрикс, содержащий ДНК с 500µl буфером, связывающим НК (№3) на Vortex. Центрифугируйте (тот же режим) и отбросьте супер снова
  5. Промойте 500µl washing buffer (№4) мягко перемешать. Центрифугируйте (режим тот же) и отбросьте супер снова. Повторите эту процедуру
  6. Удалить всю жидкость и просушить:15 мин в термостат на 37ºС. Цвет матрикса после сушки меняется с прозрачного на белый
  7. Добавьте 20-30µl ТЕ – буфера или ddH2O (pH = 8,0 – 8,5) к элюированной ДНК. Vortex. Инкубация 10 мин при 15-25ºС или 56-60ºС. Перемешивайте каждые 2-3 мин. После центрифугирования при максимальной скорости в теч 30 сек перенесите ДНК-раствор в новую чистую пробирку, не захватывая матрикса – осадка.

 

 

 

2.2.4. Клонирование

по NCO I и Xba I (вместо GUS-гена (1800 н.п.) вставили  ген DREB).

Все конструкции были созданы на основе плазмиды «pl-GUS», любезно предоставленной доктором Д. Галли (Германия).

2.2.4.1. Рестрикция плазмиды «pl – GUS»  

по сайтам рестрикции? NCO I и Xba I? или NСО и HInd

Реакционная смесь  объёмом 10 мкл содержит 1 мкл рестрикционного буфера ?, 0,1 мкл рестриктазы 1?, 0,1 мкл рестриктазы 2 ?, ? мкл раствора ДНК, ? мкл воды. Режим Работы рестриктаз — ?ºС, ? часа.

Рестрикционный буфер содержит: ?

2.2.4.2. Рестрикция наработанной ДНК

по сайтам рестрикции? NCO I и Xba I?

Реакционная смесь  объёмом 10? мкл содержит 1? мкл рестрикционного буфера ?, 0,1? мкл рестриктазы 1?, 0,1? мкл рестриктазы 2 ?, ? мкл раствора ДНК, ? мкл воды. Режим работы рестриктаз — ?ºС, ? часа.

Рестрикционный буфер содержит: ?

2.2.5. Лигирование

полученной плазмиды с фрагментом ДНК, содержащим ген DREB:

 Реакционная смесь  объёмом ? мкл содержит ? мкл лигирующего буфера ?, ? мкл ? лигазы, ? мкл раствора ДНК, ? мкл воды. Режим работы лигазы — 4?ºС, ? часа.

Таким образом клонировали область полного гена DREB (651 н.п.) и прилежащий 3′- кодон (71 н.п.) до AUG-кодона (12 н.п.).

 

2.2.6. Трансформация

Продукты реакции лигирования использовали для трансформации клеток E. coli.

 

ТРАНСФОРМАЦИЯ

Селекцию клонов проводили на среде с ампициллином

 

Трансформация

 

  1. разморозить компетентные клетки во льду
  2. добавить раствор ДНК в объёме 20 µl к 50 или 100 µl компетентных клеток (во льду). Размешайте, вращая пробирку между ладонями.
  3. Проинкубируйте пробирки во льду 10-60 минут
  4. Поместите пробирки на водяную баню с температурой 42ºС на 90 секунд (тепловой шок), затем быстро охладите до 0ºС (на льду) 2 минуты
  5. Добавьте 950 или 900 µl LB – среды и проинкубируйте при 37ºС с умеренным встряхиванием 30-60 минут на качалке

 

 

          2.2.7. Транскрипцию in vitro

с использованием Т7 РНК-полимеразы

Полимераза Т7-без стопа, поэтому сделали рестрикцию по EcoR I, чтоб не нарабатывалось бесконечное количество РНК.

Получили РНК.

 

 

 

Определили белок

1 kb ДНК = 333 аминокислоты

 

10 кДа – 270 н.п. ДНК

Х          — 651 н.п.

 

Х=10*651/270=24 кДа белок.

 

2.2.8. Тест ПЦР???????????????????

 

2.2.9. Рестрикционный анализ

 

          Рестрикционный анализ проводили по сайтам ???????????????????

Реакционная смесь  объёмом ? мкл содержит ? мкл рестрикционного буфера ?, ? мкл рестриктазы 1?, ? мкл рестриктазы 2 ?, ? мкл раствора ДНК, ? мкл воды. Режим раьоты рестриктаз — ?ºС, ? часа.

 

 

 

2.2.10. Трансляция in vitro. Буфер для бесклеточной системы имеет следующий состав: 10 мМ трис-ацетат рН 7,6; 90 мМ K(ОАc); 3 мМ Mg(ОAc)2; 5 мМ дитиотрейтол (ДТТ); 5% глицерин. Реакционная смесь содержала следующие компоненты: 20 мM трис-(ОАс) (pH 7.6); 90мM K(ОАc); 2,5мM Mg(ОAc)2; 1,6 мM ДTT; 1 мM ATФ; 0,1 мM ГTФ; 10 мM креатин фосфата; 0,12 мг/мл креатин фосфаткиназы; 0,1 мM спермин; по 0,1 мM аминокислот; 0,08 мг/мл мРНК. В том случае, когда необходимо радиоактивно пометить новосинтезированные белки, аминокислот добавляли по 0,1 мM кроме метионина, которого добавляли 0,025 мМ как нерадиоактивной аминокислоты, а также 0,075 мМ [35S]метионина (0,037 МБк).

В 25 мкл реакционной смеси для бесклеточной системы трансляции содержалось 7 мкл экстракта из зародышей пшеницы. Инкубировали в течение 1 часа при 26 °C или 37°С.

Эффективность трансляции определяли по авторадиографии ПААГ после электрофореза продуктов бесклеточной системы синтеза белка или флюориметрически по активности фермента b-глюкуронидазы (GUS), который являлся продуктом трансляции.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. Результаты и их обсуждение

 

3.1       Амплификация белок-кодирующего сегмента ДНК гена AtDREB1A

Как уже упоминалось выше, ДНК последовательности, кодирующие DRE-связывающие белки CBF1, DREB1A и DREB2A уже были установлены ранее. Были подобраны праймеры для амплификации ДНК – фрагмента, кодирующего белок DREB1A из Arabidopsis thaliana (AtDREB1A). Эти праймеры были синтезированы и использованы в полимеразной цепной реакции.

          Праймеры рассчитаны таким образом, чтобы в ходе амплификации возникали замены нуклеотидов. Такие замены создают новые уникальные сайты для рестриктаз NcoI и XbaI, которые необходимы для дальнейшего клонирования. Следует отметить однако, что замена нуклеотида А на G в праймере #19 приводит к замене второй аминокислоты аспарагин на аспарагиновую кислоту.

Первым использовали олигонуклеотид #19. Проводили полимеразную цепную реакцию с использованием ДНК – полимеразы Pwo, а также олигонуклеотида #18. Продукты ПЦР – амплификации анализировали электрофорезом в агарозном геле. Результат этого анализа приведен на рисунке ??????????.

Обозначения: М – маркерные ДНК-фрагменты, размеры которых указаны слева в нуклеотидах;       1 – продукты ПЦР – амплификации с использованием ДНК – полимеразы Pwo;         2 – продукты ПЦР – амплификации ДНК – полимеразой Taq.

 

Рис. 3 – Электрофорез в 1% агарозе продуктов ПЦР – амплификации нуклеиновых кислот Arabidopsis thaliana с праймерами #18 и # 19.

 

Известно, что Taq-полимераза допускает 56 % ошибок, по сравнению с Pwo-полимеразой.

Среди продуктов ПЦР обнаруживается главный амплифицируемый ДНК-фрагмент длиной около 750 пар нуклеотидов (пн). По размеру он хорошо соответствует ожидаемому фрагменту длиной 734 пн., в пределах которого должна содержаться открытая рамка считывания (ОРС) длиной 651 пн, кодирующая белок AtDREB1A, имеющий расчетную молекулярную массу около 25 килодальтон (кДа).

3.2. Элюция

Амплифицированный фрагмент вырезали из геля и элюировали. Выделенный таким образом фрагмент обрабатывали рестриктазами NcoI и XbaI, повторно подвергали электрофорезу и элюировали фрагмент длиной около 650 пн для последующего лигирования в модифицированный вектор на основе pBluescript K/S+. Этот вектор также обрабатывали рестриктазами NcoI и XbaI, подвергали электрофорезу и элюировали фрагмент длиной около 2500 пн для последующего лигирования с вышеупомянутым фрагментом.

3.3. Лигирование

В результате лигирования вектора и вставки получили рекомбинантную ДНК, общая структура которой приведена на рисунке 3.

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обозначения: HindIII, NcoI, XhoI, SacI, SalI, XbaI, KpnI, NdeI, EcoRI – уникальные сайты рестрикции, позволяющие клонировать и замещать различные функциональные домены гена AtDREB1A, а также и линеаризовать плазмидную ДНК. T7 – промотор бактериофага Т7, позволяющий транскрибировать клонированный фрагмент с различными вариантами 5’- и 3’-нетранслируемых последовательностей (5’- и 3’-НТП).

 

Рисунок 3 – Схематическое изображение вектора pBluescript K/S +

с лигированным участком гена AtDREB1A.

3.4. трансформация

Продукты реакции лигирования использовали для трансформации клеток E. coli штамма DН5. Селекцию клонов проводили на среде с ампициллином.

3.5. Тест ПЦР

Выросшие колонии тестировали также на наличие искомой вставки по амплификации ДНК этих колоний с праймерами #18 и #19 методом ПЦР. Типичный результат такого тестирования представлен на рисунке 4. Как видно из рисунка, в некоторых клонах действительно амплифицировался ДНК фрагмент длиной около 750 пн, что свидетельствует о наличии искомой вставки.

Таким образом, по-видимому, нами клонирован фрагмент длиной 734 пн., в пределах которого должна содержаться открытая рамка считывания (ОРС) длиной 651 пн, кодирующая белок AtDREB1A.

          3.6. рестрикционный анализ

Для того чтобы дополнительно убедиться в том, что клонированная последовательность соответствует гену AtDREB1A, мы провели рестрикционный анализ рекомбинантной ДНК, с использованием рестриктаз (XhoI, SacI?????????????????????????), уникальные сайты которых находятся в белок-кодирующем сегменте этого гена (см. рис. 3). Продукты гидролиза ДНК анализировали электрофорезом в агарозном геле: результаты этого анализа приведены на рисунке 5.

 

 

Обозначения: М – маркерные ДНК-фрагменты, размеры которых указаны справа в нуклеотидах;       1 – 4 продукты ПЦР – амплификации с использованием ДНК – полимеразы Taq и с праймерами #18 и #19 .

 

Рис. 4 – Электрофорез в 1% агарозе продуктов ПЦР – амплификации с праймерами #8 и # 9 ДНК из трансформированных клонов E. coli.

 

 

 

Обозначения: 1 – маркерные ДНК-фрагменты, размеры которых указаны слева в нуклеотидах;       2 – гидролиз рестриктазами SacI и SalI;    3 – гидролиз рестриктазами HindIII и XbaI;      4 – гидролиз рестриктазами XhoI и SalI.

 

Рис. 5 – Электрофорез в 1% агарозе продуктов рестрикционного анализа рекомбинантной ДНК с использованием рестриктаз (XhoI, SacI), уникальные сайты которых находятся в белок-кодирующем сегменте гена AtDREB1A.

 

 

 

 

 

          Из рисунка 5 видно, что при гидролизе рестриктазами SacI и SalI ??????????????????????????????????????выщепляется единственный фрагмент длиной около 440 пн, что хорошо согласуется с ожидаемым расчетным показателем. При гидролизе рестриктазами XhoI и SalI выщепляется единственный фрагмент длиной около 450 пн, что также согласуется с расчетной величиной, поскольку сайты рестриктаз SacI и XhoI находятся на расстоянии 7 нуклеотидов друг от друга (см. рис. 3). Гидролиз рестриктазами HindIII и XbaI приводит к выщеплению единственного фрагмента длиной около 850 нуклеотидов, что соответствует гену AtDREB1A (около 750 пн), а также 5’-нетранслируемую последовательность (ARC-1 длиной около 100 пн).

          Таким образом, результаты, приведенные на рисунке 5, свидетельствуют, что нами действительно клонирован ген AtDREB1A, причем сайты, по которым была вставлена данная последовательность, а также другие уникальные сайты полностью функциональны, что позволяет варьировать различные 5’- и 3’-НТП.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

Таким образом бяла амплифицирована и клонирована последовательность гена AtDREB1A, кодирующая транскрипционный фактор, который связывает DRE-элемент в промоторах многих генов Arabidopsis thaliana и регулирует транскрипцию этих генов. Соответствие клонированной последовательности искомому гену подтверждается результатами ПЦР и рестрикционного анализа. Кроме того, экспрессия этого гена приводит к синтезу белка с молекулярной массой около 30 кДа, что хорошо соответствует величине, указанной другими группами исследователей для белка AtDREB1A.

 

 

 

 

 

 

Обозначения: Проведен гидролиз следующими рестриктазами: 1 – HindIII и EcoRI, 2 — HindIII и BamHI, 3 – NcoI и BamHI, 4 – HindIII и XbaI, 5 – NcoI и XbaI, 6 — маркерные ДНК-фрагменты, размеры которых указаны справа в нуклеотидах; 7 – SmaI и EcoRI, 8 – SalI и EcoRI, 9 – SacI, 10 – HindIII и SacI, 11 – HindIII и XhoI.

 

Рис. 4.             Электрофорез в 1% агарозе продуктов рестрикционного анализа рекомбинантной ДНК с использованием рестриктаз, уникальные сайты которых находятся в составе кассеты и белок-кодирующем сегменте гена AtDREB1A.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованной литературы

 

  1. ? 12 Finkelstein RR, Gampala SS, Rock CD (2002) Abscisic acid signaling in seeds and seedlings. Plant Cell 14 (suppl.):S15-S45.
  2. ?13 Finkelstein RR, Lynch TJ (2000) The Arabidopsis Abscisic acid response gene AB15 encodes a basic leucine zipper transcription factor. Plant Cell 12:599-609.
  3. ?14 Fowler S, Thomashow MF (2000) Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway. Plant Cell 14:1675-1690.
  4. ?16 Fukuda A, Nakamura A, Tanaka Y (1999) Molecular cloning and expression of the Na+ /H= exchanger gene in Oryza sativa. Biochim Biophys Acta 1446:149-155.
  5. ?17 Gao MJ, Allard G, Byass L, Flanagan AM, Singh J (2000) Regulation and characterization of four CBF transcription factors from Brassica napus. Plant Mol Biol 49:459-471.
  6. ?20 Gilmour SJ, Sebolt AM, Salazar MP, Everard JD, Thomashow MF (2000) Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation. Plant Physiol 124:1854-1865.
  7. ?21 Gilmour SJ, Zarka DG, Stokinger EJ, Salazar MP, Houghton JM, Thomashow MF (1998) Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression. Plant J 16:433-442.
  8. ?28 Jaglo-Ottosen KR, Gilmour SJ, Zarka DG, Schabenberger O, Thomashow MF (1998) Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science 280:104-106.
  9. ?33 Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K (1999) Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat Biotechnol 17:287-291.
  10. ?37 Laurie S, Feeney KA, Maathuis FJ, Heard PJ, Brown SJ, Leigh RA (2002) A role for HKT1 in sodium uptake by wheat roots. Plant J 32:139-149.
  11. ?42 Liu J, Zhu JK (1998) A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance. Science 280:1943-1945.
  12. ?43 Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miuta S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1998) Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell 10:1391-1406.
  13. ?53 Okamuro JK, Caster B, Villarroel R, Van Montagu M, Jofuku KD (1997) The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA 94:7076-7081.
  14. ?58 Rus A, Yokoi S, Sharkhuu A, Reddy M, Lee BH, Matsumoto TK, Koiwa H, Zhu JK, Bressan RA, Hasegawa PM (2001) AtHKT1 is a salt tolerance determinant that controls Na(+) entry into plant roots. Proc Natl Acad Sci USA 98:14150-14155.
  15. ?63 Shi H, Ishitani M, Kim C, Zhu JK (2000) The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+ antiporter. Proc Natl Acad Sci USA 97:6896-6901.
  16. ?64 Shi H, Lee BH, Wu SJ, Zhu JK (2003) Overexpression of a plasma membrane Na+/H+ antiporter gene improves salt tolerance in Arabidopsis thaliana. Nat Biotechnol 21:81-85.
  17. ?65 Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2000) Molecular responses to degydration snd low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways. Curr Opin Plant Biol 3:217-223.
  18. ?66 Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, Seki M (2003) Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses. Curr Opin Plant Biol 6:410-417.
  19. ?72 Xia T, Apse MP, Aharon GS, Dlumwald E (2002) Edintification and characterization of a NaCL-inducible vacuolar Na+/H+ antiporter in Beta Vulgaris. Physiol Plant 116:206-212.
  20. ?74 Yamaguchi T, Apse MP, Shi H, Blumwald E (2003) Topologikal analysis of a plant vacuolar Na+/H+ antiporter reveals a luminal C terminus that regulates antiporter cation selectivity. Ptoc Natl Acad Sci USA 100:12510-12515.
  21. ?75 Yamaguchi T, Fukada-Tanaka S, Inagaki Y, Saito N, Uonekura-Sakakibara K, Tanaka Y, Kusumi T, Iida S (2001) Genes encoding the vacuolar Na+/H+ exchanger and flower coloration. Plant Cell Physiol 42:451-461.
  22. ?77 Zhang HX, Blumwald E (2001) Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit. Nat Biotechnol 19:765-768.
  23. ?78 Zhang HX, Hodson JN, Williams JP, Blumwald E (2001) Engineering salt-tolerant Brassica plants: characterization of yield and seed oil quality in transgenic plants with increased vacuolar sodium accumulation. Proc Natl Acad Sci USA 98:12832-12836.
  24. ?79 Zhu JK (2002) Salt and drought stress signal transduction in plant. Annu Rev Plant Biol 53:247-273.
  25. ?80 Zhu JK (2003) Regulation of ion homeostasis under salt stress. Curr Opin Plant Biol 6:441-445.

 

 

 

 

 

 

3          Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways. // Curr. Opin. Plant Biol. 2000. V. 3. P. 217–223.

4          Thomashow M.F. Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 571–599.

8          Johnston F.B., Stern H. Mass isolation of viable wheat embryo. // Nature. 1957. V. 179. P. 160-161.

9          Astruc N., Marcos J.F., Macquaire G., Candresse T., Pallas V. Studies on diagnostics of hop stunt viroid in fruit trees: Identification of new hosts and application of a nucleic acid extraction procedure based on non-organic solvent. Eur. J. Plant Pathol. 1996. V. 102. P. 837-846.

11        Gallie D.R., Feder J.N., Schimke R.T., Walbot V. Post-transcriptional regulation in higher eukaryotes: The role of the reporter gene in controlling expression. // Mol.Gen.Genet. 1991. V. 228. P. 258-264.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованной литературы

 

  1. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., Molekular responses to drought and cold stress, Curr. Opin. Biotechnol., 1996, 7:
  2. Thomashow, M.F., Arabidopsis thaliana as a model for studying mechanisms of plant cold tolerance, in Arabidopsis (eds. Meyerowitz, E., Somerville, C.), New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994, 807.
  3. Shinzaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., Gene expressing and signal transduction in water-stress response, Plant Physiol., 1997, 115:327.
  4. Ingram J., Bartels D., The molecular basis of dehydration tolerance in plants, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1996, 47:
  5. Bray, E. A., Plant responses to water deficit, Trends in Plant Science, 1997, 2:48.
  6. Urau, T., Yakubo, B., Yamaguchi-Shinozaki, K. et al., Stress-responsive expression of genes for two-component response regulator-like proteins in Arabidopsis thaliana, FEBS Letters, 1998, 427(2):175.
  7. Zhang, J. S., Xie, C., Liu, F. et al., A novel tobacco gene coding for a product similar to baterial two-component regulators, Chinese Science Bulletin, 1999, 44(11):1025.
  8. Yamagychi-Shinozaki, K., Koizumi, M., Urao, S. et al., Molecular cloning and characterization of nine cDNAs for genes that are responsive to desiccation in Arabidopsis thaliana: Sequence analysis of one cDNA clone that encodes a putative transmembrane channel protein, Plant Cell Physiol., 1992, 33:217.
  9. Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature or high-salt stress, Plant Cell, 1994, 6:251.
  10. Liu, Q., Kasuga. M., Sakuma, Y. Et al., Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP2/AP DNA-binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature responsive gene expression in Arabidopsis, Plant Cell, 1998, 10:1391.
  11. Kasuga, M., Liu, Q., Miura, S. Et al., Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor, Nature Biotechnology, 1999, 17:287.
  12. Iwasaki, T., Kiyosue, T., Yamaguchi-Shinozaki, K. et al., The dehydration – inducible rd17 (cor47) gene and its promoter region in Arabidopsis thaliana, plant Physiol., 1997, 115:1287.
  13. Wang, H., Datla, R., Georges, F. et al., Promoters from kin1 and cor6, two homologous Arabidopsis thaliana genes:Transcriptional regulation and gene expression induced by low temperature, ABA osmoticum and dehydration, plant Mol. Biol., 1995, 28:605.
  14. Baker S.S., Wilhelm, K.S., Thomashow, M.F. The 5′-region of Arabidopsis thaliana cor15a has cis-acting elements that confer cold-, drought- and ABA-regulated gene expression, Plant Mol. Biol., 1994, 24:701.
  15. Jiang, C., Lu, B., Sibgh, J., Requirement of a CCGAC cis-acting element for cold induction of the BN115 gene from winter Brassica napus, Plant Mol. Biol., 1996, 30:
  16. Li, J. J., Herskowitz, I., Isolation of ORC6, a component of the yeast origin of recognition complex by a one – hybrid system, Science, 1993, 262:1870.
  17. Wang, M., M., Reed, R., R., molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor OLF – 1 by genetic selection in yeast, Nature, 1993, 364:121.
  18. Jofuku, K. d., den Boer, B. G. W., Van Montagu, M. et al., Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene APETALA2, Plant Cell, 1994, 6:1211.
  19. Ohme – Takagi, M., Shinshi, H., Ethylene – inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene – responsive element, Plant Cell, 1995, 7:173.
  20. Stockinger, E. J., Gilmour, S. J., Thomashow, M. F., Arabidopsis thaliana CBF1 encodes and AP2 domain – containing transcriptional activator that binds to the C – repeat/DRE, a cis – acting DNA regulatory element that stimulates transcription in responses to low temperature and water deficit, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:1035.
  21. Jaglo – Ottosen, K. R., Gilmour, S. J., Zarka, D. G. et al., Arabodopsis CBF1 overaxpression induces cor genes and enhances freezing tolerance, Science, 1988, 280:104.
  22. Dure, L. et al., Common amino acid sequence domains among the LEA proteins of higher plants, Plant Mol. Biol., 1989, 12:475.
  23. Artus, N. N. et al., Constitutive expression of rhe cold – regulated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance, Proc. Narl. Acad. Sci. USA, 1996, 93:13404.
  24. Drews, G. N., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M., Negative regulation og the Arabidopsis homeotic gene AGAMOUS by the APETALA2 product, Cell, 1991, 65:991.