Дипломдық жұмыс: Бидайдың плазматикалық мембранасындағы Н+АТФ-азаның активтілігін анықтау

ӘЛ-ФАРАБИ АТЫНДАҒЫ ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

 

Биология факультеті

 

Биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиологиясы кафедрасы

 

 

 

 

БІТІРУ ЖҰМЫСЫ

 

Бидайдың плазматикалық мембранасындағы Н⁺АТФ-азаның активтілігін анықтау

 

 

 

 

 

Орындаған:                            

4 курс студенті                        ______________ Спанкулова З.Б

Ғылыми жетекшілері:

ҚР ҰҒА-ның

академигі                                  _______________Гильманов М. Қ

“__” ________2008ж

 

х.ғ.д., профессор                     ______________ Шойынбекова С.Ә

“__” ________2008ж

 

Норма бақылаушы:                 ______________ Акимбекова А.Б.

“__” ________2008ж

 

Қорғауға жіберілді:

Кафедра меңгерушісі, 

б.ғ.д., профессор                     _______________ Иващенко А. Т.

“__” ________2008ж                                           

 

 

 

 

 

 

 

Алматы, 2008

 

                                                РЕФЕРАТ

 

Бітіру жұмысы: 29 беттен, 35 әдебиеттен, 4 кесте, 3 суреттен тұрады.

Бітіру жұмысын Спанкулова Зере Бақтыбекқызы М.А. Айтхожин атындағы биохимия және молекулалық биология институтының ферменттердің құрылымы мен реттелу лабораториясында өткізді.

Өзектілігі: Мембранамен байланысқан АТФ тәуелді ферменттердің биохимиялық қасиеттерін анықтап, оларға цитокинин медиаторының әсерін зерттеу ферменттердің белсенділігін арттырып, ауылшаруашылығы дақылдарының   өнімділігін жоғарылатады.

Негізгі сөздер: бидай дәні, ұрық бөлігі, алейрон қабаты, Н⁺АТФ-аза НАДФ глютаматдегидрогеназа, цитокинин, цитокинин медиаторы, фузикокцин

Алдына қойылған мақсаты: Бидайдың плазматикалық мембранасындағы Н⁺АТФ-азаның биохимиялық қасиеттерін анықтау және оған цитокинин медиаторының әсері мен оның физиологиялық, биохимиялық қасиеттерін сипаттау және биотехнологияда қолдану жолдарын қарастыру.

Қолданылған әдістер: Октил сефароза (CL-4B) гидрофобты хроматографиясы және RP-18 колонкада жасалынатын жоғары қысымды кері  фазалы хроматография, гомогенизациялау, центрифугалау.

 

Қысқартылған сөздер

 

НАДФ-ГДГ-никотинамидадениндинуклеотидфосфат глютаматдегидрогеназа

ЦББ–цитокинин байланыстырушы белоктар

АТФ-аденазин үш фосфат

АДФ-аденазин екі фосфат

ГДГ–глютаматдегидрогеназа

ФК–фузикокцин

6-БАП–бензоламинопурин

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

МАЗМҰНЫ

 

КІРІСПЕ……………………………………………………………………………………………..	5
1.ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ………………………………………………………………………..	6
1.1. Фузикокциндердің ашылуы және химиялық табиғаты……………………	7
1.2. Өсімдіктердің катионмен белсендірілген АТФ-азалары…………………	14
1.3. Цитокинин медиаторын тазарту және оның бидай тамыры өскіндерінің плазмалық мембрасының Н+АТФ-азасына әсерін зерттеу…	15
1.4. Цитокининді байланыстырушы белоктар және цитокинин медиаторы…………………………………………………………………………………………..	16
2. МАТЕРИАЛДАР МЕН ӘДІСТЕР…………………………………………………….	18
2.1. Зерттеу әдістері мен объектілері……………………………………………………	18
3. АЛЫНҒАН НӘТИЖЕЛЕР МЕН ОЛАРДЫ ТАЛДАУ……………………….	19
ҚОРЫТЫНДЫ……………………………………………………………………………………	26
ҚОЛДАНЫЛҒАНӘДЕБИЕТТЕ……………………………………………………………	27

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

КІРІСПЕ

 

М.А. Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтының ферменттердің құрылымы мен реттелуі лабораториясында ең алғаш рет фузикокцинге ұқсас екінші реттік цитокинин гормоны ашылды. Ол клеткадағы сигналды трансдукцияда маңызды роль атқаратындығы анықталды. Медиатор екінші сатыдағы сигналды беретін зат, себебі гормон тікелей өзі емес медиаторлар арқылы клеткаға әсер ете алады. Сол себептен цитокинин медиаторын зерттеу ғалымдардың қызығушылығын тудырады. Себебі осы цитокинин медиаторы клетка ішіндегі мембранамен байланысқан ферменттерге әсері өте жоғары [1].

Бұл медиатор бидай тұқымының өніп жатқан ұрығында цитокинин әсерінен пайда болады. Фк мен цитокинин медиаторы арасында жақын қатынасты дәлелденген қосыша мәліметтер алуға болады. Бұл жоспарда ФК-нің өсімдік клеткасының плазматикалық мембранасының Н⁺АТФ- азасының активтілігіне қасиеті бар екені белгілі. Осы себепті бидай өскіндері тамырының плазматикалық мембранасының  Н⁺АТФ- азасына цитокинин медиаторының әсерін зерттеу мүмкіндігі туындайды [2]. Екінші реттік цитокинин гормоны бидай дәніндегі ұрықтық емес бөлігінің плазматикалық мембранасындағы Н⁺АТФ-азасын активтендірмейтіндігі белгілі болды. Осыған байланысты осы екінші реттік цитокинин гормонының бидай дәнінің алейрон қабатындағы плазматикалық мембрананың Н⁺ АТФ-азасына әсерін зерттеу қажет болды.

 Осы себепті зерттеудің мақсаты: бидай дәнінің алейрон қабатындағы плазматикалық мембрананың Н⁺ АТФ-азасының активтілігін жоғарылату.

           Осы мақсатқа жету үшін алға қойылған міндеттер:

1. Цитокинин медиаторын бөліп алу;
2. Бөліп алынған цитокинин медиаторының бидай дәнінің алейрон қабатындағы плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ-азасының активтілігіне әсерін қарастыру;

 

 

             

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ

 

          Гормондар– тірі организмдердің тіршілігі үшін маңызы өте зор. Организмдердің дамуы, өсуіндегі ең негізгі процестер гормондармен реттелуге тәуелді. Гормондар жетіспеген жағдайда немесе артып кететін болса онда организмді ауруға ұшыратады [3,4].

Яғни осы қызметтеріне қарап гормондарды-организмді реттеуші патшалық деп айтуға болады. Өсімдік тіршілігін реттеуде өсімдік гормоны цитокининнің  маңызы зор [5]. Цитокининнің функциясы өсімдік онтогенезінің барлық кезеңдерінен көрінеді. Цитокининді зерттеу аймағындағы жаңа жетістіктер мен көріністерге кейінгі жылдары ғалымдардың қолы жетуде.

Цитокинин– клетка бөлінуін реттейді, хлоропластардың дифференцациясына қатысады. Клетка бөлінуі үшін цитокининнің маңызы зор. Осы гормонның сигналды трансдукция механизмі әлі анықталмаған. Кейінгі зерттеулердің барлығы дерлік өсімдік фитогормондарының өсу процесіне, клетка бөлінуіне әсерін зерттеу бағытында жүргізіледі. Фитогормондар клеткамен клетка, ткань мен ткань, мүше мен мүше байланысқанда көптеген морфогенетикалық және физиологиялық программаларды атқарады [6].

Фитогормондар өсімдік организміндегі заттардың мөлшеріне, маңыздылығына, көбею ерекшелігіне, клетканың бөлінуіне, тыныс алуға, қартаюға, зат алмасуға қатысады. Өсімдік тіршілігін реттеуде өсімдік гормоны цитокининнің маңызы зор [7].

Цитокининнің функциясы өсімдік онтогенезінің барлық кезеңдерінен көрінеді. Цитокининді зерттеу аймағындағы жаңа жетістіктер мен көріністерге кейінгі жылдары ғалымдардың қолы жетуде.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.1. Фузикокциндердің ашылуы мен химиялық құрылысы

 

          Фузикокцинді (ФК) 1964 жылы италияндық ғалым Alessandro Ballio Fusicoccum amygdale фитопатогенді саңырауқұлағының фитоитоксині ретінде ашты. Бұл фитоксин жас миндаль ағаштарының жапырақтарының саңылауларын ашқан да, осыдан соң олар жабылмаған [7,8]. Артық транспирация және тамыр жүйесінің әлсіздігінің нәтижесінде жас ағаштар тез кеуіп кетеді, яғни фузикокцин табиғи дексикант болып табылады. Профессор A.Ballio лабораториясында осы фитотоксиннің құрылысы анықталынды (1-суретте көрсетілген )

          Фузикокциннің гибберлиндер сияқты табиғи терпеноидтарға жататындығын Gronevald авторларымен бірге ескере отырып, гибберлиндер мен фузикокциннің туыстығы туралы гипотезаны шығарды. Бұл екеуі де ауру саңырауқұлақтардың дитерпеноидтары, метаболиттері болып табылады. Уақыт өткен сайын гиббереллиндердің саны артуда. 1960-1980 жылдардын бері сол сияқты фузикокциндердің де 15-ке жуық топтары белгілі болды. Олар А,В,С символдарымен ажыратылады [9].

          Жоғары сатылы өсімдіктерде фузикокцин тұқымдасына жататын заттардың бар болуы туралы алғашқы мәліметтерді 1980 жылы Муромцев қызметкерлерімен бірге тұңғыш рет баспадан басып шығарды. Кейін фузикоцинді табу үшін жоғары қысымды сұйық хроматографта материалды алдын ала фракционерлейтін хроматоспектрометрияны қолданды. Бастапқыда авторлар Fusicoccum amygdale саңырауқұлағының културальды сұйықтығында фузикокцинді метаболиттерді анықтаудың тәсілдерін ойлап тапты, ол газды хроматография мен трисилил туындыларының масспектрометриялы аралас әдісі, мұнда детектирлеу бірнеше таңдалған сипатталған иондармен жүзеге асады [10].

          Авторлар фузикокцинді алу үшін жүгері собығын және орамжапырақ жапырақтарын қолданды. Оларды этил спиртінде гомогенизирледі. Спиртті экстрактыларды концентрлеп, концентратты хлороформмен экстрагирледі. Хлороформды экстрактыны сұйық хроматографиядан өткізді. Алынған пикті ізінше масспектрометриямен жүретін газ сияқты хроматографияға сынады.

          Өсімдіктегі экзогенді А фузикокциннің құрамы 10^-10-10^-12М құрады, бұл эндогенді гибберлиндердің құрамынан 2-3 есе төмен. Бұл жерден жоғары сатылы өсімдіктерден табиғи фузикокциндердің препаратты мөлшерін бөліп алу мәселесі күрделі екендігі анық болып отыр [11].

          Кейінірек жоғары сатылы өсімдіктерден табиғи фузикокцинді бөліп алудың тағы да бір мүмкіндігін осы авторлар қолға алды. Бұл жерде авторлар фузикокцинді бөліп алудың обьектісі ретінде қарқынды өсуімен ерекшеленетін трансформацияланған қына тамырларының культураларын пайдаланды. Бұл обьектіні таңдап алу себебі төмендегідей, біріншіден фузикокциннің көзі болып табылатын микроорганизмдер мен саңырауқұлақтардың зақымдану мүмкіндігі толығымен болмады. Екіншіден, олардың қарқынды өсуіне байланысты тамыр клеткаларының культурасын көп мөлшерде алуға болады [12].

 

     1 сурет  Fusicoccum amygdali Del. Фитопатогенді саңырауқұлағының фузикокцин — фитотоксин формуласы (1964 жылы Ballio et all сипаттаған)

 

 

          Тамыр клеткаларының культураларынан авторлар спиртті экстрактыларды алды. Экстрактыларды вакуумның астында буландырып, су қалдықтарын хлороформмен экстрагирледі, одан соң сулы және хлороформды фазаларда фузикокциннің болуын анықтауды иммунды тәсілмен жүргізді. Фузикокцин хлороформда болды, ал сулы фазада тек іздің мөлшері ғана болды, ал бұл белок және қант қосылыстары сияқты рецепторлар мен антиденелердің тиімді байланысуын тежейді. Фузикокцин сияқты заттарды тамырдың барлық культивирлену кезеңінде тауып отырды (14 тәуліктен бастап). Тазартылған тамырда өсірілген фузикокциннің максимальды құрамы 1кг тамырға 150н моль-ге дейін құрайтынтындығы анықталды [11,13].

          Алынған фракциялардың масспектрометрлі анализі мынаны көрсетті: негізінен А типті фузикокцин болды, сондай-ақ берілген анализдер басқа анықталынбаған фузикокциннің болу мүмкіндігін көрсетті. Зерттеулер нәтижесінде эндогенді фузикокцинді идентификациялау қиын деген қорытындыға Муромцев қызметкерлерімен тоқталды.

          Алғашқы және негізгі идентифицирленген фузикокциндердің бірі А фузикокцині болып табылады. Ол өз алдына гликозидті үш корбооксилді дитерпендер, молекулалық салмағы 680 кД және формуласы С₃₆Н₅₆О₁₂

          ФК молекуласының агликонды бөлігі үш циклді жүйе болып табылады. Бұл жүйе сегіз бұрышты және бес бұрышты сақинаны біріктіреді, сонымен қатар ФК –нің молекуласының агликонды бөлігі тотығу кезінде ацетилді топпен байланысады. ФК-нің 10 шақты түрі моно, ди, үш ацетаттар. ФК басқа қатары өзгеше құрылысты болып келеді. Олардың 20-ыншы көміртегі атомы тотықпаған. Әдебиеттегі мәліметтер бойынша фузикокциннің молекуласы табиғатта кең таралған дициклопентан және циклооккандардың байланысының туындысы болуы мүмкін деген тұжырымдар бар [14]. Мұндай құбылыстар саңырауқұлақтарда, балдырларда, кейбір жоғары сатыдағы өсімдіктерде, тіпті жануарларда (жәндіктерде) байқалған. Фузикокциндердің көптеген түрлері әртүрлі организмдерден бөлініп алынған, мысалы: фузикоплагин С, анаденсин, эпоксидилтимен,т.б. Циклопентанды, циклооканды байланыстары бар терпеноидтар номенклатурасы бойынша фузикоккандар қатарына кіреді. Мұндай фузикоккандардың байланысы транс–син-транс С₂₀-көмірсутек ретінде белгілі болған [14].

          Фузикокцинді ары қарай зерттеу олардың физиологиялық, биохимиялық қасиеттерінің алуан түрлі екенін көрсетеді. Бұл жағдай көптеген өсімдіктердің өсуінде табиғи реттеуші екендігіне мүмкіндік береді. Көптеген жоғары сатыдағы өсімдіктердің клеткалары, мүшелері, ұлпалары ФК көлемінің ұлғаюына жауап беруге байланысы бар, сол сияқты саңылаулардың ашылуы, ұрықтың өсуінің қарқыны, көбеюі, т.б. процестерге байланысы бар. ФК және ФК заттар тұқымның өсуіндегі маңызды эндогенді реттегіш болып табылады деген мәліметтер бар. Г.С. Муромцев лабораториясында ең бірінші рет фузикокциндердің тұқымның ризогенезіне активті әсер ететіні анықталған. Фузикокцин асбұршақ тұқымының өсуіне өте қызықты әсер көрсетті. Осылайша ол котилидон клеткаларының өнуін стимулдап отырды да, бір жағынан осьтің ұрықтарының өсуін тежеп отырды, бұл фузикокциннің полярлы әсері бар екендігін көрсетеді [11,14]. Микроорганизммен зақымдалуына маңызды роль атқарады, яғни фузикокцин бұршақ тұқымдастарда түйнектердің түзілуін активтейтіні анықталды.

          Фузикокцин жапырақтың бағаналы клеткаларымен көмірқышқыл газын меңгеруін активтейді. Сондай-ақ фузикокцин Vigna angularis калеоптилінің клеткалар апопластарындағы аскорбат концентрациясын реттейді.

Фузикокциндердің гормоналдық қасиеттерінің бірі–оның антистресстік активтілігі. Г.С.Муромцев ФК–нің әртүрлі орта жағдайларында тұқымға әсер етуін дәлелдеген. Өсімдіктер үшін ФК еш күмәнсіз маңызды да, күшті антистресстік байланыс болып табылады . Муромцев қызметкерлерімен бірге өсуге қолайсыз жағдайда тұқымдардың ұқсастығын фузикокцин арттыруға қабілетті екенін көрсетті, мысалы: жоғары және төмен температураларда, артық ылғалдануда, тұздануда және т.б. РАН өсімдіктер физиологиясы институтының қызметкерлері тұқымдарды малу (0,68 мг/л фузикокцин), қыстық бидай, арпа, сұлыға шашырату (0,34 мг/л фузикокцин) арқылы өсімдіктердің аязға төзімділігін арттыратындығын көрсетті. Аязға төзімділіктің артуы фотосинтетикалық аппараттың даму деңгейімен қанттың жиналуымен жақсы коррелирленеді, сонымен қатар, клеткада эндоплазматикалық ретикулумның дамуын жылдамдатумен де ерекшеленеді. Фузикокцин күрішті тұзданудан қорғайтындығы, әртүрлі ауруларға картоп түйнектерінің тұрақтылығын арттыратындығы көрсетілді. Фузикокцин өсімдік үшін ең күшті әсер ететін антистресті қосылыстардың бірі болып есептелінеді [14,15]. Фузикокциннің осмотикалық стреске бейімделу кезіндегі жағымды ролі анықталды.

          Біз үшін фузикокциннің биохимиялық активтілігін зерттеу бойынша деректер қажет. Тұңғыш рет 1977 жылы Alessandro Ballio қызметкерлерімен бірге жүгері өскіндерінің ұштарынан бөліп алынған плазматикалық мембранасынан фузикокцинді рецепторларды тапты. De Boer қызметкерлерімен бірге Фк байланыстыратын белоктарды тазалауда арнайы аффинді сорбентте тазалау әдісін ойлап тапты, бұл жерде активті топ ретінде биотинилирленген фузикокцин тігілген [16].

          Осы авторлар фузикокцин байланыстырушы белоктарды бөліп алуда жұмыстар жүргізді. Richard G.Stout және Robert E. Cleland фузикокцинді рецепторды зерттеу үшін фузикокцинге қарсы моноклональды антиденелерді алды.

          Фузикокцин үшін мүмкін рецепторлар берілген, олар фузикокцин байланыстырушы белоктартың (ФКББ) екі типі. Бірінші типінің константты диссоциациясы (Kg) шамамен 10^-11М (жоғары аффинді ВА) болатын фузикокцинге жоғары ұқсастығы бар, ал екінші типінің константты диссоциациясы (Kg) шамамен 10^-7М (төмен аффинді НА) болатын төмен ұқсастығы бар рецепторлар. Тұңғыш рет осы рецепторлар жүгері калеоптилінің плазматикалық мембранасы бар функциялардан табылды. Жұмыста белгіленген мембраналарда рецептордың жоғары аффинді сайттары мөлшерінің төмен аффинділірге қатынасы — [ВА] / [НА] шамамен 1-ң 2-ге қатынасын құрайтындығы көрсетілген. Авторлар фузикокцин әсеріннен тек жоғары афиндік сайттың байланысуы қатысады деген тұжырымға келді. Мұндай көзқарастар  кейінгі жылдары басымдылық таныта бастады. Фузикокцин рецепторы ретінде жоғары аффинді сайттың қатысуы фузикокцин байланыстырушы белоктан және Н⁺АТФ–азадан құралатын in vitro жүйесінің реконструкциясы бойынша жұмыс істеген авторлармен болжамдалады [17].

          Көптеген оқшауланған мембраналарда төмен аффинді сайттардың аз ғана мөлшері немесе жоқтығы бөліну процесінде олардың инактивациясымен байланысты болуы мүмкін. Бұл жоғары аффинді сайтпен салыстырғанда төмен аффинді сайттар байланысының үлкен лабильділігімен түсіндіріледі. Қазіргі уақытта жоғары және төмен аффинді сайттардың қызметтік ролі туралы сұрақтар зерттеу обьектісі болып отыр.

          Жоғары аффинді фузикокцин байланыстырушы белоктарды зерттеуде жақсы нәтижелерге қол жеткізді, олар бөлініп алынып сипатталынды. Бір жағынан, бұл белоктар гетеродимерлер болып табылатындығы көрсетілді (әрбір мономердің молекулалық массасы 30 кДа жақын) Бұл полипептидтердің сиквенс бойынша мәліметтері сұлының тамырының, Commelina communis жапырақтарының және жүгерінің калеоптилінің ФКСБ құрылымы бойынша белоктардың 14-3-3 класына жататын эукариоттардың көпфункциональды реттегіш белоктарымен гомологты болып келетіндігі көрсетілді. Фузикокцин байланыстырушы белоктар 14-3-3 белоктар тұқымдасына жататындығы туралы De Boer-дің жұмысында көрсетілген. 14-3-3 белоктар редуктаза нитратын ингибирлейтіндігі көрсетілді, алайда бұл белоктардың фузикокцинмен байланысуынан кейін редуктаза нитратының активациясы байқалды.

          ФК Н⁺АТФ-азаның бірден бір активаторы болып саналады. Ол 14-3-3 белок регуляторымен байланысқан. Сондықтан да Н⁺АТФ-аза фузикокциндердің үш құрылымды 14-3-3 белогымен байланысты болып келеді. Бұл белоктар эукариотты организмдердің барлығында, ашытқы саңырауқұлақтардан бастап жоғары сатыдағы өсімдіктерден және жануарларға дейін табылған. Бұл белоктардың қызметі ДНҚ мен байланысқан транскрипция факторындағы протеинкиназаның активтенуіне қатысады. 14-3-3 белогының рецепторлық қызметі әлі белгілі емес. Басқа жағынан қарағанда, ФКСБ мембранада молекулалық массасы 90 кД болатын полипептид ретінде , ал комплексте молекулалық массасы 30кДа болатын полипептид екендігі туралы мәліметтер бар [17].

          Фузикокциннің мембраналық эффектілері тез жауаптарға жатады әдетте протондар шығуының стимуляциясы фузикокцинді қоса салысымен басталады және лаг фазасы болмайды. Тез мембраналық эффектілермен қатар Фк өсімдіктерде пролингирленуші, генерализдеуші болып әсер ете алады, ал бұл оның гормональды қасиеттері үшін ұтымды. Басқа фитогормондар мен өсуші регуляторға қарағанда (гибберлин) фузикокциннің 2-3 қатарға төмен дозасы (10-20мг/га) назар аудартады. Бабаков жұмысында ФК протеинкиназа активациясындағы ролі қарастырылуда [18] .

          Фузикокциннің клеткаларға әсері қызығушылық тудырады. Ең алдымен ФК әсерінен клетка құрамының қышқылдануына қатыстығы туралы айтуға болады. ФК сұлы калеоптилінің клеткасында протондардың шығуын реттейді деген дерек зерттеу жұмыстарында тұңғыш рет көрсетілді. Аталған процестер Н⁺АТФ-азаның қызметінің реттелуі кезінде немесе плазмалемманың ионды каналдары арқылы иондар ағуының төмендеуі кезінде активтеледі. Шынындада кейінгі мәліметтерге жүгінсек, ФК Н⁺АТФ-азаның активтілігіне де плазмалемманың калий каналдарының өткізгіштігіне де әсер етеді [19].

          Claudio Olivari қызметкерлерімен тұңғыш рет Н⁺АТФ-азаның Фк мен активтелуі үшін тағы да басқа белоктың болуын қажет ететіндігін бекітті. Claudio Olivari жұмысында фениарасин оксид Н⁺АТФ-азаның фузикокцинмен активациясында спецификалық ингибитор болып есептелетіндігі дәлелденген.

          Фузикокцин 14-3-3 реттеуші белокпен байланысу арқылы плазматикалық мембранасындағы Н⁺АТФ-азаның активаторы екендігі анықталды, осылайша Н⁺АТФ-азаның активациясы тек үштік комплекстің фузикокцин, 14-3-3 белок, Н⁺АТФ-азаның түзілуінде ғана мүмкін болады. Мүмкін, фузикокцинмен активтенетін Н⁺АТФ-аза кальций ионына спецификалық болады да, кальций ионының цитоплазмаға тасымалдануын жүзеге асырады. Бұл басқа жағдайлар үшін өте маңызды [18,20].

          Сұлтанбаев Б.Е. қызметтестерімен жүргізген А₂₃₁₈₇ антибиотигімен жүргізген жұмысы бидай дәнінің ұрықсыз бөлігіндегі НАДФ – ГДГ активациясы үшін цитозольды Са²⁺-ң деңгейін реттеп отыруға болады деп тұжырым жасады. Авторлардың цитозольды Са²⁺-ді реттеу бойынша жұмыстары келесідей түрде өткізілді: ионоформен өңдеген ұрықсыз жартыларын 10мМ CaCL₂ бар ерітіндіге орналастырды. Бұл кезде кальций ионофор түзген кальций каналдары арқылы клетканың ішіне еркін өтті. Осылайша цитозольды Са²⁺-ң деңгейі артып отырды. Басқа жағдайларда ионоформен өңделген ұрықсыз жартыларды кальций байланыстырушы  оселат ДГТА (этилен гликоль тетраацетат) бар ерітіндіге орналастырды, цитозольды кальций клеткадан ағып шыға бастады да цитозольды кальцидің деңгейі жасанды түрде төмендеді. НАДФ-ГДГ активациясын эмбриональды фактордың көмегімен толығымен басып тастауға болады, егер де ЭГТА-ң көмегімен цитозольды Са²⁺-ң деңгейін жасанды төмендетсе, сол сияқты  жасанды түрде цитозольды Са^2+-ң деңгейін арттырса, онда авторлар НАДФ-ГДГ активациясы ешбір факторсыз жүргендігін байқады.

          Осылайша, бұл нәтижелер цитозольды Са²⁺ деңгейі ғана НАДФ-ГДГ активациясы үшін анықтаушы екендігін көрсетеді. Алайда Сұлтанбаев  қызметкерлерімен клеткадағы кальций ионы деңгейінің жоғарылауын қамтамасыз ететін механизмдерді зерттемеді.

          Кальций ионының клетка ішіне келуін Са²⁺ спецификалық транспортты АТФ-азаның көмегімен плазматикалық мембрана арқылы активті ионды транспорт қамтамасыз етіп отыру керек екендігін дұрыс деп болжады. Сол себепті плазматикалық мембраның протонды кальцилі АТФ-азасының активациясына эмбриональды фактордың эффектілерін зерттеу маңызды тәжірибелердің бірі болып отыр [21].  

          Барлық тірі клеткалар ішкі бөліктерді сыртқы ортадан бөлетін жұқа қабықтан тұрады. Ондай қабық плазмалық мембрана деп аталады. Клетка ішіндегі ядро, митохондрия, хлоропластар, гольджи аппараты, эндоплазмалық тор, лизосома сияқты органеллаларды да жеке мембрана қоршап тұрады. Бұл аталған органеллаларды плазма бөліктерінен (ферменттерден, метаболиттерден, т.б.) мембрана бөліп тұрады.

          Клетка өзінің тіршілігін қамтамасыз ету үшін үнемі сыртқы және ішкі мембраналар әр түрлі заттарды тасымалдайды. Мембраналар заттар үшін таңдаулы өткізгіш барьер болып табылады. Мембрана жартылай өткізеді, ол арқылы молекулалар мен иондардың өтуі таңдамалы түрде іске асырылады және ол белсенді түрде реттеліп отырылады. Көптеген заттар белсенді түрде тасымалданып мембрана арқылы ішке енеді. Мембрана липидтерден, белоктардан және көмірсулардан құралады, дегенмен оның негізгі бөлігі липидтер мен белоктар. Клетка мембранасының құрамында белоктар бар. Олардың кейбіреулерінің молекулалары липидтік биқабаттың сыртына орналасады, ал белок молекулалары бүкіл мембрана құрамына енеді [19,20,22].

Плазматикалық мембраналар әр түрлі иондарды іріктеп тасымалдау нәтижесінде клетканың ішіндегі сұйықтардың және сыртқы сұйықтардың иондарының концентрациясының градиенті пайда болады. Бұл иондық концентрация градиентінің нәтижесінде потенциал энергия пайда болады .

Тірі клеткаларда пассивті және активті транспорт болады. Пассивті транспорт дегеніміз концентрация градиенті бойы немесе электрохимиялық градиенті бойы заттардың тасымалдануын айтамыз. Пассивті транспорт липопротеинді комплекс нәтижесінде түзілген арнайы каналдар арқылы (Na, K және басқа каналдар) жүреді. Қанттар, амин қышқылдар және т.б субстраттар арнайы тасымалданушылармен өсімдіктерде, бактерияларда және саңырауқұлақтарда Н⁺ионымен, ал жануарларда Na⁺ионымен тасымалданады. Бұл жердегі қозғаушы күш субстрат градиенті емес, иондардың градиенті болып саналады.

Иондардың тасымалдануы электрохимиялық градиентке қарсы болса, оны активті транспорт деп атаймыз. Активті транспорт АТФ энергиясын пайдалану арқылы АТФ тәуелді ферменттердің көмегімен жүзеге асады. Белгілі АТФ-азаларға К⁺, Na⁺, H⁺, Ca⁺  және анионды АТФ-азалар жатады.Н⁺ иондарының активті транспорты НАДН, НАДНФ немесе басқа қышқылды қосындылардың редокс-тізбегінің энергиясымен қамтамасыз етіледі. НАД(Ф)Н немесе АТФ энергиясын пайдалану арқылы Н⁺иондарының тасымалдануы протонды помпа деген атауға ие немесе оны Н⁺ помпалар, Н⁺насос деп атауға да болады[12,23].

Заттарды мембрана арқылы өткізу — барлық тірі клеткалар үшін аса үлкен маңызы бар түйінді процесс. Қалыпты тіршілік кезінде клетка қоректік заттарды, әртүрлі метаболиттерді сіңіруі және сонымен бірге өзіне қажетті қосылыстарды бөліп шығаруы тиіс. Глюкоза, амин қышқылдары, май қышқылдары сияқты ұсақ молекулалардан Н⁺,К⁺,Na⁺,CI^— иондары плазмалық мембранада өткізуге көмектеседі. Н⁺,К⁺,Na⁺ иондарын активті түрде алып өтуге қатысатын К⁺,Na^+- насосы белгілі бір белоктың — мембраналық ферменттің әрекетімен байланысты. Бұл ферменттің белсенділігі клетка ішіндегі Na⁺ концентрациясының және клетка сыртындағы К⁺ концентрациясына байланысты. Бұл екі ион сонымен қатар сутегі ионы да мембрананың екі жағында орналасуы қажет. Осыған байланысты К⁺,Na⁺ насосының жұмысына жауап беретін мембраналық фермент Н⁺АТФ-аза деп аталады. Бұл фермент өз белсенділігін Mg²⁺  қатысында активтенеді [24].

АТФ молекуласы гидролизденген кезде мембранадағы каналдар арқылы үш Na⁺ ионы клеткадан сыртқа шығады және екі К⁺ионы сырттан клетка ішіне енеді. Мембрананың екі жағындағы иондар концентрациясының әртүрлі болуы осылайша орындалады. АТФ-аза ферментін клетка ішінде осы иондар белсендіреді. АТФ ферменттің активті орталығымен байланысады да цитоплазмадан үш Na⁺ ионынын өзіне қосып алады. Осының әсерінен АТФ гидролизденіп, АДФ және Н₃PO₄ ыдырайды. Бұдан кейін АТФ аза ферменті АТФ – тан бөлініп шыққан фосфор қышқылы есебінен фосфорланады. Фосфорлану белок пішінін өзгертеді, каналдар ашылады да, олар арқылы  Na⁺ иондары мембрана сыртына шығады. Na⁺ ионынан босаған фосфорланған белокқа клетка сыртындағы ортада екі калий ионы қосылады, содан кейін гидролиз жолымен фосфат белоктан бөлінеді. Бұның нәтижесінде белок пішіні қайта өзгереді де, ол бастапқы пішініне қайта келеді, клетка ішіндегі канал ашылады да, К⁺ сорылып клеткаға енеді [7,25].

 

 

1.2. Өсімдіктердің катионмен белсендірілген АТФ-азалары

 

Қазіргі кезде өсімдік және жануар клеткаларында жоғары ионды градиенттерін құрастыруда электрохимиялық градиентке қарсы ион тасымалдаушы белсенді механизмдер қатысады. Сонымен қатар белсенді тасымалдаудың негізін, иондарды және энергияны тасымалдау процесіне қатысатын АТФ — азды ферменттік жүйе құрады деген мәліметтер де бар. Шаянның перифериялық жүйке жүйесінен бір валентті катионмен активтенген АТФ-азаны Скоу ашқаннан кейін, осы типті ионды активті байланыстыратын фермент жануарлардың әртүрлі ұлпаларынан табылған.

Na- K- H⁺АТФ-аза сол сияқты өсімдік клеткаларынан да табылған. Оның тамыр ұлпаларында кездесуі және тамырдың сыртқы клеткасының плазмадесмаларында жинақталуы, осы ферменттік жүйе катионды тасымалдау процесіне қатысады деген болжам жасауға мүмкіндік береді. Алайда, жануарларға қарағанда тасымалдау процесінің АТФ-азды жүйемен белсенді байланыстылығын көрсете алатын тікелей тәжірибелік мәліметтер жоқ. Сонымен қатар осы уақытқа дейін жануар клеткасындағы ферменттерге ұқсас АТФ — аза өсімдік клеткаларында да жоқ деген көзқарастар болған.

Өсімдік клеткасындағы АТФ-азаның қасиеттері мен оның өсімдік клеткасында жинақталуын зерттеу барысында, бұл ферменттік жүйесінің иондық құрамы мен ортаның рН-на өте сезімтал екені анықталған. Сезімталдық қасиетін зерттеу барысында оның активтілігінің субстратқа, активаторға, ингибиторға және басқа да жағдайларға байланысты екендігі анықталған. Осыған орай АТФ-азаның көп болуының себебі ферменттің жоғарғыдағыдай модификациясы, олардың қатысуымен жүретін процестерді реттеуші механизмі болуы мүмкін деген болжамдар жасалған. Сондықтан да АТФ-азаның бір валентті катиондарды тасымалындағы активтілігі үшін арнайы жағдайлар жасалған. Соған байланысты бүтін өсімдіктерге физиологиялық тәжірибелер жүргізілген. Бұл тәжірибелерде қоректік ортаның иондық құрамын өзгерте отырып, сәйкес келуші АТФ-азаның немесе оған ұқсас фермент модификациясының белсенділігін туғызуға бағытталған [20,26].

Клетка мембранасы арқылы иондардың белсенді тасымалдануын түсіндіру үшін қазіргі кезде өзіндік қасиеті бар тасымалдаушы- фермент кеңінен қолданылуда. Жүргізілген зерттеу жұмыстарының көпшілігі К⁺, Na⁺ және Н⁺ иондарының транспорты жануарлар клеткасының мембранасынан табылған өзіндік қасиеті бар «тасымалдаушы» АТФ-аза белсенділігімен тығыз байланысты екендігін көрсетеді. АТФ-азаның негізгі белгілеріне Mg⁺ бар жерде К⁺,Na⁺ және Н⁺ иондарымен белсенділігінің жоғары болуы жатады. АТФ-азаның тасымалдау жүйесі әмбебапты болып келеді және тек жануарлар клеткасында ғана емес өсімдіктер клеткасында да қызмет атқарады. Өсімдіктер клеткасында АТФ-азды белсенділік табылғанымен олардан тасымалдаушы АТФ-азаға тән белгілер табылмаған. Бірнеше жұмыстардың жүргізілуі барысында ғана өсімдіктер АТФ-азасы катионға тәуелді екені анықталған. Әртүрлі авторлардың мәліметтері бойынша жануарлар клеткасындағы АТФ-аза әсересе мембрана бетінде белсенді болған. Сондықтан да өсімдік клеткасының мембраналарының үстінде орналасқан АТФ-азаның өзіндік қасиеті мен белсенділігін анықтау қызығушылықты тудырады. Бірақта өсімдіктерден беттік мембраналарды бөліп алу әлі күнге дейін мүмкін болмай отыр. Егерде ұлпаларды плазсмолизсіз гомогендейтін болса, онда клетка қабырғасының фракциясы беттік мембранаға бай болады деген болжам бар [19,27].

 

 

1.3. Цитокинин медиторын тазарту және оның бидай тамыры өскіндерінің плазматикалық мембранасының Н⁺АТФ–азасына әсерін зерттеу

 

Цитокинин медиаторы деп аталатын цитокининнің екіншілік гормоны зерттелінген. Цитокинин медиаторының сипаттамалары: ол цитокининге қарағанда 100-1000 есе аз концентрацияда әсер етеді, фузикокциндерге қатысты арнайы қасиеттерге ие, сонымен бірге ол бидай тамыры өскіндерінің плазматикалық мембранасының Н⁺АТФ-азасының белсенділігін арттырады. Маңызды фитогормондардың бірі – цитокининнің сигналдық трансдукциясы әлі толығымен анықталмаған. Осының барысында цитокининнің екіншілік гормоны туралы сұрақ туындайды. Осыған қатысты бидайдың өнген тұқымынан цитокинин медиаторы табылды. Бұл медиатор бидай тұқымының өніп жатқан ұрығында цитокинин әсерінен кейін пайда болады [16,22,28]. Цитокинин медиаторының ерекше қасиеті – бидайдың құрғақ тұқымының алейрон қабатындағы НАДФ-ГДГ-ны белсендіру. НАДФ-ГДГ-ны барлық гормональды заттардың ішінде тек фузикокцин белсендіретіні көрсетілген. Сонымен бірге тазартылған цитокинин медиаторы деп белгіленген фузикокцин жүгері өскіні тамырының сыртқы мембрана рецепторларымен байланысуын тежейді. Фузикокцин мен цитокинин медиаторы арасындағы жақын қатынасты дәлелдейтін қосымша мәліметтер алуға тура келеді. Бұл жоспарда фузикокциннің өсімдік клеткасының плазматикалық мембранасының Н⁺АТФ–азасын белсендіретін қасиеті бар екені белгілі болды. Осы себепті бидай өскіндері тамырының плазматикалық мембранасының Н⁺АТФ-азасына цитокинин медиаторының әсерін зерттеу мүмкіндігі туындайды. Цитокинин медиаторының фузикокцинге қатынасы туралы сұрақ күрделі, әрі маңызды болып табылады. Осыған байланысты фузикокциннің өсімдік клеткасының плазматикалық мембранасының Н⁺АТФ-азасының белсенділігіне әсерін зерттеу қажеттілігін білдіреді. Ал ол зерттеулер цитокинин медиаторы мен фузикокцин арасындағы жақын туыстықты дәлелдеуі мүмкін [24,29].

Цитокининдердің рецепторлары жақында ғана ашылды. Алынған нәтижелер цитокинин рецепторларының молекулалық массасы 120–130 кД (құрамында 1036–1176 амин қышқылдарының қалдықтары бар) трансмембрандық белоктардан тұратындығын көрсетті. Түрлі обьектілерде бұл белоктар клеткада плазматикалық мембрана құрамында болатындығын анық зерттелінді. Негізгі фитогормондардың нысанасы ретінде өсімдіктер клеткалары қолданылады. Өсімдіктердің өсуі мен даму процестеріне әртүрлі гормондар әсер етеді. Өсімдіктерде де жануарлар секілді гормон рецепторларының екі типі бар екені белгілі болды. Рецепторлардың бірінші типіне цитоплазмалық және ядролық локализацияның ерігіш белоктары жатады, олар гормондармен байланысқа түсіп, гормон рецепторлық комплекс түзеді. Екінші типтің рецепторлары мембранада жинақталған, сонымен бірге, гормонмен мембрананың сыртқы бетінде орналасқан рецептор домені әсерлеседі. Гормон рецепторлық әсерлесудің нәтижесінде, белок рецепторындағы конформациялық өзгерістерді, екіншілік сарапшылардың түзілуін шақыратын, G – белок арқылы ферменттердің біреуіне (мысалы, фосфолипазалар, аденилатциклазалар) берілетін спецификалық сигналды индукциялайды. Нәтижесінде клеткада амплификацияға және әртүрлі клеткалық құрылымдарға берілуіне әкелетін екіншілік сигналды молекулалар пайда болды. Екіншілік сарапшыларға сАМФ молекулалары, инозитол үш фосфат, және басқа да мембрана липидтері жатады. Олардың кейбіреулері клетка метаболизмін өзгертумен қатар ондағы ферменттерді, құрылымдық белоктарды модификациялайтын протеинкиназаларды немесе протеинфосфотазаларды белсендіреді [15,30].

 

 

1.4. Цитокининді байланыстырушы белоктар және цитокинин

медиаторы

 

Цитокинин байланыстырушы белоктарды бөліп алу жұмыстары 1970 жылдары басталды. Ұзақ уақыттар бойы бидайдың ұрығынан, арпа және темекі жапырақтарынан цитокинин байланыстырушы белоктары зерттелінді. Нәтижесінде мембраналық және ерігіш белоктармен, хроматинмен, рибосомамен, белоктық денешіктермен және тағы басқа байланысқан цитокинин байланыстырушы белоктар табылды. Гормонның белокпен байланысуы тез және қайтымды болады. Цитокининдердің туыстастары белоктардың физиологиялық белсенділіктерін жақсы коррелияциялайды.

Протеинкиназалардың активтенуі физиологиялық активті цитокининдер үшін жоғары спецификалық болып табылады. Олар протеинкиназаларды активтендіреді, сонымен бірге цитокинин байланыстырушы белоктардың активациясы үшін қажетті РНК- полимеразаның активтілігінің өзгеруіне әсері жоқ. РНК – полимеразаның фосфорилануы транскрипцияның реттелуін шақыратын цитокинин – рецепторлық комплексіменен реттеледі.

Шепеляковская және басқа авторлардың жұмыстарында жүгерінің түссізденген өскіндерінен молекулалық массасы 70 кД (ЦББ-70) болатын басқа цитокинин байланыстырушы белоктар алып зерттелінді. Жақын арада 2001 жылы цитокинин рецепторының жаңа белогы белгілі болды. Бұл рецептордың сыртқы бөлігі (клетка сыртындағы бөлігі) цитокининмен әрекеттесетін, ал ішкі осы әсерлесуге CRE 1 белогындағы гистидиннің белгілі қалдығын фосфорилдеу арқылы жауап беретін молекулалық массасы 120 кД жуық болатын интегралды трансмембраналық белоктарды көрсетеді. Бұндай құрылымдары ұқсас гистидинкиназалардың үш түрі анықталды. Сигнальды трансдукция жайлы пікірлерге сүйенетін болсақ цитокининнің өсімдік тұқымына әсері кезінде азот ассимляциясына қатысатын ферменттің мысалы спецификалық НАДФ- глутаматдегидрогеназа тәрізді ферменттердің өсу процесіне  және метоболизм белсенділігіне әкелетін, ұрықтан шыққаннан кейін алейрон қабатына әсер ететін екіншілік гормон медиаторының синтезі басталады [28,31]. Қазіргі уақытта осы өсімдік тұқымында синтезделетін екіншілік гормон, саңырауқұлақтардан бөлініп алынған фузикокцинге ұқсас болып келеді. Себебі фузикокцин цитокининнің екіншілік гормоны тәрізді метаболизм және өсу ферменттерінің активациясын шақырады. Кейінірек олардың бірі рецептор үшін бәкелестік қатынас болатындығы және бірдей реакция шақыратындығы туралы пікірлер дәлелденді. Нәтижесінде клетка мембраналарында екіншілік медиаторларды байланыстыратын фузикокцин-байланыстырушы рецепторлар табылды. Цитокининдер тұқымға әсер еткен соң, оларда фузикокцинмен сәйкес келетін екіншілік гормонның пайда болуы жүреді. Кейінірек бұл медиатордың клетка ішілік кальций деңгейінің жоғарылауын тудыратындығы дәлелденді, нәтижесінде, түскен сигналдың әсерінен фосфорлануға жауап беретін С протеинкиназаның белсенділігі артады [32].

 

 

 

         

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

         

2. МАТЕРИАЛДАР МЕН ӘДІСТЕР

2.1. Зерттеу объектілері мен әдістері

 

Ауылшаруашылығы өсімдіктерінің ішінде Қазақстанда маңызды дақыл болып бидай саналады. Сондықтан зерттеудің негізгі обьектісі болып жұмсақ бидайдың «Қазақстан – 10» (Triticum aestivum) және «Арай» сорты  алынды.

Цитокинин медиаторын тазарту:

Цитокинин медиаторын тазарту үшін Triticum aestivum бидайының құрғақ дәндерінің 2кг алынды. Дән 0,1мМ 6-БАП-ты тазартылған су құбыры суында 24 сағат өсірілді. Осыдан кейін дәнді салқындатылған 80% этанолда гомогендейді. Гомогенезатты өзі салқындататын К-24 центрифугасында 10 минут 10 000 айналымда центрифугаладық.

Плазматикалық мембрананы бөліп алу үшін дәнді Петри табақшаларында 25⁰С температурада сүзгі қағазда өсіреміз. Табақшаларға цитокинин медиаторының ерітіндісін қостық, оны 0,01М Трис-НСI буферінде 1000 есе араластырдық. Дәндер 72 сағат аралықта өсті. Кесіп алынған тамырларды сүзгі қағазбен кептірдік те, оларды қатынасы Трис- НСI-ң 5 мл буферіне 1г тамыр болатындай Трис-НСI буфері бар фарфор шыны ыдысқа салып, еземіз. Алынған гомогенатты 10 минут 1000 айналымда центрифугалаймыз. Сосын тұнба үстіндегі сұйықтықты 10000 айналымда 10 минут көлемінде қайта центрифугалаймыз. Тұнба 1 мл Трис-НСI 0,01М буферінде (рН 7,5) жағдайда болды.

Н⁺АТФ-азаны анықтау үшін бақылау және зерттелетін пробиркалар алынды. Барлық пробиркаға 1,7мл 0,01М Трис-НСI, 0,005М АТФ, 0,003М МgCI₂ және плазматикалық мембранадан алынған суспензияның 0,2 мл құйылды. Бақылау пробиркаларына бірден 1мл сірке қышқылы үш хлоридінің 20% ерітіндісі қосылды. Зерттелетін пробиркалады 25⁰С температурада 30 минут культивирледі. Реакция сірке қышқылы үш хлоридінің 20% ерітіндісінен 8мл қосқанда тоқтады. Түзілген бейорганикалық фосфатты анықтадық. Ол үшін 2мл темірдің молибдаты қосылды. Қоспаны 15 минут көлемінде сол температурада культивурледі. Содан кейін Ultra spec 1100 pro спектрофотометрімен толқын ұзындығы 660 нм-де қоспаның сіңірілуімен өлшенеді.

 

 

    

 

   

 

 

 

 

 

 

 

3. АЛЫНҒАН НӘТИЖЕЛЕР ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛДАУ

 

       Сұлтанбаев және оның авторластары цитокинин құрамын зерттемеді, сол себепті оны зерттеудің қажеттілігі туындады. Цитокинин медиаторын зерттеу үшін тазартудың тиімді әдісін қарастыру қажет болды. Біздің цитокинин медиаторын тазарту әдістері Сұлтанбаевтың әдістерінің негізінде жасалынды. Біздің жасаған әдісіміздің басты ерекшелігі сол алғаш рет цитокинин медиаторын жоғары дәрежеде тазартатын RP-18 кері фазалы хромотографиясы типті бағаналы колонкасы еді, мұнымен біз басқа фитогормондармен ластанбаған цитокинин медиаторының препараттарын алуға қол жеткіздік.

       Цитокинин медиаторын тазартудың біз жасаған жүйесі төмендегідей сатылардан өтеді: гомогенизация, центрифугалау, октил сефароза CL – 4В хроматографиясы, кері фазалы RP – 18 типті хроматография. Нәтижелерін 2-3-суреттерден көруге болады. Октилсефароза CL-4B колонкасында бидайдың «Арай» сорты дәнінің өскінінен алынған спиртті экстрактысының гидрофобты хроматографиясы. Колонка көлемі 3,5х20см. Колонканы 10% этанолмен теңестіреміз. Байланыспаған заттарды 10% этанолмен жуып өткіземіз. ЦМ элюциясы 50% этанолда шығады, содан соң колонканы адсорбцияланған заттардан тазарту үшін 80% этанолмен жуамыз

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 2-сурет. Октилсефароза CL-4B колонкасында бидайдың «Арай» сорты дәнінің өскінінен алынған спиртті экстрактысының гидрофобты хроматографиясы

 

RP-18 типті кері фазалы хроматографиясында цитокинин медиаторы тазарту. Колонканы 10% этанолмен теңестіреміз, содан соң этанолдың градиенттік элюциясын (10% тен 100% ке дейін) өткіземіз. Цитокинин медиаторының фракциясы  сызықпен көрсетілген.

 

 

 

3-сурет. RP-18 типті кері фазалы хроматографиясында цитокинин медиаторын тазарту

 

       Султанбаев басқа авторлармен бірге плазматикалық мембрананың фузикокцинді рецепторы үшін эмбриональды фактор нысанамен бірігіп фузикокцинмен бәсекелеске түсетіндігін көрсете білді. Алайда авторлар фактормен немесе фузикокцинмен байланысқаннан кейін берілген рецептор клеткада қандай қызмет атқаратындығын көрсетпейді. Авторлардың жоғары аталған зерттеулерінде НАДФ-ГДГ активациясына цитозольды кальцийдің деңгейінің жасанды жоғарылауы  немесе төмендеу әсері де зерттелді [33,34]. Бұл тәжірибелерді олар кальций ионофоры – А₂₃₁₈₇ антибиотигін қолдану арқылы жүргізді. Бұл ионофор мембрана клеткаларында цитозольды Са²⁺ деңгейін жасанды реттеп отыруға болатын спецификалық каналдар түзеді. Тәжірибе үшін авторлар ионоформен өңделген бидай дәнінің ұрықсыз жартысын алып, 10мМ СаСL₂ бар ерітіндіге орналастырды. Бұл кезде  кальций каналдары арқылы клетка ішіне еркін өтіп отырды. Осылайша, цитозоль Са²⁺ деңгейі артып отырды. Басқа жағдайда ионофор өңделген ұрықсыз жартыларды кальций байланыстырушы хелаттан – (мМ этилен гликольтетраацетаттан тұратын ерітіндіге орналастырады, бұл жағдайда цитозольды Са²⁺ клеткадан ағып шығады да нәтижесінде цитозольды кальций деңгейі жасанды төмендеп кетті. НАДФ-ГДГ активациясын эмбриональды фактормен толық басып тастауға болады, егер де бұл жағдайда ЭГТА көмегімен цитозольді кальций деңгейін  жасанды түрде төмендетуге болады. Егерде  жасанды түрде цитозольды Са²⁺ деңгейін арттырса, онда авторлар фактордың әсерінсіз-ақ НАДФ-ГДГ активациясын байқады [35]. Осылайша, бұл нәтижелер НАДФ-ГДГ активациясы үшін цитозольды кальций деңгейі ғана анықтаушы болып табылатындығын көрсетті. Алайда Султанбаев авторлармен бірге клеткадағы цитозольды Са²⁺ деңгейінің артуын қамтамасыз ететін механизмді зерттемеді. Сол себепті біз келесіге мән бердік. Мембраналық аппаратта (клетканың) плазматикалық мембрана өзінің орналасуына қарай  ерекше орын алады. Ол клетканың конфигурациясын анықтайтын және оны қоршаған ортадан алшақтататын физикалық шекара болып саналады. Плазматикалық мембрана арқылы заттардың клеткаға тасымалы іске асады және клетканы қоршаған клеткалармен және сыртқы ортамен байланысы да жүзеге асады. Плазматикалық мембрана, сондай-ақ, сигналдық функция қызметін атқарады. Ол химиялық сигналдарды қабылдайды, таниды және қайта өңдейді, ол арқылы метаболизм, клетканың биохимиялық және физиологиялық жауапты, клетканың бөлінуінің басталуын, өсуді және дифференцировканы реттейді.

       Плазматикалық мембрананың тағы бір маңызды функцияларының бірі – ионоспецификалық транспорттық АТФ-аза көмегімен оның иондық транспортты жүзеге асыруы. Ионтранспорттық АТФ-азаның қатарынан  плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ–азасы маңызды роль атқарады. Н⁺АТФ–аза энергия қолданады, ал АТФ гидролизі нәтижесінде босайды. Бұл клеткалық мембрана арқылы протондарды клеткадан сыртқы ортаға тасымалдау үшін қажет. Клеткадан сыртқа протондарды шығара отырып, Н⁺АТФ–аза потенциалдың трансмембраналық әртүрлілігін құруға қатысады. Электрохимиялық потенциалдың пайда болуы арқасында клетканың сыртындағы катиондар клетканың ішіне келесідегідей жолмен тасымалданады. Протонды АТФ-аза жұмысы кезінде цитоплазма тотығады және сыртындағы оң зарядталған катиондар клетканың ішіне тасымалданады. Осылайша неғұрлым Н⁺АТФ–аза активті болса, соғұрлым клетканың ішіне катиондар көп тасымалданады. Тасымалданатын катионның спецификалылығы Н⁺АТФ–азаның көмегімен түзілетін катионды каналдың спецификалылығымен негізделеді, сол себепті Na⁺, K⁺ ионына Н⁺АТФ–аза спецификалық, Са²⁺— спецификалық Н⁺AТФ-азалар болады. Жоғарыда аталғандардан шыға отырып, клетка ішіне кальций иондарының транспорты плазматикалық мембрананың Са²⁺— спецификалық Н⁺АТФ-азасының көмегімен жүзеге асады деп болжау дұрыс болып отыр. Сондықтан біздің зерттеуіміздің маңызды мәселерінің бірі плазматикалық мембрананың протонды кальцийлі АТФ азасының активациясына тазартылған цитокинин медиаторының әсерін зерттеу болып отыр. Сол себепті АТФ азаның осы типін зерттеуге арналған таңдау кездейсоқ емес.

Біз бидайдың «Арай» сортының үш күндік өскіндерінің тамыршаларынан бөлініп алынған плазматикалық мембрананың АТФ-азаның цитокинин медиаторының әсерінен активациясын зерттедік. Бақылау өскіндері суда өсірілсе, тәжірибе өскіндері 23 мкг/мл 6-БАП бар суда, сондай-ақ 100 нг/мл концентрациясында цитокинин медиаторынан тұратын суда өсірілді. 3 -тәулікте өскіндердің тамыршаларынан плазматикалық мембрананың фракциясын алды. Бөлініп алынған плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ- азасының активтілігі зерттелді. Алынған нәтижелер 1-кестеде көрсетілген.

 

                                                                                                                         1-кесте

 

     Бидайдың «Арай» сортының үш күндік өскіндерінің тамыршаларынан алынған плазматикалық мембрананың Н⁺-АТФ азасының активтілігіне 6-БАП пен цитокинин медиаторының әсері

 

Варианттар	Н+АТФ-азаның активтілігі мкМ/мг  белок сағ.	% бақылауға
Бақылау	207±12	100
6-БАП 23мкг/мл	235±9	113
Цитокинин медиаторы, 100 нг/мл	590±15	285

 

 

     Кестеден цитокинин медиаторының әсерінен 23 мкг/мл 6-БАП та өсірілген өскіндерге және бақылау вариантымен салыстырғанда бидай өскіндерінің тамыршаларынан алынған плазматикалық мембрананың Н⁺-АТФ азасының 2 еселік активациясы жүргендігі көрініп тұр. Плазматикалық мембрананың Н⁺-АТФ азасын цитокинин – 6 БАП активтемегендігін ескеру қажет.

Біз енді бидай мен жүгерінің ұрығының тұқымсыз жартыларынан алынған плазматикалық мембрананың Н⁺-АТФ азасының активтілігіне цитокинин медиаторының әсерін зерттеу алдымызда тұр.

     Зерттеу үшін бізде Сұлтанбаев пен оның қызметтестері ұсынған тәжірибелік модель алынды. Зерттеу үшін тұқымсыз жартыларды алу қолайсыз болғандықтан, жаңа тәжірибелік модель есебінде осы тұқымсыз жартылардың кебектері ұсынылды. Олар тұқымсыз жартыларға қарағанда балласты крахмалды эндоспермдері жоқ және жақсы малынады.

     Тәжірибелік үшін бидайдың «Арай» жұмсақ бидай сортының ұрықсыз жартыларынан және сортсыз жүгеріден алынған кебектер қолданылды. Алынған кебектерді 12 сағат бойы 100 нг/мл концентрациясында  жоғары тазартылған цитокинин медиаторы бар дистелденген суда малиды. Бақылау вариантына цитокинин медиаторы қосылмады. Келесі тәуліктерде әдістер бойынша кебектерден плазматикалық мембрананың фракциясын алды.

     Плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ-азасының активтілігін анықтаудың нәтижелері 2 және 3- кестелерде көрсетілген.

                                                                                                                        2-кесте

 

     Бидайдың «Арай» сортының дәнінің ұрықсыз жартыларының кебектерінен бөліп алынған плазматикалық мембрананың Н⁺-АТФ азасының активтілігіне 6-БАП пен МЦ-тің әсері

 

Варианттар	Н+АТФ-азасының активтілігі, мкМ Рi/мг белок* сағат	%  бақылауға
Бақылау	308±11	100
6-БАП, 23 мкг/ мл	297±9	96
Цитокинин медиаторы 100 нг/ мл	685±11	223

 

 

                                                                                                                        3-кесте

 

     Сортсыз жүгерінің ұрықсыз жартыларының кебектерінен бөлініп алынған плазматикалық мембрананың Н⁺-АТФ азасының активтілігіне 6-БАП пен цитокинин медиаторының әсері

 

Варианттар	Н+АТФ-азасының активтілігі, мкМ Рi/мг белок* сағат	%  бақылауға
Бақылау	317±9	100
6-БАП, 23 мкг/ мл	351±12	111
Цитокинин медиаторы 100 нг/ мл	492±8	155

 

 

     2-кестеде көрсетілгендей, цитокинин медиаторының әсерінен бидай дәніңің ұрықсыз жартыларынан алынған плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ азасының екі еселік активациясы жүрген. Ал 3 – кестеде жүгерінің ұрықсыз жартыларынан бөлініп алынған плазматикалық мембрананың протонды АТФ-азасы әлсіз активтелді, бұл обьектінің түрлік спецификасымен түсіндіріледі.

     Бұрын фузикокциннің өсімдік және жануарлардың да ұлпаларының плазматикалық мембраналарының Н⁺АТФ азасын активтеуге қабілеті бар екендігі анықталған болатын. Сол себепті жануар ұлпасының клеткаларынан бөлініп алынған плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ-азасының активтілігіне жоғары тазартылған цитокинин медиаторының әсерін зерттеу қызық тудырып отыр. Тәжірибе үшін жыныстық жағынан жетілген сызықты емес ақ егеуқұйрықтардың жүрегі мен миынан алынған плазматикалық мембраналар бұрынғы көрсетілген әдістер бойынша  бөлініп алынды. Нәтижелер 4-кестеде берілген.

                                                                                                                        4-кесте

 

     Жыныстық жағынан жетілген сызықты емес ақ егеуқұйрықтардың жүрегі мен миынан бөлініп алынған плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ-азасының активтілігіне 6-БАП пен цитокинин медиаторының әсері

 

Мүше	Варианттар	Н+АТФ-азасының активтілігі, мкМ Рi/мг белок* сағат	%  бақылауға
Жүрек	Бақылау	352 ± 9	100
	6-БАП 23мкг/мл	336 ± 13	95
	ЦМ 100 нг/мл	469 ± 7	133
Ми	Бақылау	504 ± 9	100
	6-БАП 23мкг/мл	529 ± 8	105
	ЦМ 100 нг/мл	2470± 15	491

 

 

     Жүрек пен мидан бөлініп алынған плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ-азасы жоғары тазартылған цитокинин медиаторы препаратына әртүрлі жауап бергендігі таң қалдырды.

     Бұл маңызды нәтижелер төмендегіні айтады. Цитокинин медиаторы фузикокцин сияқты плазматикалық Н⁺АТФ-азаны активтендіреді, ал бұл олардың функциональды активтілігінің жақын екендігін көрсетеді. Біздің плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ-аза  препаратын шындығында зерттегеніміз, ал фузикокцинмен активтелмейтін митохондрия мембраналарының АТФ-азасын зерттеген жоқпыз деген нақты дәлелдер бар.

     Плазматикалық мембрананың протонды АТФ-азасының активациясы кезінде қандай катиондар типі тасымалданады деген маңызды сұрақ болып отыр. Бидай кебектерінен алынған плазматикалық мембрананың цитокинин медиаторымен активтелетін Н⁺АТФ- аза Са²⁺ ионы активтілігі мен Mg²⁺ ионымен салыстырғанда 70% көрсетті. Мұнда Mg²⁺ тек фосфатазалық реакцияны жүзеге асыру үшін қажет болатындығын ескерсек, онда біз бидай дәнінен алынған плазматикалық мембрананың зерттеліп отырған Н⁺АТФ-аза қатаң кальцийге тәуелді фермент болып саналады. Әсіресе осы фермент кальций ионының клетка ішіне тасымалын жүргізеді. Біз, сондай–ақ медиатормен активтелген Н⁺АТФ-аза Na⁺ және  K⁺ иондарымен ешқандай активтілік көрсеткен жоқтығын, яғни бұл фермент клетка ішіне Na⁺ және  K⁺ клетка тасымалын жүзеге асырмайтындығын да зерттеп көрсеттік.

          Екінші реттік цитокинин гормоны бидай дәніндегі ұрықтық емес бөлігінің плазматикалық мембранасындағы Н⁺АТФ-азасын активтендірмейтіндігі белгілі болды. Осыған байланысты осы екінші реттік цитокинин гормонының бидай дәнінің алейрон қабатындағы плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ-азасына әсерін зерттеу қажет болды. Зерттеу нәтижесінде екінші реттік цитокининнің  толық бидай дәніндегі плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ-азасының активтілігін жоғарылататындығы анықталды. Осы тәжірибенің қорытындысы бойынша екінші реттік цитокинин гормонының бидай дәндерінің ұрығында белгісіз бір фактордың пайда болуын қамтамасыз ететіндігі белгілі болды. Фузикокцин тек 14-3-3 протеиндерімен ғана жұмыс істейді, сол себепті екінші реттік цитокинин гормоны бидай эмбрионында 14-3-3 протеиндерінің түзілуіне ықпал етеді. Содан кейін түзілген 14-3-3 протеиндері бидай дәнінің алейрон қабатына қарай өтеді.

Осы гипотезаны тексеру мақсатында бидайдың ұрықтық және ұрықтық емес екі бөлігін алып, ұрықтық бөлігін 0,23 ug/ml екінші реттік цитокинин гормонының ертіндісінде бұқтырып қойдық. Бидай дәндерінің ұрықтық бөліктері 2 сағат бойы екінші реттік цитокинин гормонында гомогендендірілді, тәжірибе үшін оның клеткалық емес экстракты қолданылды. Сонымен қатар, мида да 14-3-3 протеиндерінің көп мөлшері болатындықтан, эксперимент үшін қосымша қой миының клеткалық емес экстракты алып қолданылды.

Тәжірибеде бидай дәндерінің ұрықтық емес бөлігін 3 сағат екінші реттік цитокинин гормонынымен бидай ұрығының клеткалық емес экстрактында және екінші реттік цитокинин гормонынымен қой миының клеткалық емес экстрактында 3 сағатқа бөктірілді. Екі экстрактта да бидайдың ұрықтық емес бөлігінің плазматикалық мембранасындағы АТФ-азаның активтілігі жоғары болды. Алейрон қабатындағы плазматикалық мембрананың Н⁺АТФ-азасын активтендіру қасиеттерін зерттеу Са²⁺-тәуелді Н⁺АТФ-аза ферментімен байланыстылығын көрсетеді. Осы Са²⁺-тәуелді Н⁺-АТФ-аза жоғарғы сатылы өсімдіктердегі цитозольді Са²⁺-дің мөлшерін көбейтуге қатысады.

Тәжірибе нәтижесінде ол екінші реттік цитокинин гормонымен бидай ұрығының клеткалық емес экстрактында және екінші реттік цитокинин гормонымен қойдың миының клеткасыз экстрактында да алейрон қабатындағы плазматикалық мембрананың АТФ-ын тек Са²⁺ иондары ғана активтендіреді, ал Mg²⁺ иондары активтендірмейтіндігі анықталды. Осылайша, цитокинин медиаторы кальций тасымалын клетка ішіне кальцийлі канал арқылы активациясын жүзеге асырады,  Н⁺АТФ- азаның активтілігімен түзілетін электрохимиялық потенциал арқасында жүзеге асады.

          Біз тұңғыш рет цитокинин медиаторы әртүрлі обьектілерден бөлініп алынған плазматикалық мембрананың протонды АТФ азасының активтілігін іске асыратындығын белгіледік бидай өскіндерінің тамырларынан, жүгері ұрығынан және бидай ұрығынан, егеуқұйрықтардың жүрегі мен миынан алынаған нәтижелер медиатордың фузикокцинмен үлкен функциональды ұқсастығын тағы да көрсетті және де зерттеліп отырған медиатордың жалпы биологиялық әмбебаптығын да көрсетті. Плазматикалық мембрананың зерттелініп отырған протонды АТФ азасы кальций тәуелді фермент болып шықты, яғни ол клетка ішіне Na және  K иондарын емес, кальций ионының тасымалын жүзеге асырады. Бұл өте маңызды, өйткені цитозольды кальций ионының пайда болуы НАДФ-ГДГ активациясы үшін маңызды клетка ішілік сигнал болып есептеледі. Осылайша, біз тұңғыш рет әсіресе цитокинин медиаторы мембранды протонды АТФ-аза арқылы цитозольды кальций деңгейін жоғарылататын реттегіш болып табылатындығын бекіттік.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ҚОРЫТЫНДЫ

 

Алынған нәтижелерден мынандай қорытынды жасауға болады:

1.Цитокинин дәннің ұрығына  әсер етіп, фузикокцинге табиғаты жағынан  ұқсас екіншілік гормонның түзілуіне алып келеді.

2.Бидай дәнінің ұрықты бөлігінен октил-сефероза СL-4В гидрофобты хроматография әдісі  арқылы цитокинин медиаторы бөлініп алынды.

3.Бөлініп, тазартып алынған цитокинин медиаторының физиологиялық, биохимиялық және биотехнологиялық қасиеттері зерттелініп, мембранамен байланысқан ферменттердің активтілігіне медиатордың әсерін, әрі биохимиялық қасиеттерін байқауға болады.

4.Плазматикалық мембрананың зерттелініп отырған протонды АТФ азасы кальций тәуелді фермент екені зерттелініп, клетка ішіне кальций ионының тасымалын жүзеге асыратыны анықталды. Цитозольды кальций ионының пайда болуы НАДФ-ГДГ активациясы үшін маңызды клетка ішілік сигнал болып есептеледі. Қорытындылай келе,біз тұңғыш рет цитокинин медиаторы мембранды протонды АТФ-аза арқылы цитозольды кальций деңгейін жоғарылататын реттегіш болып табылатындығын дәлелдедік.

 

                                               

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                        

 

 

Түйін

         

     Өскен бидайдың дәнінен гидрофобты хроматография және кері фазалы хроматография әдістері арқылы цитокинин медиаторы жоғары деңгейде тазартылып алынды. Өскін бидай тамырларынан алынған плазмалық мембраналық Н⁺АТФ-азаға тазартылған медиатордың әсері зерттелінді. Сол әсерден Н⁺АТФ-азаның активтілігі 2 еседен көп артты.

 

Резюме

 

          Был выделен высокоочищенный медиатор цитокинина методами гидрофобной хроматографии и обратнофазовой хроматографии из проросших зерен пшеницы. Было изучено действие медиатора цитокинина на Н+АТФ — азу плазматической мембраны из корней проростков пшеницы. Под действием медиатора активность Н⁺АТФ-азы возросла более чем в 2 раза.

 

Summary

 

It has been isolated high purified mediator cytokinine by methods of a hydrophobic chromatography and reverse phase chromatographies from germinated wheat seeds. It has been investigated effect of mediator of cytokinine on plasmatic membrane H⁺ATP-ase from roots of wheat sprouts. Under action of mediator activity Н+АТФ-ase increased more than in 2 times

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ҚОЛДАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ

 

1. Полевой В. В. Фитогормоны. Л.: изд-во ЛГУ, 1982. 248 с.
2. Кулаева О. Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у  

растений: 41-е Тимирязевское чтение.  М. : Наука,  1984.  84 с.

3. Волотовский И.Д. Фитохром – регуляторный фоторецептор растений.
4. Дефлинг К. Гормоны растений. Москва. Мир. 1985. 298 с.
5. Медведев С.С. Физиологические основы полярности растений. Санк –

Петербург. Кольна. 1996. 159 с.

6. Полевой В.В.,Саламатова Т.С. Физиология роста и развития растений.

Ленинград. ЛГУ. 1991. 240с.

7. Қалекенұлы Ж. Өсімдіктер физиологиясы . Алматы 1997. б. 225.
8. Сағатов . К. Өсімдіктер физиологиясы.  А. 1998. б. 234-235.

9.Опритов В.А., Пятыгин С.С., Воденеев В.А. //   Физиология растений.2002 10. Pyatigin S.S.,Opritov V.A.,Khudakov V.A.// Planta, 1992/ V.286.P.161

11. Пахомова В.М., Гордон Л.Х. // Журнал общ.биологии. 1991.Т.52.С. 36

12.В.В Полевой.Физиология растений. Москва.1989

13.Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. Москва. Наука. 1973.   

268 с.

14.Муромцев Г. С. // Физиология растений.1996.Т.43.С.478.

15.Г.А. Романов Гормон связывающие белки растений и проблема рецепции 

фитогормонов// физиология растений 1989 Т.36 с.166-167

16.Haberer G., Kieber J.J.  Update on Cytokinins. // Cytokinins. New Insights into a Classic Phytohormone — 2002. — 56 – P.1-10.

17.Trofimova M.S., Klychnikov O.I., Nosov A.V., Babakov A.V. Activation of the    

additional centers of linkage of fusicoccins on a plasmatic membrane by osmotic

shock. // Plant physiology — 1999. – 46. – P. 9-15.

18.Baunsgaard L., Fuglsang A., Jahn T., Korthout H., de Boer A.H., Palmgren M.  

The 14-3-3 proteins associate with the plant plasma membrane H+-ATPase to 

generate a fusicoccin binding complex and a fusicoccin responsive system. // 

Plant J. -1998. -13. –P.661-671

19.Треушников В.М.,Пятыгин С.С., Опритов В.А // биологические 

мембраны.1994.Т.11.С.420

20. Булычев А.А // Мембранный транспорт и биоэлектрическая активность

растениий. Горький ГГУ, 1990

21.Babakov A.V., Chelysheva V.V., Klychnikov O.I., Zorinyanz S.E., Trofimova 

M.S., de Boer A.H.  Involvement of 14-3-3 Proteins in Osmotic Regulation of 

H+-ATPase in Plant Plasma Membrane. // Planta -2000. — 211. – P.446 – 448.

22.Morsomme P.,Boutry M. The Plant Plasma membrane H⁺ATP 

ase:Structure,function and Regulation// biochim. Biophys. Acta. 2000

23.Santoni V., Vansuyt G., Rossignal M. The Chaning Sensitivity to Auxin of the

Plasma Membrane H⁺-ATP-ase:Relationship between Plant Development and 

ATP-ase Content of Membranes // Planta .1991.

24.Baunsgaard L., Fuglsang A., Jahn T., Korthout H., de Boer A.H., Palmgren M.

Тhe 14-3-3 proteins associate with the plant plasma membrane H+-ATPase to 

generate a fusicoccin binding complex and a fusicoccin responsive system. // 

Plant J. -1998. -13. –P.661-671

25.Palmgren M.G. Plant Plasma Membrane H⁺ATP ases Powerhouses for Nutrient  

Uptake//Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Mol.Biol.2001

26.И. А. Тарчевский Сигнальные системы клеток растений.  М. : Наука 2002г

27.Roberts D. M. ,  Harmon A. C. , Calcium-modulated protins: targets of 

intracellular calcium signalеs in higher plants // Annu.  Rev.  Plant Physiol.  Plant 

Mol.  Biol.  1992,  v.  43,  p.  375-380.      

28.Poovaiah B. W.,ReddyA. S. N.  Calcium and Signal Transducthon in plant // 

Critical Reviews in Plant  Sci.  1993. v. 12, №3,  p 185-211

29.Ткачук В. А.  Фосфоинозитидный обмен и ассимиляция ионов Са²⁺ // 

биохим. 1998. Т. 63 №1. С 47-56

30.Poovaiah B. W.,  ReddyA. S. N.  Calcium and Signal Transducthon in plant // 

Critical Reviews in Plant  Sci.  1993. v. 12, №3,  p 185-211

31.Helper P. K. , Wayne R. O. Calcium and pland development //Annu Rev.  Plant 

physiol. 1985. v. 36,  p. 397-400

32.Trewavas A. ,  Knight M.  Mechanical signaling,  calcium and plant form // Plant Molec.  Biology.  1994,  v. 26,  p. 1329-1341.

33.Gilmanov M.K., Dilbarkanova R., Darkanbaev T.B. The latent form of  

glutamatedehydrogenase located in spherosomatic structures of a wheat seeds. // 

Reports of SA -1982. — Ed 3, V264. — P.737-739.

34.Гильманов М. К. ,  Францев Ф. П. ,  Дильбарканова Р.  Структурные и 

регуляторные особенности глютаматдегидрогеназы высших растений // 

Тезисы научных сообщений 4-го Всесоюзного биохимического съезда.  М. : 

1979,  т. 1,  с. 252-253.

35.Гильманов М. К.  Трансдукция сигналов цитокинина в зерне пшеницы // 

Биотехнология,  теория и практика.  Алматы,  1997,  №3, с. 94.