Курсовая работа: Витальный метод изучения половых клеток животных

СОДЕРЖАНИЕ

 

Аннотация……………………………………………………………………………………………………..2

Нормативные ссылки……………………………………………………………………………………..3

Определения………………………………………………………………………………………………….4

Обозначения и сокращения…………………………………………………………………………….5

Введение ……………………………………………………………………………………………………….6

1. Витальный метод изучения репродуктивных клеток животных……………………8
2. Извлечение эмбрионов………………………………………………………………………………15

2.1. Хранение эмбрионов………………………………………………………………………………16

3. Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного………………………………18

3.1. Капацитация сперматозоидов………………………………………………………………….21

3.2. Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий

развития эмбрионов………………………………………………………………………………………23

Техника безопасности ………………………………………………………………………………….25

Заключение ………………………………………………………………………………………………….26

Список использованной литературы………………………………………………………………27
Аннотация

 

Данная курсовая работа на тему: «Витальный метод изучения половых клеток животных» состоит из 27 листов, содержит 10 таблиц. В курсовой работе содержится:

• Аннотация
• Нормативные ссылки
• Определения
• Обозначения и сокращения
• Введение
• Основная часть
• Техника безопасности
• Заключение
• Список использованной литературы

Основная часть включает в себя:

• Витальный метод изучения репродуктивных клеток животных
• Извлечение эмбрионов
• Хранение эмбрионов
• Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного
• Капацитация сперматозоидов
• Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов

 

 

 

 

          Нормативные ссылки

 

Используются следующие нормативные ссылки:

ГОСТ 2.102-68 ЕСКД.

Виды и комплектность конструкторских документов.

ГОСТ 2.104-68 ЕСКД.

Основные надписи.

ГОСТ 2.201-80 ЕСКД.

Обозначение изделий и конструкторских документов.

ГОСТ 2.301-68 ЕСКД.

Форматы.

ГОСТ 2.601-95 ЕСКД.

Эксплуатационная документация.

ГОСТ 2.304-81 ЕСКД.

Шрифты чертежные.

ГОСТ 2.701-84 ЕСКД.

Схемы. Виды и типы. Общие требования к выполнению.

ФС ЮКГУ 4.6-002-2006. Система менеджмента качества. Фирменный стандарт. Правила оформления учебной документации. Общие требования к графическим документам.

ГК РК 94-99 Классификатор продукции по видам экономической деятельности (КПВЭД).

 

 

Определения

 

Витальный метод — это метод изучения репродуктивных клеток и эмбрионов животных без ущерба из жизнедеятельности.

Оплодотворение гамет — это процесс слияния сперматозоида с яйцеклеткой который приводит к кариогамии к зарождению нового индивида путем образования зиготы. 

Клетка — это ограниченная активной мембраной упорядоченная система биополимеров, участвующих  в единой совокупности метаболических и энергетических процессов, осуществляющих поддержание и воспроизведение всей системы в целом.

ФСГ — вызывает рост и созревание фоликулов в яичниках.

ЛГ — обеспечивает овуляцию, формирование желтого тела и стимулирует функцию молочной железы во время локтации.

Фоликул — соматическая клетка яичника, которые в комплексе обеспечивают развитие ооцита.
Обозначение и сокращения

 

сут — суток

% — процент 

⁰С — градус Цельсия

мм — миллиметры

и т.д. — и так далее

т.е. — то есть

мл — милилитр

мг — миллиграмм

ч — час

мин — минут

мкл — микролитр

мкг — микрокилограмм
Введение

 

Биология – это наука, которая в наши дни активно развивается и огромные надежды возлагаются именно на биотехнологии. Сейчас методы биотехнологии внедряются в промышленность, сельское хозяйство и медицину. Генетическая инженерия, клеточная инженерия и конечно клонирование наиболее актуальны в XXI веке и к сожалению в школе не в полной мере рассматривают эти темы. Я выбрал именно эту тему для своей работы так как хочется узнать больше о направлениях современной биологии.  

Биотехнология, использование живых организмов и биологических процессов в промышленном производстве. Развивается микробиологический синтез ферментов, витаминов, аминокислот, антибиотиков и т.п. Перспективно промышленное получение других биологически активных веществ (гормональных препаратов, соединений, стимулирующих иммунитет, и т.п.) с помощью методов генетической инженерии и культуры животных и растительных клеток.

Биотехнология (от греч. bios — жизнь, techne — искусство, мастерство и logos — слово, учение), использование живых организмов и биологических процессов в производстве. Биотехнология — междисциплинарная область, возникшая на стыке биологических, химических и технических наук. С развитием биотехнологии связывают решение глобальных проблем человечества — ликвидацию нехватки продовольствия, энергии, минеральных ресурсов, улучшение состояния здравоохранения и качества окружающей среды.

Скорость генетического улучшения, которая может быть достигнута в пле­менных программах повышения воспроизводительной способности живот­ных, имеет в настоящее время большое теоретическое и практическое зна­чение. 

В данное время возникает острая потребность изучения вопросов физи­ологии генетической изменчивости и биологических критериев воспроиз­водительных качеств у животных. Это сравнительно новое и быстро разви­вающееся направление в Генетике и биотехнологии животных. Выявление признаков, по которым можно предсказать генотип у животных по физиоло­гическим параметрам представляет большой научный интерес. Понимание механизма, контролирующего рост, развитие и созревание овулирующих фолликулов, оплодотворение гамет и эмбриональное развитие плода, мог­ло бы способствовать выявлению селекционных критериев генетического улучшения воспроизведения, что очень ценно для разработки новых приемов наследственно обусловленного повышения плодовитости животных. Селек­ционные аспекты разведения во многом определяются процессами, способ­ствующими регулированию биологических качеств животных. И не секрет, что одним из основных путей регулирования этих процессов является био­технология.

В основу методов биотехнологии легли теоретические разработки по ис­кусственному осеменению, гормональному регулированию воспроизводи­тельной функции, трансплантации эмбрионов у животных. Перспективы ис­пользования методов биотехнологии в практике разведения животных столь грандиозны, что уже сегодня в ряде стран эти исследования поставлены на коммерческую основу В зоотехнии по биотехнологии животных в данном направлении сделан огромный прогресс

«Биотехнология животных» состоит из четырех частей: основы лабораторного дела, эмбриотрансплантации, эмбриокультуры и эмбриоинженерии.

 

 

1. Витальный метод изучения репродуктивных клеток животных

 

Витальный метод изучения репродуктивных клеток и эмбрионов живот­ных основан на исследовании живой клетки. Для использования витального метода исследования репродуктивных клеток животных необходимо нали­чие питательной среды и микроскопа.

Питательная среда. После извлечения из репродуктивного тракта гаме­ты и эмбрионы помещаются в питательную среду (в «культуру»). При этом питательная среда должна полностью обеспечивать все внешние условия, которые имелись при условиях in vivo, так как только в этом случае возможно сохранение их жизнедеятельности, обеспечение факторов для созревания гамет, их оплодотворения и дальнейшего эмбрионального развития.

 

Ингредиенты, входящие в состав сбалансированного солевого  раствора Эрла для культивирования эмбрионов и ооцитов in vitro

 

Состав	Характеристика
EBS	Сбалансированный  солевой  раствор  Эрла,  в   10  — кратной концентрации, без бикарбоната натрия
Вода	Дистиллированная
Бикарбонат натрия	В виде раствора
Пируват натрия	Основной раствор 1,1 мг/мл
Пенициллин	600 мг/мл
Гентамицин	10 мг/мл
Гепарин	0,2 мл, содержащие 5000 ME.
БСА	—
HEPES	5,96 г/100 мл

 

Среда, обеспечивающая рост и развитие биологических систем благодаря наличию в своем составе компонентов, необходимых для нормальной жизнедея­тельности клеток, называется питательной (культуральной). По химическому со­ставу питательная среда, в среднем, состоит из 80-90% воды, 10-15% белка, 2% липидов, 1% углеводов, 1% нуклеопротеидов, 1 -1,5% неорганических веществ.

Основными требованиями при подготовке питательных сред являются растворимость компонентов, отсутствие токсичности и стабильность. При эмбриокультуральных исследованиях в животноводстве питательная среда выполняет следующие важные функции:

1. Обеспечивает питательными веществами, гормональными фактора­ми развития, ферментами, витаминами, транспортными белками, липидами, минеральными компонентами, так как они все в комплексе необходимы для нормальной жизнедеятельности клеток.
2. Создает физико-химические условия для полноценного развития (рН, осмолярность).

Среды можно приобрести в готовом виде. Выпускаются они в жидком виде (в десятикратной концентрации), или в форме порошка (EBS, F10). Од­нако многие исследователи готовят среды самостоятельно, поскольку это дает возможность контролировать каждый ингредиент.

 

Среда для промывания фолликулов и работы с эмбрионами

 

Состав	Процедура
А. Для приготовления 400 мл EBS, забуференного HEPES без антибиотика
Пируват натрия	1,1 мг/мл
1 Бикарбонат натрия	0,1348 г растворить в 20 мл волы
EBS	В 295 мл воды добавить 40 мл EBS, 1.1 мг/мл пиру-вата натрия; затем медленно (для предотвращения образования осадков) пипеткой добавить раствор бикарбоната натрия, осторожно встряхивая. Полу­ченный раствор должен быть прозрачным.
HEPES	Ввести 33,6 мл
Проверить режим полученной среды: осмолярностъ, рН, t.
В. Среда для получения ооциток
Гепарин	350 мкл гепарина добавить к 3S0 мл EBS. забуференного HEPES. Стерилизовать миллипоровой фильтрацией.
С. Приготовление среды для переноса эмбрионов
Сыворотка	2 мл инактивированной нагреванием сыворотки добавить к 18мл HEPES. Стерилизовать фильтраци­ей.

 

В лабораторных условиях питательные среды готовят в 1 -литровом объеме. При этом ингредиенты растворяют примерно в 700 — 800 мл воды. Соли раство­ряют в той последовательности, что приведено в рецепте. После окончания про­цедур, связанных с растворением ингредиентов, объем раствора доводят до 1л и, после чего, проводят его стерилизацию под давлением через миллипоровые фильтры или автоклавированием (1 атм, t =115⁰С; в течение 20 — 35 мин.). После охлаждения через раствор бикарбоната натрия пропускают СО₂. Сыворотка, бел­ковые добавки (например, инсулин и др. гормоны) хранятся при температуре минус 20⁰С и добавляются непосредственно перед использованием.

В зависимости от химического состава различают три категории сред:

1. Среды с сывороточными добавками. Клетки выращиваются в основном среде содержащей небольшое количество сыворотки и обобщенной сывороточными добавками.
2. Среды с заменителями сыворотки. Клетки выращиваются в основной среде, в которую добавлены определенные заменители сыворотки.
3. Бессывороточные, которые, в свою очередь, подразделяются на три подгруппы:

а) простые (белки отсутствуют);

б) специальные (содержат очищенные бел­ки, гормоны, ферменты, витамины);

с) неопределенные (экспериментальные среды, в составе которых имеются «неопределенные» биологические добавки).

 

Среда для оплодотворения in vitro

 

Ингредиент	Процедура
А. Для получения 100 мл исходного раствора EBS. забуференного бикарбонатом
Пируват натрия	Основной раствор 1,1 мг/мл
Бикарбонат натрия	0,21 г растворить в 10 мл волы
EBS	К 10 мл десятикратного раствора добавить 77 мл воды, пируват натрия: после чего медленно внести с помощью пипетки раствор бикарбоната натрия, осторожно встряхивая (важное условие — раствор должен получиться прозрачным)
Антибиотики	Добавить 10 мкл раствора пенициллина и 0,2 мл раствора гентамицина
В. Приготовление среды для оплодотворения in vitro
БСА	0,4 г + 80 мл EBS и оставить для естест­венного постепенного растворения. Профильтровать через миллипоровые фильтры.

 

Среда для культивирования эмбрионов

 

EBS	0,4 мл + 0,4 мл инактивированной сыворотки. Про­фильтровать через миллипоровые фильтры. Использовать по 100-500 мкл под маслом для культивиро­вания эмбрионов, начиная со стадии пронуклеусов.

 

Приготовление сыворотки материнской крови

 

Ингредиент	Процедура
Кровь	10-15 мл Центрифугировать немедленно в настольной центрифуге 5-10   мин.   при   1000 g.   Воспользовавшись   пастеровской пипеткой перенести плазму в стерильную пластиковую пробирку. Оставить пробирку с плазмой для свертывания. Убрать фибриновый сгусток. Инактивировать нагреванием в водяной бане при 560С в течение 30 мин. Профильтровать. Остаток можно заморозить.

 

Среды, в составе которых компоненты, необходимые для поддержания жизни, роста и развития сведены до минимума, относят к минимальным.

Среди биологических сред наибольшее распространение получила сы­воротка, т.к. она пригодна для культивирования клеток вне организма. Добавление 5 — 20% (по объему) сыворотки все еще остается необходимым для поддержания роста и развития клеток.

В питательной среде сыворотка выполняет следующие функции: служит буфером для лабильных и водонерастворимых питательных веществ; нейт­рализатором токсинов; поставщиком гормонов, пептидных факторов роста, незаменимых питательных низкомолекулярных веществ и, кроме того, сы­воротка обладает защитным эффектом.

В зависимости от назначения питательные среды также делят на четыре группы:

1) среды, используемые для культивирования гамет (среда Хэнкса, Тироде);

2) среды, используемые для оплодотворения гамет (среда Т6, ра­створ Кребса-Рингера);

3) среды, используемые для культивирования эмб­рионов (среда Виттена);

4) среды используемые для замораживания гамет и эмбрионов.

Основной режим питательной среды для культивирования гамет и эмб­рионов должен быть следующим.

1) осмотическое давление находится в пределах 280-290 мОсмоль/л. Если клетку содержать в среде с превышающим ее уровень осмотическим давлением -она будет сжиматься и сморщиваться, если же наоборот- клетка будет набухать и разрываться.

2) температура считается оптимальной в пределах 37-37,5⁰С.

3) рН находится в пределах 7,2 (при культивировании) и 7,4 (при опло­дотворении).

4) наличие в воздухе 5% СС^, а в смеси — 5% кислорода, 90% азота, 5% углекислого газа (для этой цели среду необходимо эквилибрировать).

 

Состав-основных питательных сред

 

№	Компонент	Среда, г/л
		Т6		Виттена		РВ1
1	NaCl	5,719		4,140		8000
2	KCL	0,106		0,356		0,200
3	MgCl2H2O	0,096		—		—
4	Na2HPO412 H2O	0,129		—		2,898
5	СаС122 H2O	0,262		—		0,132
6	КН2РО4	—		0,162		0,200
7	MgSO4H2O	—		0,294		—
8	NaHCO3	2,101				—
Добавки (вводятся непосредственно перед работой)
	Лантат натрия	2,791		6,235		—
	Пируват натрия	0,052		0,036		0,036
	Лактат кальция	—	0,527		—
	Глюкоза	1,0	1,0		1,0
	БСА	—	3,0		3,0
	Стрептомицин	0,050	0,05		—
	Пенициллин	0,060	0,075		0,060
	Феноловый красный	0,010	—		0,010

 

Микроскоп. Устройство оптических приборов основано на законах преломления и отражения света, которые известны из курсов физики. На этом останавливаться здесь мы не будем и ограничимся только кратким описани­ем частей микроскопа.

Оптическая система микроскопа, составляющая его основу, представ­лена двумя системами линз:

а) объектив — обращен к объекту, дает изобра­жение увеличенное, но обратное;

б) окуляр — обращен к глазу исследовате­ля, увеличивает изображение, но делает его мнимым, оставляя обратным

Таким образом, в результате совместного действия обеих систем линз изображение получается увеличенное, обратное и мнимое. Объектив и оку­ляр заключены в металлическую трубку — тубус, нормальная длина которого равна 160 мм. Современный микроскоп имеет несколько объективов с раз­ным увеличением. Они закреплены в металлической оправе, называемой револьвером.

Помимо оптической системы, в микроскоп входят зеркало, предметный столик и осветитель. Зеркало помещается в нижней части штатива микроско­па Оно служит для отражения лучей, падающих на него от источника света, в сторону исследуемого объекта. С одной стороны зеркало вогнутое, с другой -плоское. Для более интенсивного освещения пользуются вогнутым зеркалом. Предметный столик служит для помещения на нем исследуемого объек­та. Через отверстие в середине столика проходит пучок лучей, отбрасывае­мый зеркалом. Пройдя через объект, они попадают в объектив. Освещение можно регулировать увеличением или уменьшением отверстия в столике. Это достигается при помощи диафрагмы, которая укрепляется с нижней сто­роны предметного столика

Осветитель — конденсор предназначен для усиления света Он состоит из линз, которые собирают лучи, отбрасываемые от зеркала, и концентри­руют их на исследуемом предмете. Помещается конденсор между зеркалом и предметном столиком.

Замечательным орудием современного научного исследования, позволяющим более точно изучать строение живого вещества клеток и тканей, яв­ляется электронный инвертированный микроскоп. Если оптический микроскоп позволяет получить увеличение исследуемого объекта в несколько ты­сяч раз, то электронные инвертированные микроскопы могут давать увеличения в десятки — сотни тысяч раз. Принцип действия электронного микроскопа схож со световым микроскопом. В электронном микроскопе пучок световых лучей также направляется линзой конденсатора через образец, а полученное изображение уве­личивается с помощью линз.

Таким образом, световые бинокулярные и электрические инвертированные микроскопы позволяют видеть живые клетки, а питательная среда — сохраняет жизнедеятельность репродуктивных клеток животных in vitro. Поэтому для кратковременного наблюдения за клетками их помещают в жидкую сре­ду на предметное стекло или чашку Петри. При длительном наблюдении за клетками пользуются специальными камерами — это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же плоские разборные ка­меры. В качестве объектов можно использовать гаметы и эмбрионы живот­ных, при этом их изучают в специально подобранных средах.

Наблюдения за гаметами и эмбрионами обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроско­пу. Живые клетки можно снимать и на видеокамеру.

 

 

 

Сравнение светового и электронного микроскопов

(показатели усреднены)

 

Показатель	Электронный микроскоп	Световой микроскоп
Источник излучения	Электроны	Свет
Длина волны	0,005 нм при 50 кВ	400-700 нм
Полезное максималь­ное увеличение	250000 (на экране)	х 150
Максимальное разрешение	0,5 им	200-500 нм
Линзы	Электромагниты	Стеклянные
Объект	Не живой, обезвоженный  относительно маленький  или тонкий, удерживается на маленькой сетке в вакууме (трансмиссионный микроскоп). Живой, который лежит в чашках Петри и предназначен для различных микроманипуляций (инвертированный микроскоп)	Живой или неживой.  Обычно лежит на  предметном стекле.
Распространенные красители	Содержат тяжелые метал­лы, которые отражают электроны (трансмиссионный микроскоп)	Цветные красители
Изображение	Обычно черно-белое	Обычно цветное

 

В ряде случаев такая микрокиносъемка дает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку, можно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, слияние кле­ток, т.е. оплодотворение и т.д. В настоящее время широко практикуется кон­струкция, состоящая из микроскопа и компьютера, при программном обес­печении которого исследователь получает полную информацию от любого биологического объекта.

Особенности витального метода изучения репродуктивных клеток в биотехнологии следующие:

1. Возможность проведения фундаментальных исследований с целью изучения таких биологически неповторимых и уникальных процессов как разви­тие гамет и их оплодотворение, развитие предимплантационных эмбрионов.
2. Возможность регулирования биологических процессов in vitroc помощью различных факторов развития.
3. Возможность «конструирования» на уровне молекул, ядер или клеток с целью получения организмов, обладающих особым генотипом.
4. Возможность регулирования процессов репродукции с целью влия­ния на популяцию животных.

 

 

2. Извлечение эмбрионов

 

Эмбрионы крупного рогатого скота посту­пают из яйцевода в матку между 4-м и 5-м днем после начала охоты (меж­ду 3-м и 4-м днем после овуляции), хотя у суперовулировавших коров не­большая часть эмбрионов остается в яйцеводе до 7-го дня. Сроками про­движения эмбрионов в половом тракте коровы и определяется извлече­ние их из яйцевода или рогов матки.

В связи с тем, что нехирургическое извлечение возможно только из рогов матки, то эмбрионы извлекают не ранее 5-го дня после начала охоты.

Несмотря на то что при хирургическом извлечении эмбрионов у круп­ного рогатого скота достигнуты отличные результаты, этот метод неэф­фективен — относительно дорогостоящий, неудобный для применения в условиях производства.

Нехирургическое извлечение эмбрионов состоит в следующем. Гибкий катетер с надувной манжеткой вводят во влагалище и через шейку матки в один из рогов матки. Манжетка надувается и закрывает каудальный выход рога матки, тем самым ограничивая промывную по­лость. Катетер может быть двухканальным, что позволяет проводить про­точное прохождение промывной жидкости. При использовании одноканального катетера промывная жидкость вводится несколько раз (5-8 раз) и затем вытекает из рога матки. В обоих случаях вводят 200-300 мл фосфатного буфера Дюльбекко.

Наиболее оптимальные сроки для извлечения эмбрионов — 6-8-й день после начала охоты, так как ранние бластоцисты этого возраста наи­более пригодны для глубокого замораживания и могут быть с высокой эффективностью пересажены нехирургическим способом. Корову-доно­ра используют 6-8 раз в год, извлекая по 3-6 эмбрионов.

У овец и свиней нехирургическое извлечение эмбрионов невозможно ввиду трудности прохождения катетера через шейку в рога матки. Одна­ко хирургическая операция у этих видов животных относительно проста и непродолжительна. Доступ к репродуктивному тракту осуществляется лапаротомией по белой линии живота. У свиней 1-, 2- и 4-клеточные эм­брионы извлекают из яйцеводов в течение 40 ч после овуляции. При этом стеклянную канюлю вставляют в истмус через маленькое отверстие в верхушке рога матки. Через канюлю вводят 20—30 мл промывной жидкости и собирают ее из ампулярного конца яйцевода в чашку Петри. Для извлечения эмбрионов из матки промывают яйцевод и верхушку рога матки. Рог матки пережимают и канюлю вставляют в рог матки. Обычно для вымывания используют среду Дюльбекко с лактатом, пируватом и бычьим сывороточным альбумином. Эмбрионы свиней можно извлекать до 12-го дня после начала охоты. Эффективность извлечения эмбрионов обычно высокая (около 95 %). Можно делать 3-4 операции на одном животном.

При извлечении эмбрионов у овец в ампулярный конец яйцевода вво­дят стеклянную или полиэтиленовую канюлю и промывают из рога матки в яйцевод. Независимо от времени вымывания поле охоты эффектив­ность извлечения эмбрионов составляет около 80%.

 

 

2.1. Хранение эмбрионов.

 

Применение метода трансплантации эмбрио­нов потребовало разработки эффективных методов их хранения в период между извлечением и пересадкой. В производственных условиях эмбрио­ны обычно извлекают утром, а пересаживают в конце дня. Для хранения эмбрионов в течение этого времени используют фосфатный буфер с неко­торыми модификациями при добавлении эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и при комнатной температуре или температуре 37°С.

Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 24 ч без заметного снижения их после­дующей приживляемости.

Пересадка эмбрионов свиней, культивируемых 24 ч, сопровождается нормальной приживляемостью.

Выживаемость эмбрионов в определенной степени может быть увеличена охлаждением их ниже температуры тела. Чувствительность эмбрионов к охлаждению зависит от вида животного.

Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на ранних стадиях развития после охлаждения их ниже 10-15°С (С. Полдж, 1982).

Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития так же очень чувствительны к охлаждению до 0°С. Однако на более поздних стадиях развития, таких как морула или бластоциста, они хорошо выдер­живают охлаждение.

Эмбрионы овец хорошо переносят охлаждение до 0°С на любых стадиях развития, от одно-, двухклеточной стадии до бластоцисты. Понижение температуры хранения эмбрионов от 37°С до 10° и 0°С угнетает или останавливает их развитие, но обменные процессы протекают на уровне, обеспечивающем хранение до 5-6 сут. Для длительного хранения эм­брионов необходимо не только затормозить их развитие, но и значитель­но снизить или полностью остановить обменные процессы. Такое состоя­ние эмбрионов достигается при температуре — 195°С или ниже.

Эксперименты последних лет позволили определить оптимальные соотношения между скоростью охлаждения и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено, что если эмбрионы охлаждают медленно (1°С/мин) до очень низкой температуры (ниже — 50°С) с после­дующим переносом в жидкий азот, то они требуют и медленного оттаива­ния (25°С/мин или медленнее). Быстрое оттаивание таких эмбрионов мо­жет вызвать осмотическую регидратацию и разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1 °С/мин) только до — 25  и 40°С с последующим переносом в жидкий азот, то их можно оттаивать очень быстро (300°С/мин). В этом случае остаточная вода при переносе в жидкий азот трансформируется в стекловидное состояние (С. Вилладсен,  1980).

Выявление этих факторов привело к упрощению процедуры замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. В частности, оттаивают эмбрионы, как и сперму, в теплой воде при 35°С в течение 20 с непосредственно перед пересадкой без применения специального обору­дования с заданной скоростью повышения температуры.

В последние годы установлено, что замороженные и оттаявшие эм­брионы могут быть успешно разбавлены одноступенчато в пайете, где они были заморожены. Сущность метода состоит в следующем. Замороженно-оттаянные эмбрионы переносят одноступенчато из раствора крио­протектора, в частности 1,5 М глицерина в фосфатном буфере, в котором они были заморожены, в среду, содержащую гипертонический раствор не проникающего в клетку соединения, каким является сахароза. Это обес­печивает постепенное удаление криопротектора из эмбриона без наруше­ния осмотического равновесия в 0,02 мл 1,5 М глицерина.

С помощью воздушных пузырьков пайету делят на три камеры: в пер­вой — раствор криопротектора; во второй — эмбрион в растворе крио­протектора; в третьей — растворитель (1,08 М раствор сахарозы). После замораживания и оттаивания содержимое пайеты перемешивают встря­хиванием. Затем эмбрион может быть пересажен из пайеты нехирургиче­ским способом реципиенту. Этот метод позволяет пересаживать замороженно-оттаянные эмбрионы по типу искусственного осеменения. Срав­нение методов одноступенчатого и многоступенчатого оттаивания эм­брионов показало, что оба они дают одинаковые результаты.

Успешное замораживание и оттаивание эмбрионов овец впервые было проведено С. Вилладсен и др. (1974). Эмбрионы медленно охлажда­ли (от 0,3 до 2,0°С/мин) и медленно оттаивали (от 4 до 25°С/ мин). В каче­стве криопротектора применяли ДМСО.

 

 

 

3. Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного

 

Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне организма животного (in vitro) имеет огромное значение в решении ряда научных задач и практических вопросов, направленных на повышение эффективности разведения жи­вотных.

Система оплодотворения in vitro может быть использована прежде всего как ценный аналитический инструмент для изучения биохимиче­ских и физиологических факторов, включающихся в процесс оплодотворения, соединения мужской и женской гамет. Только с освоением техники оплодотворения вне организма появилась реальная возможность для,; широкого развертывания исследований по генной и клеточной инженерии и особенно сельскохозяйственных животных. Для этих целей необходимы эмбрионы на ранних стадиях развития, которые можно извлечь, только хирургическими методами из яйцеводов, что является трудоемким и не дает достаточного числа зародышей для проведения этой работы. К тому же существующие методы гормональной регуляции воспроизводительной функции у сельскохозяйственных животных не позволяю достичь высокой точности контроля времени овуляции и вследствие этого получить достаточное число эмбрионов на желаемой стадии развития. Методы клеточной и генной инженерии на животных предусматривают также проведение длительных манипуляций с гаметами и эмерионзми вне организма. Все эти проблемы могут быть решены в значительной сте­пени с использованием системы оплодотворения яйцеклеток млекопи­тающих вне организма.

Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает следующие основные этапы: созревание ооцитов, капацитацию спермато­зоидов, оплодотворение и обеспечение ранних стадий развития.

Созревание ооцитов in vitro. Большое число половых клеток в яич­никах млекопитающих, в частности у крупного рогатого скота, овец и свиней с высоким генетическим потенциалом, представляет источник ог­ромного потенциала воспроизводительной способности этих животных в ускорении генетического прогресса по сравнению с использованием воз­можностей нормальной овуляции. У этих видов животных, как и других млекопитающих, число ооцитов, овулирующих спонтанно во время охо­ты, составляет только незначительную часть от тысяч ооцитов, находя­щихся в яичнике при рождении животного. Остальные ооциты регенери­руют внутри яичника или, как говорят обычно, подвергаются атрезии. Естественно возникал вопрос, нельзя ли выделить ооциты из яичников путем соответствующей обработки и провести их дальнейшее оплодотво­рение вне организма животного. В настоящее время не разработаны мето­ды использования всего запаса ооцитов в яичниках животных, но значи­тельное число ооцитов может быть получено из полостных фолликулов для дальнейшего их созревания и оплодотворения вне организма.

Известно, что после выделения ооцита из фолликула, как и после вы­броса эндогенного ЛГ в организме животного перед овуляцией, ооцит ос­вобождается из состояния мейотического торможения, что сопровожда­ется так называемым разрывом зародышевого пузырька. В организме крупного рогатого скота разрыв зародышевого пузырька происходит примерно через 5 ч после выброса ЛГ, ооцит достигает метафазы I через 12 ч и метафазы II через 24-25 ч. Вне организма ядерная мембрана заро­дышевого пузырька крупного рогатого скота также исчезает через 5-6 ч, через 12 ч хромосомы достигают метафазы I и через 20-24 ч — метафа­зы II.

Хотя большинство ооцитов, извлеченных из фолликулов яичников, возобновляют мейоз и достигают метафазы II, оплодотворение их часто не обеспечивает полноценного развития зародышей. Предполагают, что основной причиной этого является неполноценное созревание ооцитов. Одной из причин может быть то, что при созревании ооцита in vitro в ци­топлазме не вырабатывается в достаточной мере фактор, контролирую­щий формирование и развитие мужского о пронуклеуса. Считают, что для появления в цитоплазме ооцита фактора, вызывающего созревание муж­ского пронуклеуса, необходимо обеспечить индуктивное влияние нор­мального окружения ооцита в фолликуле в течение не менее 6 ч после на­чала мейотического созревания.

 

Временные  параметры проявления стадий  мейоза ядра  ооцитов разных видов животных  на предовуляторный  выброс гонадотропинов

 

Вид животного	Латентный период после стимуляции, ч	Стадии мейотического созревания, ч
		метафаза 1	анафаза	телофаза	метафаза II
Корова Овца Свинья	10-12 10-11 17-18	14-21 12-20 26-34	22 21 35	23 22 36	24 24 37

 

Это было подтверждено в опытах по оплодотворению in vitro ооцитов свиней, извлеченных из фолликулов на разных стадиях мейоза. С прогрессированием стадии развития в момент извлечения ооцита из фолли­кула повышался процент нормально оплодотворенных зародышей: нор­мальное оплодотворение имело место у 31,7; 51,6 и 78,2 % культивируе­мых ооцитов со стадии зародышевого пузырька, диакинеза и метафазы I соответственно.

Установлено, что стероидные гормоны не требуются для запуска мей­оза у млекопитающих, но необходимы для полного физиологического со­зревания ооцита.

В связи с тем что стероидные гормоны и другие факторы, вырабатываемые фолликулярными клетками, оказывают влияние на созревание ооцитов, было сделано предположение, что культивирование ооцитов с фолликулярными клетками может повысить их способность к нормаль­ному оплодотворению и последующему эмбриональному развитию. Многие явления внутри фолликула, включая биосинтез стероидов и син­тез белков, регулируют гонадотропные гормоны. Поэтому при культиви­ровании ооцитов внутри фолликулов или с фолликулярными клетками гонадотропины должны быть обязательной составной частью среды.

Необходимость прямого контакта между соматическими (фолликулярными) клетками и половыми клетками обусловлена целым рядом при­чин. Фолликулярные клетки играют важную роль в питании ооцита. Они обеспечивают энергетический субстрат ооциту, участвуют в переносе некоторых предшественников аминокислот, нуклеотидов и фосфолипидов в ооцит, генерируют инструктивные сигналы, которые влияют на ядро и прямой синтез определенных структурных белков. Инструктивные сиг­налы, требуемые для созревания ооцитов, как было показано выше, наи­более важны в первые         6-8 ч после-инициации.

В настоящее время применение на практике нашло созревание in vitro только ооцитов крупного рогатого спела. Ооциты получают из яичников коров после убоя животных и путем прижизненного извлечения, 1-2 раза в неделю. В первом случае яичники берут от животных после убоя, доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере в течение 1,5-2,0 ч. В лаборатории яичники дважды промывают свежим фос­фатным буфером. Ооциты извлекают из фолликулов, диаметр которых 2-6 мм, путем отсасывания или разрезания яичника на пластинки. Ооци­ты собирают в среду ТСМ 199 с добавлением 10% сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro только ооциты с компактным кумулюсом и однород­ной цитоплазмой.

В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или ла­пароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр кото­рых не менее 2 мм, 1-2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 5-6 ооцитов на животное. Менее 50% ооцитов пригодны для созревания in vitro.

Несмотря на низкий выход ооцитов, при каждом извлечении возмож­ность многократного использования животного, с учетом информации о происхождении полученных ооцитов, открывает новые перспективы применения метода оплодотворения in vitro в практических целях.

Отобранные ооциты с компактным кумулюсом созревают в течение 24 ч в среде ТСМ 199 с добавлением 20 %-ной обработанной теплом сы­воротки крови от коровы в охоте, гранулезных клеток (3 — 5 · 10⁶ клеток в 1 мл) и небольшого количества антибиотиков (50 и.е. пенициллина, 50 мкг стрептомицина на 1 мл). Гранулезные клетки собирают из среды, в которой ооциты отделяют от фолликулов и центрифугируют дважды по 5 мин при 500g. Осадок гранулезных клеток суспендируется в среде для созревания. Сокультивирование ооцитов и гранулезных клеток проводят при 38,5°С в атмосфере 5 % СО₂ в чашках Петри в 2 мл среды.

3.1. Капацитация сперматозоидов.

 

Важным этапом в разработке метода оплодотворения у млекопитающих было открытие явления капацитации спермиев. Установили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том слу­чае, если спермин в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдениях по изучению проник­новения спермиев яйцеклетки крысы в различные сроки после спарива­ния Аустин ввел термин капацитации. Он означает, что в спермин долж­ны произойти некоторые физиологические изменения до того, как сперматозоид приобретет способность к оплодотворению.

В последующих исследованиях в лаборатории были не только определены оптимальные условия капацитации спермиев в поло­вом тракте самки, но и продемонстрирована возможность декапацитации спермие» кролика, извлеченных из матки, обработанной семенной плаз­мой кролика, человека и быка, рекапацитации этих спермиев при внесе­нии их в яйцеводы и, наконец, удаления декапацитирующего фактора из семенной  плазмы центрифугированием.

Капацитация включает начальное изменение мембраны спермия, что позволяет ему пройти вторую фазу (акросомную реакцию), а также слия­ние плазменной и внешней акросомной мембран. В настоящее время пер­вую фазу обозначают как собственно капацитацию, а вторую — как акро­сомную реакцию.

Показано, что у спермиев крупного рогатого скота происходит акросомная реакция исключительно в ампуле яйцевода, расположенной ипсилатериально к стороне яичника с овуляцией, и только во время или непо­средственно после овуляции. Эти наблюдения дают основание предпола­гать, что капацитация происходит преимущественно в яйцеводе, распо­ложенном на той же стороне, что и яичник с овулирующим фолликулом. Установлено также, что содержимое, извлеченное из яйцевода во время эструса, но не в лютеиновую фазу полового цикла у овец, вызывает капа­цитацию и акросомную реакцию спермиев быка.

Глюкозоаминоглюканы in vitro вызывают акросомную реакцию или капацитацию бычьих эпидидимальных спермиев. При анализе глюкозоаминоклюканов в смывах яйцеводов крупного рогатого скота выявлена концентрация гепариноподобного материала.

В опытах in vitro установлено, что гепарин — наиболее потенциаль­ный глюкозоаминоглюкан по способности взывать акросомную реакцию у эпидидимальных спермиев быка и капацитацию эякулированных спер­миев.

В организме коровы все спермин, прикрепленные к прозрачной обо­лочке, были с акросомной реакцией. Кроме того, с помощью электронной микроскопии обнаружено, что спермин быка, найденные в окружении и непосредственно в кумулюсной массе, в яйцеводе сохранили акросомы в полном объеме и только спермин, прикрепленные к прозрачной оболоч­ке, имели акросомную реакцию. Эти данные свидетельствуют о том, что спермин быка капацитируются в яйцеводе, а оплодотворяющий спермий завершает акросомную реакцию около или в прозрачной оболочке.

Разработано несколько методов капацитации эякулированных спермиев домашних животных. Для удаления белков с поверхности спермиев, которые, по-видимому, тормозят капацитацию спермиев, была использо­вана среда с высокой ионной силой.

Однако наибольшее признание получил способ капацитации сперматозоидов с использованием гепарина (Дж. Парриш и др., 1985). Пайеты с замороженным семенем быка оттаивают в водяной бане при 39°С в тече­ние 30-40 с. Примерно 250 мкл оттаянного семени подслаивают под 1 мл среды для капацитации. Среда для капацитации состоит из модифицированной среды Тиройда, без ионов кальция. После инкубации в течение одного часа верхний слой среды объемом 0,5-0,8 мл, содержащий большинство подвижных сперматозоидов, удаляют из пробирки и про­мывают дважды центрифугированием при 500 g в течение 7-10 мин. По­сле 15 мин инкубации с гепарином (200 мкг/мл) суспензию разбавляют до концентрации 50 миллионов сперматозоидов в мл.

В Биотехцентре (Н.М. Сураева) было показано, что концентрация спермиев при всплывании стабилизируется уже в первые 5 мин и не меня­ется в течение последующего часа.

 

Эффективность всплывания спермиев в зависимости

от продолжительности инкубации

 

Продолжнтельность инкубации, мин	Число опытов	Число спермиев в 1 мл
5	5	(3,3 ± 0,46) · 106
15	6	(3,8 ±0,53) · 106
30	5	(1,0 ±0,75) · 106
45	5	(2,8 ±0,72) · 106
60	6	(3,0 ±0,41) · 106

 

Таким образом, можно значительно сократить продолжительность всплывания с 45-60 до 5-15 мин, что, в свою очередь, ускоряет, а значит, и облегчает оплодотворение. Были проведены опыты по оплодотворению вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота спермой, подвергшейся процедуре всплывания в течение 15 и 60 мин. Эксперименты с использованием двух интервалов инкубации показали, что продолжительность инкубации заметно не влияет на эффективность дробления оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогато­го скота.

Полученные результаты открывают перспективы повышения выхода живых спермиев из одной дозы размороженной спермы, так как появи­лась возможность проведения процедуры всплывания спермиев с одним и тем же осадком несколько раз без потери их жизнеспособности.

Используя прием многократной смены среды, можно в несколько раз (в наших опытах в пять раз) увеличить эффективность использования од­ной порции эякулята, что особенно важно при применении спермы от высокоценных быков-производителей.

 

 

3.2. Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов.

 

Оплодотворение яйцеклеток у млекопитающих осуществля­ется в яйцеводах. Это затрудняет доступ исследователя к изучению усло­вий среды, в которой происходит процесс оплодотворения. Поэтому сис­тема оплодотворения in vitro была бы ценным аналитическим инструмен­том для изучения биохимических и физиологических факторов, вклю­чающихся в процесс   успешного  соединения гамет. Более того, предполагалось, что эта система найдет применение в технологии разве­дения животных.

Крупный рогатый скот. Применяют следующую схему оплодотворения in vitro и культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Оплодотворение in vitro проводят в капле модифициро­ванной среды Тироида. После созревания in vitro ооциты частично очи­щают от окружающих экспандированных кумулюсных клеток и перено­сят в микрокапле по пять ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов объемом 2-5 мкл добавляется к среде с ооцитами, чтобы достичь кон­центрации сперматозоидов в каплях 1-1,5 млн/мл. Через 44-48 ч после осеменения определяют наличие дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают на монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.

Овцы. Оплодотворение у овец исследовали двумя путями: in vitro и введением фолликулярных ооцитов в яйцевод осемененной овцы. Как и у крупного рогатого скота, число оплодотворенных яйцеклеток было боль­ше в том случае, когда фолликулярные и овулировавшие ооциты помеща­ли в яйцевод со спермиями. При использовании системы оплодотворения in vitro таких клеток было меньше.

Ооциты культивировали в среде ТСМ 199 с 10 %-ной инактивированной фетальной сывороткой с добавлением гонадотропинов (ЛГ и ФСГ) и эстрадиола— 17_β. Затем ооциты оплодотворяют in vitro эякулированны­ми спермиями, капацитированными в течение 8 ч в модифицированной среде ДМ с добавлением 10 мМ буфера Хепеса. Хирургическим путем пе­реносят 2-4-клеточные эмбрионы в яйцеводы ложнобеременным кроли­кам. Через три дня ооциты из яйцевода кролика извлекают и пересажива­ют в матку постоянного реципиента.

Свиньи. К настоящему времени не известны какие-либо данные об оплодотворении in vitro ооцитов свиней. Вместе с тем некоторые ис­следователи наблюдали проникновение спермиев в ооциты свиней после созревания их in vitro и пересадки осемененной эстральной свиньи, но ни один ооцит не продолжал развитие и у многих из них проявилась поли­спермия.

Другие авторы сообщили о нормальном оплодотворении и развитии в аналогичной системе ооцитов, полученных из яичников свиней, обработанных ХГ за 12 ч до ожидаемой овуляции. Можно полагать, что только после полного созревания ооцита в организме животного происходит блокирование полиспермии, нормальное оплодотворение и дальнейшее развитие эмбрионов этого вида.

Более успешные результаты достигнуты при культивировании ранних эмбрионов свиней in vitro. Так, после 48 ч культивирования 1-4-клеточных эмбрионов свиней и последующей их хирургической пересадки были получены беременности у двух из 13 свиней. После культивирования 8-клеточных эмбрионов в течение 48 ч до стадии бластоцисты и затем пересадки 19 свиньям-реципиентам 10 животных были беременны во время убоя через 21 день, но только 51 из 229 эмбрионов были представ­лены живыми плодами.

 

 

Техника безопасности

 

Безопасность может быть биологической, экологической, экономиче­ской, продовольственной, военной и другой — в зависимости от факто­ров, масштабы, направленность и степень воздействия которых угрожа­ют деятельности, существованию и самой жизни объектов — человека.

Биобезопасность стала одной из важнейших проблем безопасности человека, общества, государства и цивилизации в целом. Под биобезопас­ностью понимается защищенность человека, общества, цивилизации, и окружающей среды от вредного воздействия, опасного для жизни и здо­ровья людей токсичных и аллергенных биологических веществ и соеди­нений, содержащихся в природных или генно-инженерно-модифицированных биологических объектах и полученных из них продуктов. Биоло­гически опасные организмы и их продукты представляют собой угрозу для существования не только человека, но и для растений, животных и полезных микроорганизмов, вызывая различную степень их поражения или гибель, лишая человека продовольственных и других источников и возможностей существования.

Во всех государствах мира разработаны различные методы контроля за технологическими процессами и качеством вновь вовлеченных в сферу использования человеком новых биологических объектов и веществ, их токсичностью, аллергенностью и общей безопасностью для здоровья лю­дей и состояния окружающей среды.

Большую опасность для здоровья и жизни людей до сих пор представляют ядовитые грибы.
Заключение

 

Витальный метод изучения репродуктивных клеток и эмбрионов  животных основан на исследовании живой клетки. Для использования витального метода исследования репродуктивных клеток животных необходимо наличие питательной среды и микроскопа. Питательная среда должна полностью обеспечивать все внешние условия, которые имелись при условиях in vivo, так  как только в этом случае возможно сохранения их жизнедеятельности, обеспечение факторов для созревания гамет, их оплодотворения и дальнейшего эмбрионального развития.

Изучение и освоение методов биотехнологии возможно на лабораторных животных биотехнологический эксперимент в животноводство, в свою очередь, предполагает применение методов эмбрионализации, эмбриокультуры и эмбриоинженерии.

Витальный метод включает изучение таких уникальных процессов как развитие гамет их оплодотворение, развития предимплантационных эмбрионов, возможность регулирование биологических процессов  in vitro с помощью различных факторов развития, регулирование процессов репродукции с целью влияние на популяцию животных, конструирования на уровне молекул, ядер или клеток с целью получения организмов, обладающих особым генотипом.
Список использованной литература

 

1. Джамалова Г.А. Биотехнология воспроизводства животных с основами эмбриоинженерии. А.1996.
2. Завертяев Б.П. Биотехнология. 1989.
3. Бегимкулов Б.К. Молекулярная генетика с основами биотехнологии. А. 1996.

1. Лакин Г.Ф. Биотехнология. М. 1997.