Әл – Фараби атындағы Қазақ Ұлттық Университеті

 

Биология факультеті

Генетика және молекулалық биология кафедрасы

 

 

 

    БIТIРУ ЖҰМЫСЫ

 

Азот тотығының бидай алейрон клеткаларының программаланған өліміне әсері.

                                                                 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РЕФЕРАТ

 

Бiтiру жұмысы  30 беттен, 4 суреттен, 2 кестеден және 77 сiлтеме әдебиеттерден тұрады.

          Жұмыстың мақсаты: Азот тотығының бидай алейрон клеткаларының программаланған өліміне әсер ету ерекшеліктерін зерттеу.

Жұмысты жасау үшiн объект ретiнде: Қазақстан 4 сортты гексаплоидты бидайдың  (Triticum aestivum) дәндері қолданылды.

  Жұмыс барысында келесi әдiстемелер қолданылды: Бiркелкi буферлiк жүйедегi ПААГ электрофорезi, агарозды гельдегі электрофорез, спектрофотометриялық әдістеме.

Кiлттiк сөздер: азот тотығы, клеткалардың программаланған өлімі, тотықтырушы агенттер, антиоксидантты ферменттер, алейрон қабаты, сутегінің асқын тотығы, α-амилаза.

 

ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР ТІЗІМІ

 

ОБТ-оттегінің белсенді түрлері

АБҚ – абсциз қышқылы

ГҚ – гиббереллин қышқылы

ГГПФ – гераниллгеранилпирофосфат

NO – азот тотығы

SNAP – S-нитрозо-N-ацетилпенициламин

КПӨ – клетканың программаланған өлімі

ПААГ – полиакриламидтік гель

О^* – супероксид радикалы

Н₂О₂ – сутегінің асқын тотығы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

МАЗМҰНЫ

 

КIРIСПЕ……………………………………………………………………….…….5

 

1 ӘДЕБИЕТКЕ  ШОЛУ………………..…………….…………………………….6

1.1  Астық тұқымдастарының алейрон қабаттары………. ……………………………6

1.2  Гиббереллин қышқылының метаболизмі……………………………………………. 8

1.3  α-амилазаның функциясы мен құрылысы………………………………………….11

1.4 Азот тотығы……………..………………………………………….…………….13

 

2 ЭКСПЕРИМЕНТТІК БӨЛІМ…………………………………………………………………16

 

2.1 МАТЕРИАЛДАР МЕН ЗЕРТТЕУ ӘДІСТЕРІ….……..……………..……..16

2.1.1 Бидай дәнінің жекелеген алейрон ұлпасын бөліп алу…….……….16

          2.1.2 Бидай дәнінің жекелеген қабатын инкубациялау шарттары…..16

2.1.3  Сутегінің асқын тотығының мөлшерін анықтау …………...…..17

2.1.4 Клеткалық және секрецияланған α-амилаза ферменттерін экстракциялау және олардың белсенділігін анықтау……………..17

2.1.5   ДНҚ-ны бөліп алу әдісі……………..……………………………………..18

 

3  НӘТИЖЕЛЕР ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ.…………………………. ..19

 

4 ҚОРЫТЫНДЫ..……………………………………………………….…………25

 

5 ҚОЛДАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТIЗIМI……………………………..……26

 

 

 

 

 

 

 

 

КIРIСПЕ

 

Бидай дәнінің өнуі барысында оның алейрон қабаты бірқатар гидролитикалық ферменттерді (соның ішінде α-амилазаны ) синтездеп, оларды секрециялайды. Бұл гидролазалардың синтезінің индукциясы ұлпада гиббереллин қышқылының (ГҚ) болуына тәуелді. Гиббереллинге – тәуелді гидролазалардың синтезі осы фитогормонның табиғи антагонисті болып табылатын – абсциз қышқылымен (АБҚ) тежеледі [1].  

          Дәннің алейрон қабатындағы клеткалар онтогенездің келесі кезеңдерінде элиминацияға ұшырайды. Алейрон қабатындағы клеткаларының осы өлімі программаланған сипатта жүреді, яғни генетикалық жағынан детерминацияланған деген болжам бар (апоптоз) [2;3].

          Алғашқы жұмыстарымызда біздер бидай дәнінің алейрон қабатындағы және эндосперіміндегі клеткалардың программаланған өлімінің (КПӨ) морфо – биохимиялық белгілері анықтап, сипаттаған болатынбыз [4;5].  Бидай дәнінің алейрон қабатындағы КПӨ-ң орындалуы барысында супероксид (О*), сутектің асқын тотығы (Н₂О₂)  сияқты оттегінің белсенді түрлерінің (ОБТ) және антиоксидантты ферменттік жүйелердің (супероксиддисмутаза, аскорбатпероксидаза, каталаза және т.б. ) маңызды рөл атқаратындығы анықталған [6].

          КПӨ-ң реттелуінде азот тотығының (NO) маңызды рөл атқаратындығы белгілі [6].  NO- газтәрізді бос радикал, клеткааралшық зат пен плазматикалық мембранадан оңай диффузияланады. Ол клеткаішілік мессенджерлік жүйенің бір бөлігі бола тұра, NO- ң жануарлар жүйесіндегі физиологиялық үрдістеріне  кең көлемді әсер ету қасиетімен ерекшеленеді [7].

          Қазіргі кезде әдебиеттерде жинақталған мәліметтерге қарағанда, NО сонымен қатар өсімдіктерде жүретін көптеген физиологиялық үрдістерге қатысатындығын көрсетеді: патогенге жауап реакциясы, өніп-өсу, фитогормондардың мөлшері, сонымен қатар КПӨ (апоптоз). [8].  Соя клеткаларының культурасында NO мен ОБТ арасындағы әрекеттесу нәтижесінде КПӨ-нің орындалатыны белгілі болды. NO жеке өзі клеткалардың өлімін индукциялай алмайды, сонда КПӨ-нің жүзеге асуы NO: супероксид қатынасы арқылы детерминацияланатыны көрсетілген.

          Осы мәліметтердің барлығы өсімдіктер клеткасында программаланған өлімнің жүзеге асуы барысында NO ОБТ-ң клеткадағы мөлшерін реттеуде маңызды рөл атқаратындығын дәлелдейді.

          Осыған орай бұл жұмыста біздер клеткаішілік оттегі радикалдарының мөлшерін реттеудегі NO рөлін зерттедік. Бидай дәнінің алейрон қабатындағы клеткалардың функционалдық белсенділігінің реттелу механизмдері қарқынды зерттеліп жатқанымен [1-3], әлі секреторлық белсенділікті бақылауда және клеткалардың өліміндегі азот тотығының рөлі толық анықталмаған, тіпті зерттелмеген деуге болады.

 

 

1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ

 

• Астық тұқымдастарының алейрон қабаттары

 

Астық тұқымдастарының алейронын зерттеу кем дегенде екі ғасырға созылып келеді. Астық алейроны өсімдіктердің ең қарқынды түрде зерттеліп келе жатқан ұлпаларының бірі болып табылады. Сыра қайнатуда және ашытқы дайындауда астық алейроны маңызды орын алатындықтан химия және биология мамандары шамамен 200 жыл бұрын арпаның маңызын егжей-тегжейлі зерттей бастады [9].

ЕСКЕРТУ: АЛ. – бидай дәнінің алейрон қабаты; ЭНД. – бидай дәнінің крахмалды эноспермі; ПРОК. – бидай дәнінің проксимальды бөлігі; ДИСТ. – бидай дәнінің дистальды бөлігі. 3 – бидай дәнінің ұрығы

 

Сурет 1- Бидай дәнінің құрылысы

    Бидай дәнінің эндоспермі тозаң қапшығында, орталық клетканың аталық жыныс клеткасымен ұрықтану нәтижесінде пайда болатын, триплоидты ұлпа (1-сурет). Тозаңдану процесінен кейін шамамен 8-10 тәуліктен соң, дән эндоспермі крахмалды эндоспермге және алейрон қабатына дифференциацияланады [10]. Алайда, ұрықтанған бір клеткадан  пайда болатынына қарамастан, алейрон ұлпасы мен крахмалды эндосперм клеткаларының өлуі әртүрлі уақытта жүзеге асады. Крахмалды эндосперм клеткалары бидай дәнінің пісіп-жетілу барысында өліп, дән қуысын белокты және крахмалды гранулалар түрінде толтырып тұрады деген болжам бар. Ал алейрон клеткалары, дәннің пісіп-жетілу сатысында еш өзгеріссіз сақталып, тек қана оның өніп-өсу сатысын, гидролитикалық ферменттерді синтездеп, секрециялау арқылы индукциялағаннан кейін ғана элиминацияланады [11].

Алейрон қабатының онтогенетикалық программаланған клеткалар өлімі (ПКӨ) апоптотикалық сипатта жүзеге асатыны анықталған [12-14]. Бұл процестің дезоксирибонуклеазалардың белсенділігінің артуымен, геномдық ДНҚ молекуласының фрагментациялануымен үйлесіп, фитогормондар —  гиббереллин және абсциз қышқылдарымен бақыланылатыны көрсетілген [15].

Жоғарыда айтылғандай, алейрон клеткаларының негізгі қызметі гидролитикалық ферменттерді (α-амилазаны қоса) синтездеп, крахмалды эндоспермге секрециялау.

Алейрон клеткаларының ультра құрылымы олардың қызметін көрсетеді. Дәндегі алейронның көптеген көрсеткіштері оның ерекше және жан-жақты тәжірибелік жүйе болуын қамтамасыз етеді. Астық тұқымдастарының алейрон қабаты біртекті, жоғары дифференциалданған клеткалардың бір қабатынан (сұлы, жүгері, қара бидай, бидай) немесе бірнеше қабатынан (күріш, арпа) тұрады [16]. Пісіп-жетілген, құрғақ алейрон клеткалары қалың, геммицеллюлозалық қабырғамен қоршалған және олар ешқандай да  клеткалық бөлінуге ұшырамайды. Алейрон қабаттарын жабысып қалған өлі крахмалды эндоспермнен ажыратып алуға болады және ажыратып алынған алейрон ұлпасынан ферменттердің көмегімен протопластардың біртекті популяциясын дайындауға да болады [17].  Осындай жолмен жекеленіп алынған протопластар, тұтас алейрон ұлпалары сияқты гиббереллинге тәуелді α-амилаза изоферментінің активтенуі және синтезін қамтамасыз ететіні көрсетілген.   Жекеленген протопластар алу әдістемесі сұлы және арпа алейрон ұлпасына қатысты жасалынған [18]  Біздің лабораторияда  бидай алейрон ұлпаларынан жекеленген протопластарды бөліп алудың және тазалау, оларды концентрлеу  үшін фракциялаудың модификацияланған әдістемесі ұсынылған [19]. Ферменттік өңдеу арқылы алынған бидай алейрон протопластарының шығымы шикі ұлпаға шаққанда –35х10⁶ клетка/1 г болды. Протопластарды фиколл градиенттінде центрифугалау әдістемесі тіршілік дәрежесі жоғары клеткалар фракциясын алуға мүмкіндік берді (шамамен 80-85 %).

Алейрон клеткаларының цитоплазмасына белоктар қорынан тұратын көптеген вакуольдер тән, оларды көбінесе алейрондық түйіршіктер деп те атайды, олар бүкіл клеткаларды алып жатады. Бұл органелла алейронның гормондар әсеріне қайтаратын реакциясында негізгі қызмет атқарады. Протеиндердің қоры бар вакуольде гиббереллинмен өңделгеннен кейін гидролизге ұшыраған протеиндерді секреторлық белоктардың түзілуіне қажетті аминқышқылдармен қамтамасыз ету үшін қор ретінде сақтай бастайды [20]. Протеиндердің қоры бар вакуольдер, сондай-ақ, астық тұқымдастардың дәндеріндегі минералдардың негізгі қоймасы болып табылады. Олардың құрамынан минералдар фитин түрінде бөлініп алынған. Фитин  К⁺, Mg²⁺, және Ca²⁺ иондары мен фитинді қышқылынан (гексофосфат) түзілген кристалды, ерімейтін комплекс болып табылады. Бұл кристалды қосынды, глобоид деп те аталады. Рентгендік микроанализ нәтижелері бойынша дән құрамындағы РО₄³⁺, К⁺, Mg²⁺ және Ca²⁺ иондарының шамамен 75% алейрон қабаттарында сақталады [21]. Алейрон немесе протопластардың инкубациялық кезеңінде вакуольдер көлемдері ұлғайып, бір-бірімен орталық үлкен бір вакуоль түзілгенше қосыла бастайды. Инкубациялық ортада гиббереллин болған жағдайда клеткалар мен протопластардағы алейрон қабаттарының вакуольдену процесі жылдамдай түседі. Бейтарап майларды сақтайтын липидтік қосындылар немесе олеосомдар да алейрон клеткаларының маңызды органеллалары болып табылады, олар клетканың бүкіл кеңістігінің 30% алып жатқан үшглицеридтік негізден тұрады [22]. Алейрон клеткаларындағы олеосомдар эндоплазмалық торда пайда болып, кейіннен эндоплазмалық торға және протеиндердің қоры бар вакуольдер бетіне бекінген күйде болады. Олеосомдардың вакуольдер бетіне бекініп жатуы вакуолдердің кейбір түрлері тікелей эндоплазмалық тордан пайда болады деген болжамды растайды. Қор ретінде сақталған бейтарап майлар алейрон клеткаларын көміртегі көзімен де қамтамасыз етеді, эндоспермді мобилизациялау басталғанға дейін клетка көміртегіні осы жерден жұмсай алады, сонымен бірге мұндағы май қышқылдары мембрананы түзуге пайдаланылады. Бұл май қышқылдарының алейрон клеткалары арқылы метаболизденетініне бірнеше дәлелдер бар. Алейрон клеткаларында малатсинтетазадан және изоцитрат лиазадан тұратын көптеген глюкоксисомалар да болады [23;24] және оқшауланып алынған алейрон қабаттары сахарозаны синтездей алады.

Жоғарыда айтылғандай, алейрон клеткалары – жоғары деңгейде дифференциацияланған ұлпа. Бұл ұлпаның негізгі қызметі – гидролитикалық ферменттерді (альфа-амилазаны қоса) синтездеп, крахмалды эндоспермге секрециялау.  Олай болса, алейрон ұлпаларында оның секреторлық қызметіне байланысты эндоплазматикалық тор, Гольджи аппараты, митохондриялар өте жақсы дамыған.

Аталған гидролитикалық ферменттердің ішінде α-амилаза, дәннің өніп-өсуіне қатысты маңызды болып табылады. Крахмалды эндоспермге секрецияланған  α-амилаза крахмалды қанттарға дейін ыдыратып,  өсімдіктің өніп-өсуіне қажет энергиямен қамтамасыз етеді [25;26].

α-амилаза ферментінің практикалық маңыздылығына байланысты (ауыл-шаруашылығы, сыра дайындау, нан өндіру, фармакология және т.б.) оларды зерттеу жұмыстарына ғалымдар ертеден көңіл аударуда. Осыған орай альфа-амилаза ферментінің құрылысы мен қызметі келесі бөлімде терең қарастырылады. 

 

 

1.2. Гиббереллин қышқылының метаболизмі

 

Гиббереллиндер – химиялық тұрғыдан табиғаты дитерпеноидты биологиялық активті қосылыстарға жатады. Олар барлық зерттелген жоғарғы сатыдағы өсімдіктердің ұлпаларында табылған. Қазіргі кезде гиббереллиндер қарқынды зерттелуде, себебі олар өсімдік организмдеріндегі алуан түрлі физиологиялық процестерді реттеуге қатысады [27-29].

Ең алғаш рет 1926 жылы Кусова деген жапон ғалымы, күріш тұқымының қалыпты өсуіне кедергі болатын паразиттік саңырауқұлақтарында  (Gibberella Fugjikuroi) бірінші рет, гиббереллин  фитогармонын тапты. Гибберелин қышқылын (ГҚ) 1930 жылы жапон биохимиктері химиялық сипаттама беріп, таза күйде бөліп алды. Осы кезге дейін гибберелиндердің 65-тен аса түрлері бөлініп, химиялық статусы анықталды. Оның ішінде, ең жақсы зерттелгені – Гиббереллин қышқылы 3 (ГҚ₃), ол Gibberella Fugjikuroi саңырауқұлағында түзіледі [30;31].

Гибберелин қышқылы 4-А,В,С, және Д сақиналарынан түзілген, 4 изопрендік сақинадан құралған тетрациклді дитерпеноид болып табылады. Гибберелиндердің химиялық құрлымының негізінде гиббереллан қаңқасы жатыр. Гибберелиндер өзара А сақинасында қаныққан байланыстар, гидрок-сильді және карбоксильді топтардың,сонымен қатар, осы топтардың орнала-суымен ажыратылады. Гиббереллин молекулаларының тетрациклді ядро-сында бірнеше тұрақты орынбасарлары болады: С-7-де карбоксильді топ; С-17-де экзометиленді қос байланыс; С-18-де СН₃ топ; С-19 -лактон немесе карбоксильді топ орналасқан [32]. Басқа орынбасарлардың айырмашылығы неме-се олардың ұқсастығы барлық гиббериндердің алуан түрлілігін анықтайды. Көміртегінің атомының санына сәйкес, гибберелиндер екі топқа бөлінеді: 20 көміртекті және редукцияланған 19 көміртекті. Энт-гибберелан С₂₀ гибберелиндерінің молекулалық бастамасы болып табылады. 10-шы жағдайда 20 көміртекті гибберелин қышқылдарының қосымша метильді, гидроксиметильді, карбоксильді топтары болады [33]. С 19 гибберелині келесі негізгі көміртекті қаңқасының модификациялануы және С₂₀ атомының аластатылуы нәтижесінде түзіледі. С₂₀ гибберелиндер физиологиялық активті емес және де олар С₁₉  гибберелиндердің биогенетикалық бастаушысы болып табылады [34]. Жоғарыда айтылғандай, ГҚ тетрациклді дитерпеноидтар класына жатқызылады, сондықтан да олардың биосинтезінің алғашқы сатысы ацетил Со А-дан геранилгеранилпирофосфатқа (ГГПФ) дейін полизопренойдтар үшін ортақ болады [35-37]. Гибберелиндердің синтезінің бірінші фазасы (ГГПФ-ГА₁₂-альдегид) жоғарғы сатыдағы өсімдіктерде қандай болса, саңырауқұлақтар үшін де тура сондай (Gibberella Fugjikuroi). Бірінші этапта,  ГГПФ копалилпирофосфат және кейіннен энт-кауренге айналады. Бұл айналу тізбегі екі типті активтілік көрсететін энт-кауреназа арқылы катализденеді. Гибберелин 12 альдегидтен бастап гибберелиндерге дейінгі сатысы Gibberella Fugjikuroi саңырауқұлағында толығымен анықталған. Кейбір жағдайларда аталмыш саты жоғарғы сатыдағы өсімдіктердің клеткадан тыс жүйелерінде зерттелген [38;39]. Gibberella Fugjikuroi саңырауқұлағының культурасы жоғарғы сатыдағы өсімдіктерге қарағанда, өсу ортасына көп мөлшерде гибберелин қышқылын бөледі. Бұл олардың (ГҚ-ның) алынуы мен таза күйде көшіруін оңайлатады. Сонымен қатар in vitro жағдайда саңырауқұлақ клеткалары жақсы өседі және ортадағы экзогенді гибберелиндер түзуге қажет бастаушы заттарды тез сіңіре алады. Атап айту керек, Gibberella Fugjikuroi В1-41а мутантарымен жүргізілген жұмыс ең нәтижелі болып шықты. Бұл мутанттар энт-кауреннің тотығуын қамтамассыз ете алмайды. Алайда, мутанттағы гибберелиндердің биосин-тездің келесі сатыларын жүзеге асыратын ферменттердің сақталатыны анық-талды. Сондықтанда тек экзогенді бастамаларды қосып оның қандай соңғы өнімге айналатынын бақылауға болады [28]. Gibberella Fugjikuroi В1-41а мутанттарына жүргізілген эксперименттің негізінде, ГҚ-ның биосинтез жолы гибберелин 12- альдегиді сатысында екі тармаққа бөлінетіні анықталды: 1) 3 бета гидроксильденудің ерте жолы және 2) 3 бета гидроксильденуді айналып өту жолы [40]. Бірінші жолдың ГҚ₃-ның және басқа жақсы зерттелген 3-бета оксигибберелиндердің түзілуіне әкелетіні көрсетілді. Екінші жол 12 және 19 гибберелин қышқылдарының түзілуіне әкеледі. Соңғы жылдары гибберелиндердің синтезін зерттеу, жоғарғы сатыдағы өсімдіктердің, жоғарыда айтылып өткен екі жолдан бөлек, тағы бір типті С-13-гидроксильденудің ерте жолы бар деуге мүмкіндік берді [36]. Ең соңында осы барлық альдегид жолдарының алмасу мүмкіндіктері С₁₉ және С₁₀ атомдарының арасындағы лактонды сақинаның ажырауына әкеледі. Гибберелин-А₁₂-альдегидтінің энт-кауреннен түзілуін зерттеудегі эксперименттерде аралық буындардың созылғыш қабықтарына және қараңғыда өсірілген жүгерінің өсінділерінің гомогенатына енгізілген 17-13С,³Н-кауреноидтар қолданылды. Тәуелсіз биохимиялық және физика-химиялық әдістер, капилярлы газды хромотографияны қолдана отырып, алғаш рет өсімдіктердің вегетативтік ұлпаларындағы энт-кауреннің гибберелиндерінің түзілуінің 5 метаболитикалық сатысы ашылды. Олар: энткауренол, энткаурен қышқылы, энт-альфа гидроксикаурен қышқылы, гибберелин А₁₂-альдегид [41].

1) Сонымен көптеген көрсеткіштердің бірлестігі С-19 гибберелиннің ГҚ₃ мысалында биосинтездің негізгі этаптарын айқындап түсіндіреді, гибберелиндердің тегі жалпы тетроциклиндер болып табылады.

2) Энт-кауреннің бірнеше тізбектелген тотығу реакцияларының айналуы: кауренол-кауренал-каурен қышқылы-20 көміртекті А₁₂-альдегид;

3) а₁₂-альдегидінің әртүрлі гибберелиндерге дейін тотығуы.

Ең басты мәселе, ГҚ биосинтезіне жауапты ферменттерді анықтау. Әзірге олардың табылғандары аз. Біртіндеп терпен тізбегінің  С₅-С₁₀-С₁₅-С₂₀ ұзаруын катализдейтін геранил-геранилпирофосфат синтетаза ферменті бөлініп алынған [42]. Кауренсинтетаза 2 белсенді орталықтардан тұрады, оның біріншісі капалилпирофосфаттың түзілуін катализдейді, екіншісі кауренге циклдейді [43]. Сонымен қатар, монооксигеназаларда микросомалық ферменттер табылған, олар ГҚ₁₂-альдегидті С₂₀ және С₁₉-гибберелиндерге айналдырады [44].

Хлорхалинхлорид және АМО-1618 геранил-геранилпирофосфаттан копалинпирофосфаттың түзілуін, оның кауринге циклденуінің Фосфон Д стадиясын тежейді. Анцилиндал кауренінің тотығуын ингибрлейді [45;46]. ГҚ-ның өсімдіктердің бойымен қозғалуы базипетальды бағытта жүреді. Көбіне флоэмада және аз мөлшерде сұйық заттармен ксилеманың бойында. Табиғи гибберелиндер өсімдікердің бойында көбіне бос қышқыл түрінде кездеседі. Соңғылары комплексті түрде болады, мұнда гибберелиндер төменгі молекулалы заттармен коваленттік байланыс арқылы байлнысады. Жиі сипатталғандары ацетаттар, бетта-глюкопироноидтер, бетта-глюказилды эфирлер, Н-пропилді эфирлер. Коньюгацияланған ГҚ-ның негізгі ерекшелігі олардың биологиялық активтілігінің төмендеуі [28]. Өсімдік онтогенезіндегі гибберелиндердің құрамының өзгеруі көп қызығушылық тудырады. ГҚ деңгейі, арпаның 2-3 жапырақты және түктелу  фазаларында жоғарлайды, яғни сабақтың ұзына бойы өсу барысында белсенді болады, ал сабақтың өсуі әлсіреген кезде белсенділігі төмендейді [47]. Осыған ұқсас көрсеткіштер қосжарнақты өсімдіктерде байқалған [48;49]. Сонымен қатар жапырақтың құрамындағы гибберелиндердің мөлшері өсу деңгейіне қарай артып отырады [50-52]. Оның артуы жапырақтың өсу кезеңі аяқталуға жақын уақытта байқалады, ол кезде жапырақтар фитогармон  түзілу орталығы және өсімдік ағзасының басқа мүшелеріне оның доноры болып табылады. Жоғарыда айтып өткендей гибберелиндер кең көлемде өсімдік клеткаларының физиологиялық процестеріне: гүлденуіне, жақсы жеміс беруіне, фотосинтезге, сабақ пен тамырдың ұзарып өсуіне және басқа үрдістерге әсерін тигізеді.

 

 

1.3. α-амилазаның функциясы мен құрылысы

 

Қазіргі кезде ″амилаза″ терминімен көмірсулар метоболизмінде басты рөл атқаратын глюкоген, крахмал және басқа да полисахаридтерді ыдырату қабілеті ие ферменттер тобын айтады [53;54].

Амилолитикалық топ негізінен екі түрлі ферменттерден тұрады: эндо амилаза және экзо амилаза. Эндоамилазалар тобына α-амилаза жатады, ал экзо амилазаларды β-амилаза және γ-амилаза ферменттері құрайды.

Өсімдік клеткаларында полисахаридтердің пайдаланылуы бірнеше биохимиялық этаптардан тұрады: эндо амилазалар күрделі полимер тізбектерінің ішкі молекулалық байланыстарын үзіп, ерігіш өнімдердің пайда болуын қамтамасыз етеді [55]. Бұл процестегі α-амилазаның (1,4-глюкон-4-гликогидролаза) алатын орны зор. Аталмыш фермент интакті полисахаридтердің ыдырауын жүзеге асырады [56].

α-амилазалар қазіргі кездегі классификация бойынша гидролаза класына, гликозидаза подкласына жатады. Фермент әсері төрт немесе одан да көп Д-глюкозадан құралған полисахаридтердің СО-С байланысына бағытталған және 1,4 α-глюкозидтік байланыстың эндогидролизін қамтамасыз етеді. α-амилаза әсерінен пайда болған декстриндерді β және γ амилаза, декстриназа ферменттері қарапайым қанттарға дейін ыдыратады [57]. α-амилаза ферменттерінің астық тұқымдастарының өнуінде маңызды рөлі дәлелденген. α-амилазасы жоқ дәндер өніп-өсу қабілетінен де жұрдай болады [58].

Ғылыми әдебиеттердің деректері бойынша өсімдік α-амилаза ферменті жануар және саңырауқұлақтар α-амилазасы сияқты гликопротеин болып табылады, яғни көмірсутекті компоненттері болады [59;60].

Молекулалық структурасы жағынан жақсы зерттелген Aspergillus oryzat α-амилазасы (ТАКА-амилаза А) болып табылады. ТАКА-амилаза А ферментін гидролиздеу нәтижесінде гликопротеид молекуласы бөлініп алынған [61]. Динитрофенил, гидразин және периодатты тотықтыру тәжірибелері ферменттің көмірсутекті бөлігінің белок молекуласымен аспарагин амин қышқылы арқылы амидті байланыспен қосылғанын көрсетеді. N- соңы және С- соңы амин қышқылдарын анықтау үшін әртүрлі әдістер қолданылды: N-соңғы амин қышқылдары үшін динитробензол дансилхлорид, ал С-соңғы аминқышқылдары үшін карбоксипептидаза қолданылды. Осы тәжірибелер нәтижесінде ферменттің N-соңында H₂N-ала-гли-асп-глу-сер-ала-лей-тир-…., ал С-соңында серин аминқышқылдары болатыны анықталды [61;62]. Сонымен қатар оның олигосахаридті өзегі: Aln-[x]-Сер/тир үш пептидтік тізбегінен байланысатыны және көмірсутекті тобының гетерогенділігі дәлелденді [63;64]. Көмірсутекті бөлігінің қызметі оның фермент каталитикалық активтілігіндегі маңызы туралы деректер жоқ.

α-амилаза изоферменттерінің клондалған кДНҚ-лы және арпа алейрон клеткаларының ДНҚ фрагменттерінің нуклеотидтік тізбегін анықтау жұмыстары аталмыш ферменттердің аминқышқылдық тізбегін толық талдауға мүмкіндік берді [65]. Бұл зерттеу жұмыстарының нәтижесінде α-амилазаның аспарагин және глутамин амин қышқылдарына бай біртізбекті белок екені анықталды. Сонымен қатар, асп-гли-сер-пептидтік тізбегінің ферменттің сигналды бөлігінде ғана болатынын және оның функциональды активті изоэлектрлік нүктесі жоғары фермент түрінде кездесетіні анықталды. Осы деректерге сүйене отырып, авторлар изоэлектрлік нүктесінің жоғарғы мәнді α -амилаза глюкопротеин екендігі туралы болжам жасады. Сонымен қатар, арпа дәніндегі α-амилаза полипептидінде N–ацетилглюзамин глюкоза және манноза 0,5 моль/л мөлшерде болатыны анықталды [66]. Күріш дәнінің қалқан тканін зерттеу барысында пісіп-жетілген α-амилаза молекулаларының барлығының табиғаты гликопротеидті екені анықталған [67;68].

Монезин мен кальций иондарына сезімталдығының негізінде бұл ферменттің клетка ішілік формаларының әртүрлілігі посттрансляциялық гликолиздену нәтижесі деген ұсыныс ұсынылды. Бидай дәніндегі α -амилаза қышқылды белок, оның құрамында көп мөлшерде глютамин, аспарагин, глицин қалдығы бар [69]. α-амилазаның белсенді орталығында карбоксильдік топтар бар, аспаргин және глютамин аминқышқылдарынан құралған және оларды модификациялау ферменттік белсенділіктің жойылуына әкеліп соғады. Бидайдың α-амилаза молекуласындағы лизинді қалдықтардың бір бөлігінің метильденгені анықталды [70]. Қазіргі кезге шейін өсімдіктермен саңырауқұлақ функциональды активті α-амилазаларының қандай болмасын формасының біріншілік структурасы жайлы деректер жоқ. Кейбір жұмыстарда фрагменттерді бөліп алу арқылы амин қышқылдарының реттілігі жартылай ғана анықталды. Бұл жұмыстардың нәтижелері α-амилазаларды құрылымдық белгі бойынша классификациялауға негіз бола алмайды.

Өсімдік α-амилазалары бірнеше изоферменттерден тұрады. α-амилаза изоферменттері ион алмасушы хромотография, изоэлектрофокустау, агароза электрофорезі және т.б. әдістер арқылы сұрыпталынған [71].

α-амилаза изоферменттерін сұрыптаудың ең қолайлы әдістерінің бірі оны құрамында (5 М) мочевина бар полиакриламид гелінде сұрыптап, α-амилаза белсенділігін электрофореграммада гистохимиялық жолмен айқындау. α-амилаза ферментінің басқа амилолитикалық ферменттерден ерекшеліктерінің бірі – оның мочевинаның жоғары концентрациясына және жоғары температураға (70⁰С) төзімділігі.

Өніп-өсіп жатқан гексаплоидты бидайда шамамен α-амилазалардың 17 изоферменттері табылған. Бидай өсімдігінің онтогенезінің әртүрлі сатыларында альфа-амилаза изоферменттерінің компоненттік құрылымын зерттеу жұмыстары бұл ферменттің 22-ге жуық изоферменттері болатындығын анықтады.  Бұл деректер α-амлаза ферментінің әртүрлі формаларының, өсімдіктің онтогенезінің әртүрлі сатысында әртүрлі функциональды маңыздылығы болатынын көрсетеді.

Астық тұқымдастар α-амилаза изоферменттерінің компоненттік құрылымын бірнеше ғалым зерттеген [72]. Изоэлектрофокустау әдістемесі арқылы арпада α-амилаза төрт изоферменттерден тұратындығы анықталған. Бұл формалар изоэлектрлік нүктесінің мәні бойынша екі топқа бөлінеді: жоғары мәнді изоэлектрлі -5,8 және төмен мәнді изоэлектрлі. Ферменттің бұл топтары бір-бірінен аминқышқылдық құрылымы бойынша айрықшаланады.

Бидай α-амилаза ферменті екі топтан, яғни «Пісіп-жетілу»  және «Өніп-өсу»  изоформалық формалардан тұрады. α-амилазаның «Пісіп-жетілу» формалары, өсімдіктің пісіп-жетілуі сатысында, ал «Өніп-өсу» изоформалық формалар керісінше өніп-өсу сатысында синтезделеді деген болжам бар.

Кейінгі кезде, осы изоформалардың қалыптасуындағы гормондардың атқаратын рөлі туралы мәселелер көп қызығушылық тудыруда.  Өніп-өсіп келе жатқан бидай дәндерінің эмбриональды дамуы барысында изоэлектрофокустау, хроматографиялау әдістері арқылы α-амилазаның саны мен сапасына талдау жасалынды. Электрофореограммада α-амилаза үш топқа бөлінген: G1-II (pI белгісі катодқа жақын орналасқан), GI (pI анодқа жақын көрсеткіш) және GII (pI аралық көрсеткіш). Сандық талдау көрсеткіші бойынша өсіп-өніп келе жатқан дәнде ГҚ₃-ның болуы және болмауымен G III компоненті активтіліктің үлкен бөлігін қамтамасыз етеді, ол ары қарай өскен сайын сызықтанып, азая түседі. Бұл GI және GII амилаза компоненттерінің артуымен үйлеседі [73]. Көптеген зерттеулер негізінде анықталған өніп-өсу амилаза изоферменттер тобының индукциясы гормонға тәуелді болатындығы анықталған. Айта кететін бір жәйт ферменттің синтезінің реттелуі және бидай дәніндегі оның α-амилаза изоформаларның қалыптасуы тек физиологиялық тұрғыдан сипатталған. Бұл эффектің негізінде жатқан биохимиялық механизмдер әзірге толық анықталмаған.

 

 

 

1.4. Азот тотығы.

 

NО- газ тәрізді бос радикал, сондықтан да ол клеткааралық зат пен плазматикалық мембрана арқылы оңай өтеді [74]. NО клетка ішілік мессенджер жүйесінің бір бөлігі бола тұра, жануарлар жүйесінің  физиологиялық процесстеріне кең көлемде әсер етеді [75].

Қазіргі уақытта әдебиеттерде жинақталған мәліметтерге қарағанда, NО сонымен қатар өсімдіктерде өтетін көптеген физиологиялық процесстерге қатысатындығын көрсетеді: патогенге жауап реакциясы, өсіп-өну, фитогормондардың мөлшері, сонымен қатар КПӨ (апоптоз). Сонымен қатар азот тотығы антиоксидант,  яғни клеткаішілік радикалдардың  деңгейін төмендететін агент ретінде де қарастырылады [76].

 NО тасымалдануы. NО диффузияланушы газ екендігіне қарамастан, оның ізашарлары немесе кешендері жақын немесе алыс қашықтыққа көшіп отыратын NО қоры «депосы» немесе транспорттық түрі ретінде қызмет атқаруы мүмкін. NО  тасымалдануы, этиленнің ізашары – АСС тасымалдануына ұқсас аналогиялық жолмен жүреді.

Жануарлардың қан айналымында S-нитрозогемоглобиннің болуы, оның  циркуляциялық азот тотығының көзі ретінде қызмет атқаруы мүмкін деген болжамды тудырды. Қазіргі уақытта бұл болжам күмән келтіреді, алайда бұл болжамның орнына азот тотығының көзі ретінде нитрит қызмет атқаратындығы туралы мәліметтер ұсынылды. Нитрит өсімдіктерде де NО көзі ретінде қызмет атқара алады және бір орыннан екінші орынға жылжи алады.

NО басқа сигналдық жолдармен өзара әрекеттесуі. Азот тотығының және сигналдық механизмдердің оқшаулау құбылысындағы биологиялық  рөлін редукциялаушы түрде бағалау аз болар еді. Азот тотығы басқа сигналдармен тікелей түрде, мысалы, супероксидпен бірге пероксинитрит түзуі, сондай-ақ жанама түрде өзара әрекеттесе алады. Азот тотығы қатысатын сигналдық бөгеу үрждістері мен өзара әрекеттесу үрдістерін толық түрде қарастыру бұл жұмыс аумағынан тыс болып табылады, дегенмен қысқаша шолу жасап кету дұрыс болады. Көптеген тәжрибелік мәліметтердің көрсетуі бойынша, Н₂О₂ сияқты (NADPH- оксидазаның көмегімен супероксидтен пайда болса керек) оттегінің белсенді түрлерінің түзілуі NО синтезінің қалыпты серіктес үрдісі болып табылады. Мысалы, оттегінің белсенді түлері де, NО да патогендік инфекцияға жауап ретінде түзіліп, пайда болады; сонымен қатар олар, шеткі тұйықтаушы клеткаларда АБҚ-ның әсерінен пайда болады. Н₂О₂ көптеген биотикалық және абиотикалық стимулдарға, сондай-ақ азот тотығының әсеріне жауап ретінде түзіледі. Азот тотығы мен Н₂О₂ өзара әрекеттесуі жоғарыда айтылған. NО супероксидтің туындауын тежеуі мүмкін. Н₂О₂ және азот тотығы МАРК ферментін белсендіреді және кальцийдің клеткаішілік мөлшерінде өзгерістер тудырады. NО саңылаулардың жабылу үрдістерінде АБҚ-мен өзара әрекеттеседі. NО көптеген сигналдармен әрекеттесетіні айқын түрде белгілі, бірақ ол сигналдардың толық суреттемесі әлі құрастырылмаған.

NО және гендердің экспрессиясы. Гендердің NО әсерінен экспрессияланатындығы ең алғаш рет патоген мен өсімдік арасындағы қарым-қатынастардан көрсетілді. Төзімді темекі өсімдіктерін ВТМ арқылы инфекцияланған жағдайда NOS белсенділігі жоғарылады. Рекомбинантты NOS енгізіп, GSNO немесе SNAP арқылы өңдеген кезде PAL және PR-1 гендері экспрессияланады. PR-1 гендері сонымен қатар BTM арқылы инфекциялаған жағдайда да экспрессияланады;  L-NAME (NOS тежеушісі) қосқан кезде бұл әсер тежеледі, демек, BTM арқылы тудырылған экспрессия барысында, NO аралық қызметті жүзеге асырады. Arabidopsis өсімдігінде азот тотығын PTIO арқылы жойған кезде немесе NOS-ы L-NAME арқылы тежеген кезде  CHS генінің ультракүлгін сәулесінің әсерінен экспрессиялануы тежеледі (басылып тоқтады). Бұл геннің экспрессиясы азот тотығы GSNO немесе SNAP көмегімен ткелей әсер еткен жағдайда индукцияланады, демек, NО бұл үрдісте медиатор болып табылады деп болжауға болады [77].

 

 

 

 

 

 

2. ЭКСПЕРИМЕНТТІК БӨЛІМ

 

 

2.1. Материалдар мен зерттеу әдістері

 

 

          Зерттеулерде Қазақстан 4 сортты гексоплоидты бидайдың  (Triticum aestivum) деэмбриональды дәндерінен жекеленген алейрон ұлпалары қолданылды. Сонымен қатар келесі фитогармондар׃ гиббереллин қышқылы, абсциз қышқылы пайдаланылды.

 

2.1.1. Бидай дәнінің жекелеген алейрон ұлпасын бөліп алу

 

 

Тәжірибелерде деэмбриональды дәндерден жекеленген алейрон ұлпалары пайдаланды.Эндогенді гиббереллиндердің алейрон клеткаларына әсерін тежеу үшін, бидай дәндерінің ұрық бөліктері алынып тасталынды. Алынған ұрықсыз бидай бөліктерін 10 минут 1%-натрий гипохлориды ерітіндісінде зиянсыздандырып,оларды бірнеше рет стерильді суда бірнеше рет жудық. Содан соң, 100 г. стерильді құм бар Петри табақшаларында 150-200 деэмбриональды дәндерді орналастырып, 20-25 мл деиондалған суда инкубацияладық. Ұрықсыз дәндердің алғашқы инкубациясын үш күн бойы, 25^° С температурада, қараңғыда жүргіздік. Инкубация уақыты аяқталған соң дән жартыларын шығарып, 20 мл суда құмнан тазарттық. Алейрон қабаттарын бөліп алу кезінде дән қабығы мен жеміс серігі ажыратылды. Крахмалды эндоспермді стерильді шпательмен ажыраттық. Алейрон қабатын эндосперм қалдықтарынан тазарту үшін оларды бірнеше рет шайып, тәжірибелерде қолдандық. Барлық жүргізілген процедуралар стерильді жағдайларда орындалды.

 

2.1.2. Бидай дәндерінің жекелеген қабатын инкубациялау шарттары

 

 

          Тәжірибелерде жүзеге асыру үшін, 15-20 алейрон қабаттары, ішінде 2 мл буферлік орта бар, көлемі 50 мл культуралық колбаға орналастырылды. Культуралық колба алдын-ала автоклавтау арқылы стерильденген. Инкубациялық орта ретінде, зерттеу мақсатына байланысты әртүрлі буферлер пайдаланылды: 0,2 М ацетаттық буфер (рН 5,0), 0,2 М фосфаттық буфер (рН 6,0), 0,2М фосфаттық буфер (рН 7,0), сонымен қатар әрбір инкубациялық ортаға 15мкг/мл хлорамфеникол және 20 мкг/мл стрепто-мицин антибиотиктерін қостық.

 

 

 

 

2.1.3. Сутегінің асқын тотығының мөлшерін анықтау

 

Сутегінің тотығы титанмен (Ті⁺⁴) спецификалық кешен түзеді. Сутегі тотығын экстракциялау үшін инкубация уақыты аяқталған бидай алейрон қабаттарын (20-25 алейрон ұлпалары) 200 мл суық ацетонда, мұздың үстінде гомогенизацияладық. Алынған гомогенатты өте ұқыпты жағдайда сүзгіден өткізіп, сүзгіден өткен ерітіндінің көлемін дистильденген сумен 300 мл-ге дейін жеткіздік. Содан соң алынған қоспаға 2 мл концентрлі НСI-да дайындалған 20%-тік титан тетрахлоридін (ТіСI₄) және 4 мл титан-сутегінің асқын тотығы кешенін тұнбаға түсіру үшін концентрлі NH₄OH қосып, 5 минут 10000 g жылдамдықта центрифугаладық. Тұнбаны 1,5 мл 2 н Н₂SO₄ ерітіндісінде еріттік. Алынған қоспаны бірнеше рет ацетонмен жуып,көлемін дистильденген сумен 20 мл-ге дейін жеткіздік. Алынған ерітіндінің оптикалық тығыздығын 415 нм толқын ұзындығында спектрофотометрде өлшедік. Сутек тотығының мөлшерін Н₂О₂ қатысуымен тұрғызылған калибрлік график арқылы есептедік.

 

2.1.4. Клеткалық және секрецияланған α-амилаза ферменттерін экстракциялау және олардың белсенділігін анықтау

 

Жекеленген бидай алейрон қабаттарының α-амилаза белсенділігін анықтау үшін, 20-25 алейрон қабаттарын 2 мл 20 мМ CaCl₂ буферінде 24 сағат бойы қараңғыда инкубацияладық. Зерттелетін заттар жоғарыда айтылып кеткендей (ГҚ 1 мкМ және АБҚ 5 мкМ) инкубациялық ортаға 20 мкл мөлшерде қосылды..   Инкубация уақыты аяқталған соң, инкубациялық ортаны 20 минут, 10000 g жылдамдықта центрифугалап, супернатанттың температурасын 70^°С-қа дейін көтеріп, 10 минут бойы осы температурада инкубацияладық. Бұл үрдіс β- және γ-амилаза ферменттерінің белсенділігін жоюға мүмкіндік береді. Содан соң ерітіндіні суытып, оны секрецияланған α-амилаза көзі ретінде қолдандық.

Клеткалық α-амилаза белсенділігін анықтау үшін, алейрон қабаттарын бірнеше рет ионсызданған суда жуып,тазаладық. Содан соң, оларды 4 мл 0,2 М натрий ацетатты буферінде гомогенизацияладық. Фермент экстракциясы үшін гомогенатты жиі араластыра отырып  бір сағат бойы суықта ұстадық. Алынған гомогенатты 3000 g жылдамдықта центрифугалап, супернатанттың температурасын 70^°С температураға дейін көтеріп, 10 минут бойы инкубацияладық. Инкубациядан соң ерітіндіні тез арада суытып, 10000 g жылдамдықта центрифугаладық, алынған супернатантты   клеткалық α-амилаза көзі ретінде пайдаландық.

α -амилаза белсенділігі Шустер және Гиффорт әдістері арқылы зерттелді. α-амилазалар активтілігін 0,01 мл аликвоталарға 0,1М фосфор буферінде  (рН 5,0) дайындалған 0,2% крахмал ерітіндісін 0,1 мл көлемде қосумен бастадық. Қоспаны 10-15 минут барысында 25^°С температурада инкубациялап, инкубациялық уақыт аяқталған соң реакцияны тоқтату үшін келесі құрамды ерітіндіні қолдандық: 0,06% l₂; 0,006% Кl; 0,5 н НСl. Осы ерітіндіні әрбір пробиркаға 0,1 мл көлемде қостық. Содан соң, әрбір қоспаға 5 мл дистилденген су қосып, жақсылап араластырып, алынған қоспаны 620 нм толқын ұзындығында спектрофотометрлеп, α-амилаза белсенділігінің деңгейін анықтадық. α -амилазаның белсенділігін коммерциялық фермент арқылы тұрғызған калибрлік қисық сызығы көмегімен анықтадық. 100 пайыз ретінде 75 мкг крахмал мөлшеріндегі 34 мкг α-амилазаның  (1 мин) белсенділігінің (клеткалық фермент белсенділігі) пробасы (сынама) және сол крахмал мөлшеріндегі 23 мкг α-амилазаның  (1мин) белсенділігінің (секрецияланған фермент белсенділігі) пробасына сәйкес фермент белсенділігі қабылданған. Сол пробадағы белок мөпшерін Бредфорд әдісі бойынша анықтадық.

 

 

2.1.5. ДНҚ-ны бөліп алу әдісі

 

          Инкубациядан кейін ұлпаны фарфор табақшасында сұйық азот қосып, гомогенизациясын жүргізді. Нәтижесінде алынған ұнтаққа экстракцияға арналған құрамында: 100 мМ трис HCl (рН 8,0), 2% SDS; 20 мМ ЭДТА; 1,4 М NaCl; 0,2% 2-β меркаптоэтанол бар буферді 0,7 мл көлемінде қосамыз. Содан кейін 60 ⁰С- та 30 минут инкубациялаймыз. Алынған экстрактыға тең көлемде хлороформды қосып, 15 минут инкубациядан кейін 10000 айн/мин 10 минут бойы центрифугалаймыз. Содан соң сұйық фазасын бөліп алып 2/3 көлемінде салқындатылған (-20⁰С) изопропанолда экстракциясын жүргіземіз. 10 минут инкубациядан кейін 5000 айн/мин центрифугалаймыз. Супернатантын төгіп тастап ДНҚ-лы бар тұнбасын ауада кептіреміз де, қайтадан ТЕ буферының (рН 7,5) 500 мкл көлемінде ерітеміз (ресуспензиялаймыз). Алынған суспензияға тең көлемде (1:1) фенол/хлороформ қоспасын қосамыз. 15 минут инкубациядан кейін қоспаны 5000 айн/мин 10 минут бойы центрифугалаймыз. Содан соң сұйық фазасын бөліп алып, 1/10 көлемінде 3М натрий ацетатын (рН 7,0) және 2/5 көлемінде салқындатылған этанол қосамыз

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. НӘТИЖЕЛЕР ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ

 

 

КПӨ — бұл генетикалық детерминацияланған, метаболизмі бағытталған, клеткаларды өлімге әкелетін үрдіс. Жануарлар жүйесінде КПӨ реттеуде азот тотығы маңызды рөл атқаратындығы белгілі.

Қазіргі кезде әдебиеттерде жинақталған мәліметтерде, NO сонымен қатар өсімдіктерде жүріп жатқан көптеген физиологиялық үрдістерге қатысатындығы көрсетілген, соның ішінде КПӨ-не (апоптоз).

Біздер алғашқы жұмыстарымызда бидай дәнінің алейрон қабатындағы және эндосперіміндегі клеткалардың программаланған өлімінің (КПӨ) морфо – биохимиялық белгілерін анықтап, сипаттама берген болатынбыз. Бидай дәнінің алейрон қабатындағы КПӨ-ң орындалуы барысында супероксид (О*), сутектің асқын тотығы (Н₂О₂)  сияқты оттегінің белсенді түрлерінің (ОБТ) және антиоксидантты ферменттік жүйелердің (супероксиддисмутаза, аскорбатпероксидаза, каталаза және т.б. ) маңызды рөл атқаратындығы анықталған .

Осыған орай біздер бұл жұмыста бидай дәнінің алейрон қабатындағы клеткалардың өлімін реттеуде NО-ң ықтимал рөлін зерттедік.

 

Кесте 1. Бидай дәнінің алейрон қабатындағы клеткалардың өліміне гиббереллин қышқылының және азот тотығының доноры SNAP-ң әсері.

 

 

 

Тәжірибе жағдайы	Клеткалардың өлімі,  в %
	24 сағат	48 сағат	72 сағат
Бақылау (Б)	4,9 ± 1,3	8,5 ± 2,0	16,4 ± 2,3
ГҚ (1мкМ)	10,2 ± 2,3	25,0 ± 3,2	72,0* ± 6,2
ГҚ (1мкМ)+SNAP (300мкМ)	8,3 ± 1,7	14,5 ± 2,6	23,4 ± 3,7
SNAP(300мкМ)	5,2 ± 1,8	11,8 ± 1,9	18,6 ± 2,7

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   *-   Р < 0.05 бақылаумен салыстырғанда

 

Кестеден көрініп тұғандай бақылау нұсқаларында (ГҚ және SNAP жоқ ортада) инкубация уақыты артқан сайын клеткалардың өлімі шамалы ғана деңгейге жоғарылап отырады. Сонымен қатар бұл жағдайдағы клеткаларды жаңа бөлініп алынған алейрон қабатының  клеткаларымен салыстырғанда ешқандай морфологиялық өзгерістер байқалмады (). Алейрон ұлпасын 1 мкМ дозада ГҚ бар ортада 16 және 24 сағат бойы инкубациялағанда, клеткалардың өлімі бақылау нұсқасымен салыстырғанда 5,3 және 16,5% сәйкесінше артып отырды. Ал инкубация уақытын 48 сағатқа жеткенде, клеткалар өлімінің стимуляциясы елеулі дәрежеге дейін артып, бақылаумен салыстырғанда 60% жетіп отырды. (Кесте 1)

Біздердің тәжірибелерімізде инкубациялық ортаға SNAP-ті 300 мкМ дозада қосқанда, ол ГҚ–мен стимуляцияланған алейрон қабатындағы клеткалардың өлімін едәуір дәрежеде тежейтіні байқалды.

Жоғарыда келтірілген тәжірибелерде алейрон қабатындағы клеткалардың өліміне ГҚ-ң әсер етуі, бұл үрдісті реттеуде гиббереллин қышқылының және азот тотығының рөлі зор екендігін көрсетеді.

Атап айту керек, бірқатар жанама мәліметтер бойынша NO, өсімдіктер клеткаларындағы программаланған өліміге қатысады деген болжамды жақтайды. Бірақ та, тәжірибе жүзінде алынған тікелей осы болжамды дәлелдейтін мәліметтер жоқ.

         

1           2         3            4

                   Уақыт, сағат

3000 2000                                  1000    500    200    50

                                             

А                                                             Б

 

 

А – ГҚ-ң (1мкМ) инкубация уақытына тәуелді ДНҚ фрагментациясына әсері; М – маркер; Б –ГҚ-мен стимуляцияланған ДНҚ фрагментациясына азот тотығының әртүрлі дозадағы әсері (96 сағат инкубациядан кейін).

1 — ГК(1мкМ) + SNAP(50мкМ); 2 — ГК(1мкМ)+SNAP(75мкМ); 3 – ГК (1мкМ) + SNAP (150 мкМ );  4 – ГК (1мкМ) + SNAP (300мкМ).

 

Сурет 2 – Бидай дәнінің алейрон қабатындағы ДНҚ фрагментациясына

ГҚ мен азот тотығының әсері.

 

Клеткалардың апоптотикалық өлімінің негізгі дәлелді белгілерінің бірі ол – геномдық ДНҚ-ң фрагментациялануы. Осы үрдіс кезінде оның өзіне тән ерекшеліктері болады – ДНҚ-да нуклеосомаралық ыдырау нәтижесінде фрагменттер түзіледі, олардың көлемі жеке нуклеосомалардың көлеміне шақанға тең. Электрофореграммада бұл әртүрлі өлшемдегі фрагменттер, өздеріне тән “саты” тәрізді жолақты береді.

ГҚ бар ортада (1мкМ), бидай дәнінің алейрон қабатындағы ДНҚ фрагментациясына азот тотығының дозағатәуелді эффектісін зерттеу жұмыстарының нәтижесі 2-ші суретінде келтірілген. Суреттен көрініп тұрғандай ГҚ-на тәуелді ДНҚ-ң фрагментациясы ортаға SNAP-ті 50-75 мкМ дозада қосқаннан елеулі дәрежеге өзгермеді. Әрі қарай SNAP концентрациясының жоғарылауы (150-300 мкМ) бидай дәнінің алейрон қабатындағы ГҚ-ң әсерінен болатын ДНҚ фрагментациясын толығымен тежейді.

Олай болса, біздермен алынған нәтижелер шынында да, алейрон қабатындағы клеткаларда ДНҚ фрагментациясы ГҚ-ң әсерінен күшейетіндігін дәлелдейді. Сонымен қатар ГҚ-ң ДНҚ деградациялық эффектісін, азот тотығы толығымен тежейді. Бұл кезде ГҚ-мен стимуляцияланған ДНҚ фрагментациясына азот тотығының ингибитрлеуші әсері дозағатәуелді сипатта жүреді. Және SNAP-ң толық ингибитрлеуші әсері 300 мкМ дозада байқалады.

Әртүрлі абиотикалық стресстер (құрғақшылық, экстремальды температуралар, УК және т.б.) ОБТ-ң түзілуін индукциялайтыны белгілі. ОБТ — ыдырауға әкелетін тотығу процестерін инициациялайды және сонымен қатар, алуан түрлі сигналдық жолдардың триггерлары болып табылады. Сондықтан клеткаішілік ОБТ-ң қажетті мөлшерінің сақталуы тіршілік ету шарттарының бірі болып табылады. NO ОБТ-мен  әртүрлі жолдармен әрекеттеседі, және ол стресс кезінде антиоксиданттық қызмет атқаруы мүмкін. Зақымдану өздігінен NO-ң түзілуін индукцияламайды, бірақ сол жерді азот тотығының донорымен өңдегенде зақымдану кезінде жүретін Н₂О₂ генерациясымен қатар зақымдану нәтижесінде белсенді күйге көшетін арнаулы гендердің экспрессиясы тежелетіндігі көрсетілген; Бұдан NO-ң патогенез жағдайында Н₂О₂  синтезін және зақымданумен индукцияланатын сигналдық жолдардың белсенді күйге көшуін тежейтіндігін байқауға болады.

 Осыған орай келесі тәжірибелерде біздер бидай дәнінің алейрон қабатындағы клеткаларда клеткаішілік оттегі радикалдарының гормонғатәуелді  генерациясына NO-ның рөлін зерттедік.

3–ші суреттен көрініп тұрғандай бақылау тәжірибелерінде ( ГҚ және SNAP жоқ ортада) клеткаішілік Н₂О₂-ң концентрациясы инкубация уақыты артқан сайын жоғарылап отырады. Бұл кезде Н₂О₂-ң концентрациясының сенімді жоғарылау мөлшеріне 48 сағат инкубациядан кейін жетіп отырды. Алейрон ұлпасын 1 мкМ дозада ГҚ бар ортада 24 және 48 сағат бойы инкубациялағанда 0,5 г шикі ұлпаға шаққанда Н₂О₂-ң клеткаішілік мөлшері шамамен 33 және 82 мкМ-ға сәйкесінше артып отырды. Ал ГҚ бар ортада 72 сағат бойы инкубациялау Н₂О₂-ң клеткаішілік концентрациясын елеулі дәрежеге дейін артуына әкеліп, 0,5 г шикі ұлпаға шаққанда 120 мкМ жетті. Оқшауланған алейрон ұлпасының инкубациялық ортасына  SNAP-ті (300 мкМ) қосқанда, супероксид анионы жағдайында сияқты түгел инкубация уақытына ГҚ-ң әсерін елеулі дәрежеге тежейді.

24    48    72                 24    48     72                 24    48     72                  24     48     72                                          Уақыт, сағат

Сурет –3 Инкубация уқытына тәуелді бидай дәнінің алейрон қабатындағы Н₂О₂-ң генерациясына ГҚ-ң және SNAP-ң әсері.

 

 

Бұл нәтижелер оттегі радикалдарының гормонға тәуелді жинақталуын реттеуде азот тотығының шешуші рөл атқару мүмкіндігін көрсетеді. Бұл модельдік жүйеде сутектің асқын тотығы мен супероксидтің жинақталуына  NО-ның елеулі түрде тежеуші әсер көрсетуі оның антиоксидантты қызмет атқаратындығын көрсетеді.

Алғашқы тәжірибелерде біздермен бидай дәнінің алейрон қабатындағы антиоксидантты ферменттердің және ОБТ-ң генерациясының гормонғатәуелді реттелу сипаты анықталған. Бидай дәнінің алейрон қабатындағы клеткаларда ГҚ-ң әсерінен ОБТ-ң клеткаішілік мөлшерінің елеулі дәрежеге дейін жоғарылайтыны көрсетілген. Фитогормонның бұл әсері антиоксидантты ферменттің белсенділігінің максималды түрде төмендеуімен байланысты жүрді. Бұл модельдік жүйеде АБҚ-ң әсері антиоксидантты ферменттердің синтезін күшейту арқылы ОБТ-ң генерациясын тежеуге бағытталғандығы анықталған. Алейрон қабатындағы клеткалардың өлімінің басталу мерзімі мен ОБТ-ң генерациясының және антиоксидантты ферменттердің белсенділігінің арасында қатаң корреляция бар екендігі анықталды. Алынған деректердің негізінде бидай дәнінің алейрон қабатындағы клеткалардың гормонға-тәуелді программаланған өлімінің орындалуында антиоксидантты ферменттердің және ОБТ-ң маңызды рөл атқаратындығы туралы болжам жасалынды.

Бұл жұмыста келтірілген нәтижелер гормонға-тәуелді оттегінің радикалдарының жинақталу үрдістерінің реттелуінде және бидай дәнінің алейрон қабатындағы клеткалардың программаланған өлімінде азот тотығы шешуші рөл атқаратындығын көрсетеді. NO бұл модельдік жүйеде антиоксидантты қызмет атқаруы мүмкін. Бұған алейрон ұлпасындағы инкубациялық уақыттың ұзақтығына тәуелсіз NO-ның қатысында ГҚ индукциялайтын оттегі радикалдарының жинақталуына тежеуші әсердің пайда болуы дәлел болады, ал бұл NO-ң оттегі радикалдарының мөлшерінің арнаулы эндогенді модуляторы ретінде жұмыс атқару мүмкіндігін көрсетеді.

Жоғарыда атап өткеніміздей бидайдың алейрон қабаты жоғарыдифференциацияланған ұлпа болып табылады. Бұл клеткалардың негізгі қызметі гидролитикалық ферменттерді (α-амилазаны) синтездеп, оларды дәннің эндосперміне секрециялау. Гидролазалар синтезінің индукциясы (соның ішінде α-амилазаның) ұлпада ГҚ болуына тәуелді.

          Сонда бидай дәніндегі алейрон клеткаларында ГҚ-ның әсерінен жүретін амилазосекрециялық белсенділігіне, азот тотығының әсері қаншалықты қандай?

Алғашқы тәжірибелерімізде біздер бидай дәніндегі алейрон қабатының амилазосекрециялық белсенділігіне ГҚ-ң дозағатәуелді (10^-9-10^-6М) әсерін зерттедік. 4-ші суреттен көрініп тұрғандай алейрон қабаты ГҚ-ң әсерінен секрециялайтын амилазаның статистикалық сенімді деңгейі 10^-9-10^-6М дозада байқалды.

 

 

	0                        10-9                                    10-8                               10-7                        10-6  ГК, моль

 

 

Сурет — 4   Алейрон қабаттарының проксимальды және дистальды

бөліктеріндегі амилаза белсенділігіе ГҚ-ның әртүрлі дозаларының

әсері

 

          ГҚ-мен стимуляцияланған α-амилазаның секрециясына азот тотығының әсерін зерттеу жұмыстары жүргізілді. Біздермен жүргізілген тәжірибелер оқшауланған алейрон қабатын 1 мкМ дозада ГҚ бар ортада 24 және 48 сағат бойы инкубациялағанда, ұлпадағы амилаза белсенділігінің елеулі дәрежеге жоғарылауы жүреді. Бұл кезде инкубациялық ортада тек SNAP болғанда секрецияланған α-амилазаның белсенділігінің артуы шамалы ғана (сенімсіз) болды. Ал инкубациялық ортаға SNAP (300 мкМ) пен ГҚ (1мкМ) қатар қосқанда, секрецияланған α-амилазаның белсенділігі бақылаумен және тек ГҚ-ң әсерімен салыстырғанда едәуір деңгейге артты (кесте2).

 

Кесте 2 – Бидай дәніндегі алейрон қабатының ГҚ-на тәуелді α-амилазаның секрециясына азот тотығының доноры SNAP-ң әсері.

 

 

Тәжірибе жағдайы	α-амилазаның белсенділігі (Белсенділік бірлігі).
	24 сағат		48 сағат
	Белсенділік бірлігі	%	Белсенділік бірлігі	%
Б	220,0 ± 20,4	100,0	236,9 ± 23,0	100,0
ГҚ(1 мкМ)	368,3 ± 18,6*	167,4*	520,7 ± 35,8*	219,7*
SNAP(300мкМ)	222,8 ± 34,0	101,3	238,0 ± 28,2	100,4
ГҚ+ SNAP	410,2 ± 21,0*	186,4*	560,2 ± 31,2*	236,5*
* P < 0,05  бақылаумен салыстырғанда

 

 

Бұл нәтижелер азот тотығы α-амилазаның секрециясына белсендіруші әсерін тек ГҚ-мен бірігіп көрсететінін, және жеке өзі бұл гидролитикалық ферменттің секрециясына әсер ете алмайтынын көрсетеді.

 

 

4. ҚОРЫТЫНДЫ

 

1. Алынған деректер негiзiнде фитогормональды реттелетiн алейрон клеткаларының өлiмi программаланған сипатта орындалатындығы геномдық ДНҚ-ның олигонуклеосомдық фрагменттерге ыдырауы деңгейінде жүретіндігі көрсетілді. Және бұл ДНҚ-ның фрагментациялануын ГҚ индукциялайтыны белгілі болды. Бұл моделдік жүйеде азот тотығының доноры SNAP ГҚ-ның әсерін дозаға тәуелді тежейтіні анықталды.

 

2. Бидай алейрон клеткаларда ГҚ сутегiнiң асқын тотығының клетка iшiлік мөлшерiн арттыратыны анықталды. Ал, SNAP керсінше, бидай алейрон клеткаларында сутегiнiң асқын тотығының мөлшерiн арттыратын метаболитикалық процестердi тежеп, антиоксидантты қызмет атқару мүмкіндігі көрсетілді. Бұл нәтижелер оттегі радикалдарының гормонға тәуелді жинақталуын реттеуде азот тотығының шешуші рөл атқаратындығын көрсетеді.

 

3. Бидай алейрон қабатының α-амилазасекрециялық белсенділігі ГҚ-ның болуына тәуелді екені анықталды. Ал азот тотығы α-амилазаның секрециясына белсендіруші әсерін тек ГҚ-мен бірігіп көрсететіні, және жеке өзі бұл гидролитикалық ферменттің секрециясына әсер ете алмайтыны дәлелденді. Яғни бұл модельдік жүйеде азот тотығы ГҚ-ның синергисті ретінде қызмет атқарды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. ҚОЛДАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТIЗIМI

 

1 Бисенбаев А.К.,  Таиров М.М., Берсимбаев Р.И.. Участие синтеза  белка  и  стимулирующего  действия гибберелловой кислоты на секрецию амилазы из  изолированного алейронового слоя зерна пшеницы // Биохимия. – 1992. – Т. .57, вып.12. — С. 1834-1840.

2   Bethke P. C., Schuurink R and Jones R. L., Hormonal signaling in cereal aleurone // J. Exp. Bot. – 1997. —  Vol. 48.  — Р. 13337-13356.

3  Fath A., Bethke P., Lonsdale J., Meza-Romero R., Jones R., Programmed cell death in cereal aleurone //  Plant Molecular Biology. —  2000. Vol. 44. — Р.  255-256. 

4  Бисенбаев А.К., Кениев А.М., Берсимбаев Р.И. Действие гибберелловой и абсцизовой кислот на апоптоз клеток алейронового слоя зерна пшеницы // Вестник КазГУ, серия биологическая. —  2001. —  № 1(13). —  С. 52-57.

5 Бисенбаев А.К., Кениев А.М., Тазабекова Ж.Ж., Берсимбаев Р.И.  Онтогенетически  программированная гибель клеток эндосперма  созревающего зерна пшеницы.// Вестник КазНУ, серия биологическая. —  2003. —  №3(21). — С.  40-45.

6  Бисенбаев А.К. Роль активных форм кислорода  и антиоксидантных ферментов в гормонально регулируемой гибели клеток алейронового слоя зерна пшеницы // «Биотехнология  Теория и практика». – 2005. —  №4. — С. 142-149.

7  Chung H.T., Pae H.O., Choi B.M., Billar T.R., Kim Y.M. Nitric oxide as bioregulator of apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. —  2002. — Vol. 282. — Р. 1075-10.  

8  Durner J., Gow A.J., Stamler J.S., Glazebrook J.  Ancient origins of nitric oxide signaling in biological systems // Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. — 1999. — Vol. 96. — Р. 14206–14207.

9   Jacobsen J.V. Regulation of the synthesis and transport of secreted proteins in cereal aleurone. Int Rev Cytol. — 1991. — Vol.126. — P. 49–88.

10 Bethke P. C., Hillmer S. and Jones R. L. Isolation of intact protein storage vacuoles from barley aleurone // Plant Physiol. — 1996. — Vol.110. — P.521-529.

11  Fujimura K., Kanoh M., Benaka T. Studies heterogecity of Taka-amylas A: Isolation of an amylase having one N-acetylglucosoamine residue as the sugar chain // J. Biochem. — 1982.  — Vol. 92. — P. 265-270.

12 Бисенбаев А.К., Кениев А.М. Берсимбаев Р.И. Участие ядерных дезоксирибонуклеаз в реализации онтогенетически программированной гибели клеток алейронового слоя зерна пшеницы//  Известия НАН РК. – 2003. — №.5. — С. 35-42.

13 Бисенбаев А.К., Кениев А.М., Тазабекова Ж.Ж.,  Берсимбаев Р.И.  Онтогенетически  программированная гибель клеток эндосперма  созревающего зерна пшеницы// Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2003. -№3(21). — С. 40-45.

14  Jones R.L., Dangl J.L. Logjam at the styx: Programmed cell death in plants // trends Plant Sci. — 1996. — Vol. 1. — P. 114-118.

15  Бисенбаев А.К., Кениев А.М., Берсимбаев Р.И. Действие гибберелловой и абсцизовой кислот на апоптоз клеток алейронового слоя зерна пшеницы // Вестник КазГУ. Серия биологическая — 2001. — № 1(13). — С. 52-57.

16  Jacobsen J.V., Knox R.B., Pyliotis N.A. The structure and composition of aleuron grains in the barley aleurone layer // Planta. — 1971. — Vol. 101. — P.189-209.

17  Gilroy S., Jones  R.L. Perception of gibberellin and abscisic acid at the external face of the plasma membrane of barley (Hordeum vulgare L.) aleurone protoplasts. Plant Physiol. — 1994. — Vol. 104. — Р. 1185–1192.

18  Gomez-Cadenas A., Zentalla R., Walker-Simmons M.  and Ho T. H.  Gibberellin / abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: Site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules //  Plant Cell.  — 2001. — Vol. 13. — Р.  667–679.

19  Бисенбаев А.К., Алтыбаева Н.А., Берсимбаев Р.И.  Получение изолир-ованных протопластов из алейронового слоя зерна пшеницы // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2000. — №1(9). — С. 88-95.

20 Bethke P.C., Hillmer S., Jones R.L. Isolation of intact protein storage vacuoles from barley aleurone // Plant Physiol. — 1996. — Vol.110. — P.521-529.

21 Bethke  P.C.,  Jones R.L. Gibberellin signaling //  Plant Biol. — 1998.  — Vol. 1. — Р. 440–446.

22 Гильманов М.К., Сабитов А.Н., Саменов Н.А.,  Ибрагимова С.А., Мусабеков К. Изучение механизмов активации надф-гдг сферосом в семенах злаковых культур ионами Са²⁺, медиатором цитокинина и гиббереллином // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2006. — №3(29). — С. 111-116.

23  Jones R.L., Jacobsen J.V. Regulation of the synthesis and transport of secreted proteins in cereal aleurone. Int Rev Cytol. — 1991. — Vol.126. — P. 49–88.

24 Schuurink R.C., Bakhuizen R., Libbenga K.R., Boulanger F., SinjorgoM.C. Dormant barley aleurone shows heterogeneity and a specific cytodifferentiation // J. Cereal Sci. — 1997. — Vol. 25. — P. 27–36.

25 Rodaway S. J. Composition of alpha-amylase secreted by aleurone layers of grains Himalaya barley // Phytochemistry. — 1978. — Vol.17. — P.385-389.

26  Акаева М. М., Каракеева Р.К., Юсупова Р., Фурсов О. В. Активация альфа-амилаз из алейроновых зерен // Известия АН Каз ССР. — 1990. — Т.6. — С. 35-38.

27  Olszewski N., Tai- Sun and Gubler F. Gibberellin Signaling: Biosynthesis, Catabolism, and Response Pathways // Plant Cell. – 2002. — Vol. 65. — Р. 61–80.

28 Коф Э.М., Борисова Т.А., Аскоченская Н. А. Регуляторы роста природного типа и отдельные фазы онтогенеза // Итоги науки и техники. Серия физиология растений. — М.,  1990. — T.7. — C. 41-45.

29  Полевой В.В. Фитогормоны. — Л. Издательство ЛГУ, 1982. — С. 555-568.

30 Hanson J.R.  Aspects of diterpenoid and gibberellin biosynthesis in Gibberella Fujikuroi  // Biochem. Soc. Trans. — 1983. — Vol.11. — P. 522-528.

31   Long A.G. Gibberellins: Structure and metobolism // Ann.rev. Plant Physiol. — 1989.  -Vol.56. — P. 475-479.

32   Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. — М.: Мир, 1986. — T.2. — С.310.

33  Дерфлинг К. Гормоны растений.  — М.: Мир, 1985. — С.303.

34  Dockerill B., Hanson J. R. The fate of C₂₀ in C₁₉  gibberellin biosyntesis // Phytochemistry. — 1978. — Vol.17. — P. 701-704.

35  Пасешниченко Д. Pегуляция биосинтеза дитерпенойдов // Итоги науки и техники. Серия биологическая химия. — 1998. — T.25. — C.78-87.

36 Ogawa M., Hanada A., Yamauchi Y., Kuwahara A., Kamiya Y. and Yamaguchi S. Gibberellin Biosynthesis and Response during Arabidopsis Seed Germination // The Plant Cell. — 2003. — Vol. 15. — Р. 1591–1604.

37  Beale M.H., Bearder J. R., Down G. H., Hutchison M., MacMillan J. The biosynthesis of kaurenolide diterpenoids by gibberella fujikuri  // Phytochemistry. -1982. — Vol.21. — P.1279-1287.

38  Hedden P., Phillips A.L Gibberellin metabolism: New insights revealed by the genes // Trends Plant Sci. — 2000. — Vol. 5. — Р.  523–530.

39  Turnbull G. N., Crozier A., Schwenen L., Graebe J.E. Biosynthesis of gibberellin A₁₂ – aldehyde, gibberellin A12 and their kaurenoid precursor from [14C] mevalonic acid in a cell-free system from immature seed of phaseolus coccineus // Phytochemistry. — 1986. — Vol.25. — P.97-101.

40  Graebe J.E. Gibberellin biosythesis and control // Ann. Rev.Plant. Physiol. — 1987. — Vol.38. — P. 419-465.

41  Yoshihito S., Hisakazu Y., Clive R.S., paul G., MacMillan J., Bernard  P.O. Мetobolism of ent-kaurene to gibberellin A₁₂-aldehide in young shoots of normal maize // Plant Physiol. — 1982. — Vol. 98. — P. 602-610.

42  Ogura K., Shinka T., Seto S. The purification and properties of  geranyl geranyl pirophosphate syntetase from pumpkin fruit // J. Biochem. — 1972. — Vol.72. — P.1101-1108.

43  West C.A., Shen-Miller J., Railton I.D. Regulation of kaurene synthetase  // Plant Growth substances. London. — 1982. — Vol.22. — P. 81-90.

44  Graebe J.E. Gibberellin biosythesis in cell-free systems from higher plants // Plant Growth substances. – London, 1982. — P. 71-80.

45  Doglas T.J., Paleg L.G. AMO  1618  effects on incorporation of 14C-MVA and 14C-acetate into sterols in Nicotina and Digitalis seedlings and cell free preparations from Nicotina // Phytochemistry. — 1978. — Vol.17. — P.713-718.

46  Doglas T.J., Paleg L.G. AMO and sterol biosythesis in tissue and sub-cellular fractions of tobacco seedlings // Phytochemistry. — 1978 (b). — Vol.17 .- P.705-712.

47 Скоробогатова И. В. Гормональная регуляция ростовых процессов. М.:  МГПИ им. Н. К. Крупской,  1985. — C. 16-21.

48 Lange T. Molecular biology of gibberellin synthesis // Planta. — 1998. — Vol. 204. — Р.  409–419.

49  Живухина Г. М. Фитогормоны и их действие на растение. М.:  Hаука, 1982. — C. 45-49.

50  Gubler F., Chandler P.M., White R.G., Llewellyn D.Y., Jacobsen V. Gibberellin Signaling in Barley AleuroneCells // Plant Physiol. — 2002. — Vol. 129. — P. 191–200.

51 Jacobsen J. V., Higgins T.J., Сharacterisation of the alpha-amylase synthesized by aleuron layers of himalaya Barley in response to gibberellic acid // Plant Physiol. — 1982.  — Vol.70. — P. 1647-1653.

52  Richards  D.E., King  K.E., Ait-Ali T.  and  Harberd N.P. How gibberellin regulates plant  growth  and development:  A molecular genetic analysis of gibberellin signaling //  Annu. Rev. Plant Physiol.  Plant  Mol.  Biol. — 2001. — Vol. 52. — Р. 67–88.

53   Диксон А, Уэбб Э. Ферменты. — М.: Мир,  1982. — T.3. – С.350.

54   Кретович  В.Л. Биохимия зерна. — М.: Наука,  1981. – С.351.

55  Квеситадзе Г.И. Грибные и бактериальные амилазы. -Tбилиси,  1984. -С.209.

56  Manners D.J. Some acpects of the enzymic degradaion of starch // Plant Carbohydrate Biochem. Proc. Phytochem. Soc.symp. – London, New-york, 1974. — P. 109-125.

57 Ezcurra I., Wycliffe P., Nehlin L. Ellerstrom  M. and Rask L.Matsuoka  M.  α -amylase induction in endosperm during rice seed germination is caused by gibberellin synthesized in epithelium // Plant Physiol. — 2002.  — Vol. 128. — Р. 1264–1270.  

58   Bhattacharrya S., Sen-Mandi S. Studies into causes of nongerminating aged weat seeds // Annals of botany. — 1985. — Vol.56,  N.4. — P. 475.

59  Keller P.J., Kauffan D.L., Allan B.J., Williams B.L. Futher studies on the structural Differences between the isoenzymes of human parotid of aipha-amylase // Biochemistry. — 1971. — Vol.10. — P. 4867-4874.

60  Toda H. Chemocal structure of Taka-amylase A // Chemistry. — 1983. — Vol. 38. — P.90-100.

61  Arai M., Ikenaka T., Matsushima Y. The structure of glicopeptide obtained from Taka-amylase A // J. Biochem. — 1966. — Vol.59. — P.57-62.

62  Miobe S., Nakajima H., Itoh N., Funakoshi I., Yamashina I. Structure of a major oligosaccharide of Taka-amylase A // J. Biochem. — 1979. — Vol.86. — P. 1851-1854.

63 Hubbart S.S., Ivatt R.J. Synthesis and processing of asparagine-linked oligosaharides // Ann. Rev. Biochem. — 1981. — Vol. 50. — P. 555-583.

64   Hase S., Fujimura K., Kanoh M., Benaka T. Studies heterogecity of Taka-amylas A: Isolation of an amylase having one N-acetylglucosoamine residue as the sugar chain // J. Biochem. — 1982.  — Vol. 92. — P. 265-270.

65  Rogers J.C., Milliman C. Isolation and seguence analisis of a barley alpha-amylase c DNA clone //  J. Biol.Chem. — 1983. — Vol.258. — P.8169-8174.

66  Rodaway S. J. Composition of alpha-amylase secreted by aleurone layers of grains Himalaya barley // Phytochemistry. — 1978. — Vol.17. — P.385-389.

67  Melroy D., Jones R. L. The effect of monenin on intracellular transport and secretion of alpha-amylase isoenzymes in barley alleurone // Planta. — 1986. — Vol.167. — P.252-259.

68 Akazawa T. Hara-Nishimura J. Topographih aspects of biosynthesis, secretion and intracellular storage of proteins in plant //Ann. Rev. Plant physiol. — 1985. — Vol. 36. — P. 441-472.

69 Koshnar S., Dua S. An active-site carboxyl group in Liguefying alpha-amylase spesific chemocal modification // bioscience reports. — 1984. — Vol. 4, N.7. — P. 613-619.

70  Matojima K., Sabaguchi K. Part lysyl residues in wheat alpha-amylase is Gibson metylated as N-E-orimetyl lysine // Plant Cell Physiol. — 1982. — Vol. 23. — P. 709-712.

71  Дарканбаев Т.Б., Фурсов О.В., Хайдарова Ж.С., Аникеева Л.А., Маричева Е.К. Изоферменты α-амилазы зерна некоторых злаковых // Физиология и биохимия культурных растений. — 1980. — № 3. — С. 258-262

72  Бисенбаев А.К. Биохимические механизмы действия гибберелловой кислоты на синтез и секрецию альфа- амилазы из изолированного алейронового слоя зерна пшеницы: Автореф. канд.биол. наук: 03.00.04. – Алматы, 1994. –С.19.

73  Marchyllo R. H., Kruger J. E., Mcgregor V. W. Production of multiple form of alpha-amylase in germinated incubated, whole de embryonated wheat kernels // Cereal Chemistry. — 1984.  — Vol. 61, N.4. — P. 305-311.

74 Chung H.T., Pae H.O., Choi B.M., Billar T.R., Kim Y.M. Nitric oxide as bioregulator of apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2002. — Vol.282. — Р. 107-115.

75   Durner J., Gow A.J., Stamler J.S., Glazebrook J.  Ancient origins of nitric oxide signaling in biological systems // Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. — 1999. — Vol.96. — Р.14206–14207.

76   Neill S.J., Radhika D. and Hancock J.T. Nitric oxide signalling in plants // New  Phytologist. — 2003. — Vol.159.  — Р.11–35.

77 Chung H.T., Pae H.O., Choi B.M., Billar T.R., Kim Y.M. Nitric oxide as bioregulator of apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2002. — Vol.282. — Р. 107-115.