Дипломдық жұмыс: Биологиялық зерттеулерде политізбектік реакция әдісін қолдану

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Тақырыбы:

Биологиялық зерттеулерде политізбектік реакция әдісін қолдану

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

МАЗМҰНЫ

 

Кіріспе……………………………………………………………………………………………………….3

І Ғылыми әдебиеттерге шолу

1.1 Политізбектік реакция әдісінің ашылуы………………………………………………..

1.2 ДНҚ-ң құрылысы мен құрамы………………………………………………………………

1.3 ПТР-диагностикасының тәжірибелік қолданылудың перспективалары……

ІІ Зерттеу бөлімі

2.1 Политізбектік реакция әдісінің механизімдері…………………………………………

2.2 Биологиялық материалдың үлгісін дайындау……………………………………….

2.3Полтитізбектік реакция тізбектері…………………………………………………………….

2.4 ПТР-ді тәжірибелік денсаулық сақтауда қолдану…………………………………

ІV Зерттеу нәтижелері

4.1 Медициналық тәжірибеде ПТР әдісің қолданылуының проблемалары…..

4.2 Өсімдіктер ДНҚ-ғы бөтен ДНҚ-ң процентік  көрсеткішін тест-жүйе арқылы анықтау…………………………………………………………………………………………

 

ҚОРЫТЫНДЫ……………………………………………………………………………………….

ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ…………………………………………………………………………….

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Анықтамалар, белгілеулер мен қысқартулар

 

ДНҚ – дезоксирибонуклеин қышқылы 

РНҚ – рибонуклеин қышқылы

ПТР – политізбекті реакция

дНТФ – дезоксинуклеозидифосфат

дНМФ – дезоксинуклеозидмонофосфат

дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат

дГТФ – дезоксигуанозинтрифосфат

дЦТФ – дезоксицитидиктрифосфат

дТТФ – дезокситимидинтрифосфат

Thermus aquaticus —  грамтеріс таяқша тәрізді экстремальды термотұрақты бактерия.

ИФА – иммуноферменттік анализ

ГМО – генетикалық модификацияланған организім

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Кіріспе

 

Соңғы он жылдықта молекулалық биологияның, медициналық генетиканың, биохимияның, биофизиканың,  микробиологияның, иммунологияның, онкологияның,  эпидемиологяның және т.б. ғылымдардың қарқынды дамуы адам, жануар, өсімдік, бактерия және вирус геномын зерттеуде  диагностикалық практиканың молекулярлы-биологиялық әдістің белсенді нығайуына әкелді. Бұл әдіс ДНҚ-зерттеу деп аталады. [1]

ДНҚ-зерттеу әдісі әр түрлі ауруларды ерте және толық анықтауға мүмкіндік береді. Терапияда нәтижелі бақылау жасауға және  қазіргі диференциалды диагностика жасауға мүмкіндік береді. Тұқым қуалайтын ауруларды анықтауда таптырмайтын әдіс әсіресе қан іздерінен, шәуеттен және саусақ мөрінен қылмысты адамдарды анықтауға мүмкіндік береді.   

Қазіргі танда ДНҚ-диагностиканың екі бағыты бар олар: гибридизационды нуклеин қышқылдарының анализі және политізбектік реакция әдісін қолдану арқлы диагностика.  Молекулалық биология әдісінің дамуы ХХ ғасырдың 50-і жылдары басталды. Ресімей бастама 1953 жылы ДНҚ-ң құрылысының ашылуымен байланысты болды. ДНҚ-гибридизация  әдісі инфекциялы қоздырғыштарды анықтауда қиындау, ұзақ және қымбатқа түсті. Оның орнына политізбектік реакция әдісі келді (ПЦР).

Политізбекті реакция –ДНҚ-ң репликациясының  жүруін айқын көрсететін ең негізгі әдістердің бірі болып табылады. ПЦР әдісінің ашылуымен  спецификалық молекула ДНҚ-ң  миллиондаған молекула арасындағы маңыздылығы анықталды. [2]

Политізбекті реакция әдісінің ашылуы молекулалық биология саласындағы соңғы онжылдықтағы негізгі жаңалық болып табылады. Ашылған жаңалық медицина саласындағы диагностиканы  жаңа, жоғары сатыға көтерді. Политізбекті реакция әдісінің маңыздылығы – ДНҚ-ң  участогын лабораториялық жағдайда  температуралық цикл барысында пробиркада амплификациялау (бірнеше қайтара көшірмесін түсіру).  ДНҚ-ң  әрбір көшірмесін жасау барысында алдыңғы процесте синтезделген ақпарат  қайта синтезделіп, ДНҚ полимеразамен қайта көшіріледі. Осы процесс барысында ДНҚ-дағы ақпарат түрленіп, күрделене  түседі де синтез процесінің жүруі  жеңілдей  түседі.

Политізбекті реакция анализинің ашылуы соңғы жылдары медицина мен ғылым саласында көптеген жетістіктерге жетті.  Алғашқы кезде ПТР әдісі  институт қабырғасындағы  лабораторияда қолданылып, қазіргі таңда көптеген мемлекеттерде   практика жүзінде клиникалық ауруларды емдеуде кеңінен қолданылуда. Инфекциялық ауруларды диагностикалау (соның ішінде агенттен  туа біткен); микроорганизмдерді  генотиптеу, олардың  вируленттігін анықтау; микрофлораның антибиотиктерге қарсы тұру қабілеттілігі; генодиагностика және генетикалық дактилоскопия; қанның препараттарына  биологиялық бақылау жасауда – ПЦР анализі қолданылып келеді. 

Қазіргі таңда Политізбекті реакцияны қажет етпейтін модификация саласы  да бар. Соған қарамастан Политізбекті реакция анализі қарқындап  дамып, нарықта өзінің соңғы үлгідегі тест,  жасанды технологияларын ұсынып келеді. ТМД елдерінде жаңа әдіспен лабораториялық бақылаулар мен зерттеулер жүргізетін  лабораториялар саны да артып келеді.

Дипломдық жұмыстың көкейкестілігі:

Дипломдық жұмыстың мақсаты: Биологиялық зерттеулерде политізбектік реакция әдісін қолдануды меңгеру.

Дипломдық жұмыстың міндеттері:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

І Ғылыми әдебиеттерге шолу

• Политізбектік реакция әдісінің ашылуы

 

Алғаш рет американдық биохимик Кэри Мюлис  политізбекті реакция әдісін ашқан болатын. Оның негізгі мақсаты ДНҚ бөліктермен басқа ғалымдар жұмыс жасауы үшін қысқа ДНҚ үзіктерін бөліп алу керек болды. Молекулалық биология бағытында алға үлкен қадам жасады және 1993 жылы химия саласынан Нобел силығын алды.

ПТР-дің ашылуы туралы алғаш рет Cetus корпарациясының Кэри Мюлис 1985 жылы Science жураналына алғаш рет жариаланған.   

1989 жылы термотұрақты ДНҚ-полимераза Taq ашылып, Science журналында жариаланып молекула жылы деп аталды. Hoffmann-La Roche Inc. және Cetus шешiмі бойынша ПТР-ді диагностикалық мақсаттарға қолдана бастады. 1990 жылы ғалым Cetus, D. Gelfand және S. Stoffel тазаланған Taq DNA-полимеразы анықтаған және де сот сараптамасында брініші ретосы әдісті қолданған. Cetus, H. Erlich и Kary Mullis  биохимия саласында Неміс қоғамында наградаға лайықталған.

          Политізбектік реакция – ДНҚ-ның табиғи репликациясын беретін және басқа да миллиондаған молекулалардың ішінен ДНҚ-ның жалғыз ерекше молекуласын анықтауға мүмкіндік беретін өте тамаша әдіс.

          Политізбектік реакция әдісінің ашылуы соңғы он жылда молекулалы биология обылысында аты танымал жаңалықтардың бірі болды. Бұл әдіс медициналық диагностиканы сапалы жаңа деңгейге көтеруге мүмкіндік береді.

          ДНҚ көшірмесін алу үшін реакциялық қосындыға кіретін ингредиенттердің праймерлері (ДНҚ-ның қысқа жасанды жолмен синтезделген молекулалары) және құрамының қолданылуының негізгі принціптері алғаш рет 1971 жылы Kleppe және авторлар бірлестігімен сипатталған. Бірақ ол уақытта ПТР-дің ДНҚ-ға кіретін үзінділер көшірмесінің санының (экспотенциялды) көрсеткіштік ұлғаюы реакциялық нәтиже ретіндегі негізгі қасиеті әлі көрсетілмеген-ді.

          1983 жылы «Cetus» фирмасының жұмысшысы Kary  Mullis политізбектік реакция ретінде кейіннен танымал болған әдісті ұсынады. Әдістің негізгі мәні қайталанбалы  температуралық циклдер  процесінде ДНК-нің белгілі бір учаскілерін  пробиркада  көпреттік көшіруде  (амплификациясында) болып табылады. Амплификацияның  әрбір  циклінде  бұрын синтезделген үзінділер ДНҚ-полимеразамен  қайта көшіріледі. Осының арқасында ары қарай талдауды біраз жеңілдететін ДНҚ-нің ерекше фрагменттерінің санының көп есе ұлғаюы жүзеге асады.

          Бұл жаңалықтың ашылуымен бірге кейбір технологиялыардың дамығандығын атап кету керек. Дәлірек айтсақ, ДНҚ-нің   біртізбек үзінділерін автоматты түрде синтездеуге мүмкіндік беретін құралдардың  пайда болуы. Дәл сол кезде гейзерлерде өмір сүретін ерекше микроағзалар анықталған. Олардың ферментативтік жүйесі және ДНҚ-полимеразасы ыстық қайнар көздерінің жоғарғы температураларын сақтайды және биологиялық белсенділігі 95° С-қа дейін сақталады, бұл температура  көрсеткіш политізбектік реакцияны жүргізу үшін қажетті жағдай туғызады.

          ПТР-дің ашылу нәтижесі әдістің тез арада тәжірибелік қолданылуына алып келді. 1985 жылы Saiki авторлар бірлестігімен бірге Р-глобинның геномды тізбектелуінің амплификациясы сипатталған мақаланы жариялады. Осы кезден бастап авторлар өздерінің жұмыстарында ПТР-дің қолданылуы туралы жазған мақалалар саны геометриялық прогресске біршама өсе бастады. Әдістің соншалықты танымалдылыққа ие болғандығы сондай, тіпті қазіргі уақытта молекулалы биология саласында оны қолданусыз жұмысты көз алдына елестету қиын болып отыр. Әсіресе политізбекті реакция әдісінің өршіген дамуына «Адам геномы» ұлтаралық бағдарлама арқасында жетті. Сондай-ақ, қазіргі заман сквинерлеудің лазерлік технологиясы (ДНҚ-ның нуклеотидті тізбектелуінің оқылуы) жасалды. Бұрын 250 жұп нуклеотид (ж.н) өлшемі бар ДНҚ-ның тізбектелуінің оқуылуы үшін бір апта уақыт қажет болса, қазіргі заман лазерлік сквенаторлар күніне 5000 жұп нуклеотидке дейінанықтауға мүмкіндік береді. Бұл өз кезегінде әртүрлі биологиялық қбъектілердің ДНҚ тізбектері құрайтын мәлеметтердің ақпараттық базасының өсуіне мүмкіндік береді. Бүгінгі таңда ПТР-дің әртүрлі модификациясы ұсынылуда, микроағзаларды анықтау үшін тест-жүйелерінің құрылуына, нүктелі мутацияны анықтауға мүмкіндік тудырып отыр, әдістің ондаған әртүрлі қолданылуы суреттелуде. [3-8]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.2 ДНҚ-ң құрылысы мен құрамы

 

Нуклеин қышқылдары жасушаның ең маңызды бөлігі болып саналады. Нуклеин қышқылының молекуласын ХІХ ғасырдың  аяғында 1868 жылы Щвейцария ғалымы Ф. Мишер ашқан болатын.  Ал ДНҚ мен РНҚ-ң қызметтері, молекуласының құрылысы, кейінірек қана белгілі болды.

          Қазіргі кездері нуклеин қышқылдарының  тұқым қуалаушылықтың материалдық негізі екеніне ешкім күмән келтірмейді, бірақ бұл тек 1950 жылы Х.Френкель-Конрат тәжірибелері нәтижесінде ғана үзілді-кесілді дәлелденген болатын. Ал, ХХ ғасырдың 20 жылдарында (1928 ж.) тұқым қуалаушылықтың материалдық негізі ретінде ақуыз молекуласы саналып келген еді.

          Тек ХХ ғасырдың 20 жылдары Т. Морган т.б. ғалымдардың еңбектері арқасында тұқым қуалаушылықтың материалдық негізі хромосомалар екені белгілі болды. Тұқымқуалаушылықтың хромосмдық теориясы ашылған болатын. Сонымен бірге хромосомалар ақуыз және нуклеин қышқылынан (ДНҚ) тұратындығы анықталды. Ал, осы екі макромалекулалардың – ақуыз және нуклеин қышқылының (ДНҚ)  қайсысы тұқым қуалаушылыққа жауапты деген мәселе ғалымдар арасында біршама пікірталас туғызған болатын. Ал, 1928 ж. Н.К. Кольцов ген қызметін ақуыз молекуласы атқаруы мүмкін деген болжам жасады және 1940 жылға дейін ғалыдардың көпшілігі осы пікірге келісіп келген. [30]

          1928 жылы Ф. Гриффитс бактериялардың трансформациялау қабілетіне тәжірибе жасап, тұқым қуалаушылыққа ақуыз емес ДНҚ молекуласы жауапты болуы мүмкін деген болжам жасаған болатын.

          Трансформация – дегеніміз бактериялардың бір штамының екінші бір штамының ДНҚ молекуласының бір бөлігін өзіне қосып алып, оның қасиетіне ие болуын айтамыз.

          Ф.Гриффитс тышқандарғы вирулентті (патогенді) және  вирулентті емес (патогенді емес) пневмококк штамдарын енгізіп, пневмококк  штамдарының  вируленттік қасиеті ДНҚ молекуласының фрагменттері арқылы деп болжамдаған.

          1944 жылы О.Эйвери, К.Мак Леод және М.Мак Карти осы тәжірибені жаңа әдістемелік деңгейде қайталап Ф.Гриффитс болжамын растады.

          1952 жылы Н.Циндер және Д.Ледерберг трансдукция құбылысын ашып (трансдукция бактериофагтардың бактерияның бір штамының ДНҚ фрагментін екінші штаммына көшіре алу қасиеті) ДНҚ молекуласының тұқым қуалаушылықтағы рөлі туралы тағы бір дәлелдемеге қол жеткізген болатын.

          1950 жылы Х. Френкель-Конрат темекі өсімдігіне темекі мозайкасы вирусының врулентті және вирулентті емес штамдарының ақуыз және РНҚ  молекулаларын жеке-жеке және бірге енгізіп, тәжірибе жасап, тұқымқуалаушылық ақпарат ақуыз молекуласында емес, нуклеин қышқылдарында болатындығын үзілді –кесілді дәлелдеген болатын.

          Х.Френкель –Конрат тәжірибесінің  мәні мынада: егер вирулентті  вирус штамының тек ақуыз молекуласын өсімдікке енгізгенде ауру дамымаған, ал вируленті вирус штамының РНҚ молекуласын темекі өсімдігіне енгізгенде ауру дамыған еді. Сол сияқты, вирулентті вирус штамының ақуыз молекуласын және вирулентті емес РНҚ молекуласын бірге енгізгенде ауру дамымайды, ал вирулентті емес вирус штамының ақуыз молекуласын және вирулентті вирус штамының РНҚ-сын бірге енгізгенде ауру дамыған.

          Нуклеин қышқылдарының екі түрі белгілі: ДНҚ   және  РНҚ.

          Нуклеин қышқылдары – полимерлер, олардың мономерлері болып нуклеотидтер саналады. Нуклеоидтар өз кезегенде 3 бөліктен құралған.

          Нуклеотидтер молекуласында азоттық негіздердің пуриндік – Аденин (А) не Гуанин (Г); немесе пиримидиндік – Цитозин (Ц), Тимин (Т) не Урацил (У) деген түрлері, қант ретінде – дезоксирибоза не рибоза, 1 фосфор қышқылының қалдығы (монофосфат) кездеседі.

Дезоксирибонуклеин қышқылының (ДНҚ) құрылысына келетін болса ол, ДНҚ (дезоксирибонуклеин қышқылы) нуклеотидтері-дезоксирибозадан, азоттық негіздерден, 1 фосфаттан (монофосфат)  құрылған, оларды – д АМФ, д ГМФ, д ЦМФ, д ТМФ деп атайды.

          ДНҚ молекуласы қосширатпалы болып келеді (Ф. Крик, Дж Уотстон). Оның алғашқы, екінші реттік, үшінші реттік құрылыстары белгілі).

          ДНҚ молекуласының алқашқы құрылысы — бір жіпші нуклеотидтердің (А, Г, Ц, Т) бірізділікпен тізбектеліп орналасуы болып табылады. ДНҚ алғашқы құрылысы фосфодиэфирлік  байланыс арқылы тұрақтанады, яғни бір жіпшедегі  нуклеотидтер бір-бірімен фосфаттық топ және қаныттың гидроксил тобы арқылы байланысқан. [13-15]

          ДНҚ молекуласының екінші реттік құрылысы оының екі жіпшесіндегі азоттық негіздердің бір-бірімен сутектік байланыс арқылы комплементарлы байланысуы (А-Т; Г-Ц) болып табылады. ДНҚ жіпшелері полярлы болады, яғни оның 5′ және 3′ ұштаы белгілі. ДНҚ молекуласының  қосширатпасы (тізбектері) бір-біріне антипараллель орналасқан;

          Қос ширатпаның бір оралымында 10 жұп нуклеотидтер кездеседі, ал оралымның ұзындығы 3,4 нм тең.

          Сонымен қатар, А-Т арасында 2 сутектік  байланыс болса, Г-Ц арасында 3 сутектік байланыс болады. Сондықтан-да Г-Ц байланысы, А-Т байланысына қарағанда әлдеқайда мықтылау болады.

          ДНҚ молекуласының 3 реттік құрылысы ретінде оның ақуыздармен (гистондық ақуыздармен) байланысын айтуға болады.

          Хромосома ақуыздарының 60-80 пайызын-негіздік және гидрофобтық аминқышқылдар (аргинин, лизин, валин, т.б.) көптеп кездесетін гистондық ақуыздар құрайды. Гистондық ақуыздар ДНҚ –мен негіздік радикалдар арқылы әрекеттеседі. Хромосомаларда ДНҚ молекуласы гистондық ақуыздармен байланысып нуклеогистон құрайды, ол хроматин жіпшесі ретінде белгілі. Хроматин жіпшесінің тірегін нуклеосома денешіктері құрайды. Ол 4 түрлі гистондық ақуыздардың –гистон Н_2А, гистон Н_2в, гистон3, гистон 4- (Н_2а, Н_2в, Н₃, Н₄)  қос молекуласынан құралған.

          Осындай әр бір денешікті ДНҚ молекуласы екі рет ширатылып оларды және оының ұзындығы 140 н.ж. тең. Нуклеосома денешіктірі бір-бірімен тығыз жабысып орналаспай біршаа алшақтау орналасқан нукеосома денешіктірінің аралығындағы ДНҚ учаскілерін линкерлік (жалғаушы) учаске деп атайды, ал әрбір линкерлік учаскемен гистондық ақуыздың 5-ші түрі –Н1 байланысқан.

Хроматин жіпшесінде ДНҚ өте көп, 600 000-ға жуық, нуклеосома денешіктерін түзеді. Ұзындығы 190 см, жететін ДНҚ молекуласының өлшемі жағынан микроскопиялық, бірнеше микрометірге -180 мкм. тең, 46 хромосомаларда тығыздалып, ширатылып  орналасуына нуклеосома денешіктері мүмкіндік береді.

Жасуша ядросының барлық хромосомаларында орналасқан ДНҚ ұзындығы 190 см, тең, ал нуклеосома жіпшесінің ұзындығы ДНҚ ұзындығынан 6,2 есе кем.

Нуклеосома жіпшелері әрі қарай ширатылып хроматин жіпшелеріне айналады. Хроматин жіпшелерінің ұзындығы нуклеосома жіпшелерінің ұзындығынан 18 есе кем, ал ДНҚ молекуласының ұзындығынан 6,2х18=100 есе кем.

Хроматин жіпшелері митоз кезінде әрі қарай ширатылып, қатпарланып, тығыздалып митоздық хромосомаларды туғызады. Митоздық хромосомаларда хроматин жіпшелері хромосоманын ұзына бойына көптеген рет қатпарлар пайда етеді (кейбір  деректер бойынша 100 ретке дейін), осының нәтижесінде барлық хромосомалардың ұзындығы (180 мкм) ДНҚ молекуласының ұзындығынан 100 000 есе кем болады.

Сонымен қатар нуклесомалар құрылымдық (хроматин тірегі), реттеуші қызметтерді де атқарады.

ДНҚ молекуласының бойында тұқым қуалаушылық ақпарат жазылған, ол негізінен (95%) ядрода, ал 5% цитоплазмада, митохондрияларда, хлоропластарда шоғырланған.

Рибонуклеин қышқылының (РНҚ) құрылысына келетін болсақ ол, РНҚ-да ДНҚ сияқты полимер-сызықты полинуклеотид, ал мономерлері болып рибонуклеотидтер саналады. РНҚ нуклеотидтерінде рибоза, 4 азоттық негіздер – А, Г, Ц, У, бір фосфор қышқылының қалдығы кездеседі, оларды рАМФ, рГМФ, рЦМФ рУМФ деп бейнелейді.

Нуклеотидтер 5′, 3′ – фосфодиэфирлік байланыс арқылы байланысқан.

РНҚ-ның, полинуклеотид тізбегі полярлы болып келеді, яғни оның 5′ және 3′ ұштары болады.

Сол сияқты, РНҚ молекуласының ДНҚ молекуласынан айырашылықтары да белгілі.

• Ең негізгі айырмашылығы РНҚ молекуласы қосширапалы емес, қосшиыртпалы емес бір ширатпалы. Оның 3 себеі бар.

А) біріншіден, РНҚ молекуласындағы пентоза (қант) дезоксирибоза емес, қосымша гидроксил тобы бар, рибоза болып табылады. Ал, қосымша қосымша гидроксил тобы қосширатпалы құрылымының түзілуін тежейді.

Б) екіншіден, РНҚ молекуласында негізгі не мажорлық азоттық негіздерден тиминнің орнына урацил кездеседі (А, Г, Ц, У). Урацил тиминнен 5 метил тобының болмауымен ерекшеленеді. Осыған байланысты А-У арасында гиброфобтық әрекеттесу күші А-Т-ға қарағанда әжептеуір әлсіз болады. Ал, бұл тұрақты қосширатпалық құрылымның түзілуі мүмкіндігін төмендетеді.

В) РНҚ молекуласында (әсіресе т РНҚ-да) өзгерген, модификацияланған минорлық негіздердің және нуклеозидтердің мөлшері өте көп. Олардың ішінде – дигнодроуридин (урацилде 1 сутектік байланыс болмайды, яғни 3 сутектік байланыстың орнына 2 болады); псевдоуридин (урацил рибозамен ерекше байланысқан); диметиладенин және диметилгуанин (азоттық негіздерде екі қосымша метил тобы болады). Бұл негіздер комплементерлы әрекеттесуге қабілетсізү Осының бәрі қосширатпалы құрылымның пайда болуына кедергі келтіреді.

Сонымен, көпшілікке мәлім РНҚ молекуласының бір ширатпалы болуының орасан зор биологиялық маңызы бар, себебі РНҚ өзінің негізгі қызметтерін тек бір ширатпалы күйінде ғана орындай алады, бұл әсіресе а-РНҚ молекуласын тән: мысалы, қалайша қосшиартпалы а-РНҚ рибосомаларда трансляцияланар еді?

Сонымен қатар, РНҚ негізінен бір ширатпалы (тізбекті) болуымен бірге, кейде қосширатпалы «ілмекшелер» де пайда етеді (т-РНҚ).

Құрысылы, қызметтері жағынан түрліше болып келетін 3 түрлі РНҚ белгілі: а-РНҚ, т-РНҚ, р-РНҚ.

ДНҚ репликациясы. ДНҚ молекуласының ең маңызды қасиеттерінің бірі-оның өздігінен екі еселенуі (репликациялануы) болып саналады. ДНҚ репликациялануы салдарынан тұқым қуалаушылық ақпарат ұрпақтан-ұрпаққа өзгеріссіз, тепе-тең мөлшерде беріліп, ұрпақтардың  жалғасуы қамтамасыз етіледі. ДНҚ репликациясы жасуша циклының S – синтетикалық кезеңінде жүзеге асады.

ДНҚ молекуласының репликациялану қасиеті 1953 жылы Дж. Уотсон және Ф. Криктің ДНҚ молекуласының құрылысының қос ширатпалы болатындығын анықтағаннан кейін белгілі болды.

Теория күйінде  ДНҚ репликациясының 3 түрлі әдісі болжамдалған: 1) консервативті (тұрақты); 2) жартылай консервативті; 3) дисперсті.

Көптеген тәжірибелер  нәтижесінде ДНҚ молекуласының репликациялануы жартылай консервативті жолмен жүретіндігін дәлелденді.  Оны алғашқылардың бірі болып 1958 жылы М.Мезельсон және Ф.Сталь Е.соlі жасушасында байұаған.

Қазіргі таңда ДНҚ молекуласының сырт пішінінің 3 түрі белгілі: тұрақты сақиналы (бактериофагтарда);  құбылмалы сақиналы (бактериофагтарда); сызықты (прокароттар және эукариоттарда). Осыған сәйкес ДНҚ молекуласының жартылай консерватвті репликациялануының 3 түрі белгілі: 1) тета репликация; 2) сигма репликация; 3) У-тәрізді репликция.

Кейбір прокариоттардың және басқа барлық эукариоттардың ДНҚ молекуласы сызықша тәрізді болып келеді және олардың репликациялануы белгілі бір нүктеден, репликативтік ісінудің пайда болуынан басталып, хромосоманың қарама-қарсы жағына қарай бағытталады. Эукариоттардың ірі хромосомаларында бір мезгілде жүздеген репликациялық ісінулер пайда болады және олар бір-бірімен қосылып У-тәрізді аралық құрылым пайда етеді. Мұны У-тәрізді жартылай консерватвті репликациялану деп атайды.

ДНҚ молекуласының негізгі бөлімінің бірнеше ерекшеліктері белгілі: а) ДНҚ молекуласының жаңа тізбегінің синтезделуіне қажет заттар- дезоксинуклеозидифосфат (дНТФ) болып табылады, ал ДНҚ құрамында дезоксинуклеозидмонофосфаттар (дНМФ) кездеседі.  Сондықтанда ДНҚ тізбегіне жалғану алдында әрбір нуклеотидтен 2 фосфат қалдығы прифосфат күйінде бөлініп шығады да тез арада фосфаттарға дейін гидролизденеді.

Еркін дНТФ→дНИФ қалдығы +пирофосфат

дНТФ-ды құрылыс материалдары ретінде пайдаланудың энергетикалық себептері де бар. Нуклеотидтер арасындағы байланыстардың (фосфодиэфирлік) түзілуі үшін энергия қажет, ал энергия фосфаттараралық байланыстардың үзілуі нәтижесінде бөлінеді.

Б) ДНҚ репликациясы матрицалық (қалыптық) үдеріс яғни ДНҚ-ның жаңа тізбегі аналық ДНҚ молекуласының бір жішесі  негізінде (матрица) комплементарлық ұстанымен (принциппен) синтезделінеді, яғни 4 нуклеотидтен (дАТФ, дГТФ, дТТФ) жаңа тізбекке тек аналық жіпшедегі нуклеотидке комплементарлы (А↔Т; Г↔Ц) нуклеотид қана қосылады.

В) ДНҚ синтезі (репликациясы) симметирялы болады, яғни матрица қызметін аналық ДНҚ молекуласының  екі тізбегі де атқара береді. Сондықтан оны жартылай консервативті деп те атайды. Себебі, жаңадан синтезделген ДНҚ молекуласы жартылай жаңарған болады, яғни оның бір тізбегі ескі-аналық молекуладан алынған болса (матрица), екінші жаңадан синтезделген  болады.

Г) ДНҚ синтезі (жаңа тізбектің не оның бір бөлімінің синтезделуі) белгілі бір бағытта жүреді, яғни 5′ ұшынан 3′ ұшына қарай жүреді.

Д) ДНҚ репликациясы басталу, жүруі үшін, міндетті түрде аналық ДНҚ молекуласының қос ширатпасы бір-бірімен ажырасуы қажет, тек осы жағдайда, яғни бір-бірінен ажырасқан аналық молекуланың жіпшелері матрица (қалып) қызметін атқара алады.

Репликация тетіктері немесе репликация үдерісі 15-20 ақуыздан тұратын күрделі ферменттік жүйенің қатынасуымен жүзеге асады.

Эукариоттар хромосомаларында жоғарыда айтқанымыздай, бір мезгілде көптеген ферменттік кешендер қызмет етеді, яғни хромосомада ДНҚ репликациясының көптеген ферменттік кешендер қызмет етеді, яғнихромосомада ДНҚ репликацясының көптеген басталу (инициация) нүктелері болады және ДНҚ синтезі хромосоманың бас жағынан ұшына қарай баяу жүрей, көптеген жерлерінде бір мезгілде жүзеге асады. Бұл репликация ұзақтығынан едәуір қысқартады.

Репликацияның әр бір нүктесінде 2 ферменттік кешен жұмыс істейді; олар ДНҚ-ның инициация нүктесінен қараа-қарсы бағыттарға қарай жүреді.

ДНҚ молекуласының тізбектері бір-біріне антипаралель болғандықтан және ДНҚ синезі тек 5’→3′ бағытында жүретіндіктен, репликативтік ашада аналық ДНҚ-ның бір тізбегі негізінде жаңа ДНҚ тізбегі үзіліссіз синтезделсе, екіншісі негізінде үзіліп-үзіліп синтезделеді. Біріншісін лидерлік тізбек, ал екіншісін артта қалушы (кешігуші) жіпше деп атайды.

Лидерлік тізбекке негізінде синтезделген өте ұзын, ұзындығы көршілес екі инициация нүктелерінің ұзындығының жартысына, яғни 1 600 000 нуклеотидке тең, тізбек синтезделсе, артта қалушы (кешігуші) тізбек негізінде қысқа 1500 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ фрагменттері синтезделеді. Оларды Оказаки ферменттері деп атайды.

ДНҚ синтезі басталуы үшін міндетті түрде 10-15 нуклеотидтерден тұратын «РНҚ-ұйытқы»-праймер қажет, себебі ДНҚ синтезін жүргізетін фермент ДНҚ-полимераза өз бетінше ДНҚ синтезін бастай алмайды.

ДНҚ молекуласындағы репликацияның басталу (инициация) нүктелері А-Т нуклеотидтер жұптарына бай бірізділікерге ие. Ерекше  танып білуші ақуыз (А) әрбір осындай нуклеотидтер бірізділігіне (А-Т  бай) ДНҚ – репликациялаушы кешенді байланыстарды да өзі әрі қарай, кешенмен бірге жылжымайды.

          А-тандап білуші ақуыз; Г-геликаза; И-тополимераза; S-SSВ-ақуыз; П-праймаза АП-праймаза активаторы; α,β,δ,-ДНҚ полимеразалар; Р-РСNА-ақуыз; Н-нуклеаза; ДНҚ лигаза.

          Ферменттік кешеннің ең алғашқы іске кірісетін ферменті – геликаза (Г). Ол аналық ДНҚ молекуласының қос ширатпасының ашылып, жіпшелердің бір-бірінен ажырауын қамтамасыз етеді.

Ширатпаның ашылып жазылуы әрі қарай үлкенді-кішілі түйіндердің  (суперспирализация) пайда болуына алып келеді. Мұның себебі әрбір ДНҚ молекуласы өздерінің бірнеше учаскелерімен ядро матриксіне бекінген, ал бұл ширатпалары ашылған ДНҚ молекуласының еркін айналуынамүмкіндік бермейді, сондықтан да түйіндер пайда болады.

Бұл мәселе топоизомераза (И) ферментінің қатынасуы арқылы шешіледі.

          Сонымен, геликаза, топоизомераза ферменттері аналық ДНҚ молекуласының қос ширатпасын жеке-жеке екі тізбекке ажыратады. Ажырасқан әрбір тізбекпен ерекше SSВ-ақуыздар байланысады, олардың қызметі бір-бірінен ажырасқан жіпшелерді керіп, күні бұрын жанасып, қос ширатпаның түзілуін болдырмау болып табылады. [17-26]

 

 

 

1.3 ПТР-диагностикасының тәжірибелік қолданылудың перспективалары

 

          LabMedica International журналында берілген мәлеметтерге сүйенсек, 1995 жылдан бастап, ПТР-диагностикаға кеткен шығындардың ұлғаюы байқалады, бұл ПТР-дің тәжірибелі медицинада қолданылуының өсу көрсеткіші болып табылады. Американдық ғалымдар 1996 жылы ДНҚ-диагностикаға 181,6 миллион доллар қаражат кеткендігін атап көрсеткен, ал 2003 жылға қарай, маман иелерінің болжауы бойынша, қаражат шығыны 1400,0 миллион долларға өседі.

          Аталған журналдардың берген мәлеметтері бойынша қазіргі таңда ПТР-диагностиканың бес негізгі бағыты тез дамуда:

• Инфекциялық аурулардың диагностикасы;
• Онкологиялық аурулардың диагностикасы;
• Генетикалық аурулардың диагностикасы
• Тұлғаның танылуы (идентификациясы);
• Тамақта патогенездерді диагностикалау;

ДНҚ-диагностиканың нарықта дамуының басты бағыты инфекциялық аурулардың диагностикасы болып табылады. Осы салада қолданысы кең етек алған иммунды-ферменттік талдауға (ИФТ) қарағанда, ДНҚ-диагностика аурудың қоздырушысын дәлме-дәл анықтауға мүмкіндік береді. ПТР-дің сатыларының жетілдірілген сызбаларының көмегімен өте төмен концентрациясында патогенді микроағзаларды анықтауға болады.

Онкологиялық аурулардың ДНҚ-диагностикасы ісікті аурулармен байланысты гендер туралы мәлеметтердің үлкен емес, бірақ өте белсенді өспелі санымен шектеледі. «Адам геномы» проектісінің арнасында ғалымдар осы патологиямен байланысты мутацияларды зерттеуді жалғастыруда.

Онкологиялық сияқты, генетикалық аурулардың диагностикасы адам геномын ауқымды ғылыми зерттеулерді  жүргізген соң ғана дамуы мүмкін. Медициналық бірлестік аурудың генетикалық негізін зерттеудің маңыздылығын, сондай-ақ диагностикасының мүмкіндігін және де аурудың симптомдарының пайда болуына дейінгі емдеу курсын бастау мүмкіндігін мойындайды.

Маман иелерінің баға беруі бойынша, құрамына соттық медицинаны, креминалистиканы, органдар мен ұлпаның трансплантациясын енгіздіретін тұлғаны тану (идентификация) ДНҚ-диагностикасының  нарығында өте ірі және тез өспелі бағыттарының бірі. Бұл салада шығындардың жыл сайын өсімі 21,3%-дық көрсеткіштің белгіленуі көрсетілуде.

Тамақта патогендердің ДНҚ-диагностикасының нарығы өте қарапайымдылығымен белгілі. Қазіргі таңда өңдірілетін тамақ өңімдерінің микропты ластануының ДНҚ –диагностикасына өңімдердің ластануын тексеру үшін қолданылатын әдістердің ( культуральді әдістер және моноклональды антиденелерді қолданатын әдістер). Жалпы санынан 5%-дан төмен келіп отыр. Бірақ ДНҚ-диагностика әдістері, маман иелердің баға беруі бойынша тез, дәл және ақпаратты болып табылады, бұл бәлкім жақын болашақта осы салада ДНҚ-диагностикасының нарығында олардың екіншісінің жылдам өсуіне әкеледі. [37]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ІІ Зерттеу бөлімі

2.1 Политізбектік реакция әдісінің механизімдері

 

Политізбектік реакцияның жүргізілуі  үшін келесі бірқатар компоненттерінің реакциялық қосындыларының болуы қажет.

Праймерлер – жасанды жолмен синтезделген олигонуклеотидтер, ережеге сай олардың өлшемдері 15-тен 30 жұп нуклеотидтері бар, ДНҚ-мишенінің сәйкес учаскілеріне пара-пар. Олар амплификацияның реакциясының өңімдерінің пайда болуында негізгі роль атқарады. Дұрыс таңдалған праймерлер тест-жүйенің ерекшелігін және сезімталдығын қамтамасыз етеді.

Tag-полимеразасы – термотұрақты фермент, ДНҚ-ның екінші тізбегінің 3′-ші соңын құрып бітіруді толықтыру принципіне сәйкес қамтамасыз етеді.

Дезоксинуклеотидүшфосфаттар қосындысы (дНТФ)-дезоксиаденинүшфосфат (дАТФ), дезоксигуанозинүшфосфат (дГТФ), дезкокцицитозинүшфосфат (дЦТФ) және дезкоситиминүшфосфат (дТТФ) – ДНҚ-ның екінші тізбегін синтездеу үшін  Tag-полимеразасымен қолданылатын «құрылыс материалы».

Буфер – белгілі бір концентрациясындағы катиондар мен аниондардың қосындысы, реакция, сондай-ақ рН-тің тұрақты маңызына қажетті жағдай туғызады.

Талданбалы үлгі – реакциялық қосындыға енгізуге дайын, ДНҚ негізін құрай алатын препарат, мысалы ДНҚ микроағзалары – кейінгі көпреттік көшіру үшін мишень ретінде қызмет етеді. Егер ДНҚ-мишені жоқ болса, амплификацияның ерекше өнімі пайда болмайды.

Айналымдық температуралық режим. Егер таңдалмалы үлгіде ДНҚ негізі болатын болса, онда амплификацияның реакциясы процесінде онымен бірге бірқатар белгілі температуралық айналымды қамтамасыз ететін жағдайлар жүреді. Амплификацияның әрбір айналымы үш сатыдан тұрады:

1. Денатурация. Бірінші сатыда үлгіде болатын ДНҚ-ның екінші тізбегін ажырату қажет. Бұл үшін реакциялық қосындыны 92-95° С-та қыздырады, нәтижесінде ДНҚ-ның екі тізбектік молекуласы бір тізбектік молекуланың түзілуіен ыдырайды.
2. Күйдіру. Екінші сатысында праймерлер бір тізбектік ДНҚ-мишеніне қосылады. Бұл процесс «күйдіру» деп аталады. (ағылшын сөзінен «annealing»)

Праймерлерді негізгі үзінділердішектете отырып, жинайды және олар ДНҚ-ның қарама-қарсы тізбектерін толықтырғыш болып келеді.

Күйдіру екі тізбектік ДНҚ молекулаларында аденинге қарсы әрдайым тимин, ал гуанинге қарсы –цитозин болатындығын білдіретін Чаргафтың комплементарлы ережесімен сәйкес жүзеге асады. Егер бұл жағдай бақыланбаса, праймерлердің күйдірілуі жүзеге аспайды.

3. Элонгация (синтездеу). Үшінші сатыда реакциялық қосындыдағы температураны Tag-полимераза жұмысының қажетті шегіне дейін жеткізеді және екінші тізбектің синтезделуі максимальды тиімділігімен ары қарай жалғасады.

Кейде, прайерлердің күю температурасының жақын мағынасы жағдайында  және Tag-полимераза жұмысының қажетті шегінің температурасы кезінде күйдіру мен элонгацияны біріктіре отырып екі сатылы ПТР-ді қолдану мүмкін болады.

Амфлификацияның температуралық айналымы (30 және одан да көп рет) қайталанып отырады. Әр айналымда ДНҚ үзінділерінің синтезделген көшірлемер саны екі еселенеді.

Айналымдық процестің нәтижесі ДНҚ-ның ерекше үзіндісінің санының көрсеткіштік ұлғаюымен белгіленеді, оны А=М*(2^п-п-1)~2^п формуласымен сипаттауға болады. Мұндағы: А-амплификация реакциясының ерекше өңімдерінің (праймерлермен шектелген) саны; М- ДНҚ мишенінің бастама саны; п-амплификация айналымдарының саны;

Амплификацияның жеке айналымдар тиімділігінің шынайы мәні кейбір мәлеметтер бойынша 78-97%-ды құрайды. Реакция ингибиторларының үлгіде болуы жағдайында бұл мән біршама аз болуы мүмкін, сондықтан да амплификацияның ерекше өңімдерінің фактілі санын келсі формула жақсырақ сипаттайды:

А=М*(1+Е)^п

Мұндағы, Е-реакция тиімділігінің мәні.

Амплификация процесі барысында соңғы тізбекте синтезделетіндігін, бірақ ұзын үзінділердің жиналуы тек амплификациялық прогрессияда келесі формула бойынша жүзеге асатындығын ескере кету қажет:

К=М*п

Мүндағы, амфлипикацияның ұзын өңімдерінің саны.

Қорта келе, соңдарында праймерлермен шектелген ерекше үзінділер алғаш рет екінші  айналым аяғында пайда болып, геометриялық прогрессияда жиналып, амплификация өңімдері арасында басымдылық көрсете бастады.

 «Плато әсері». Амплификацияның ерекше өңімдерінің жиналуы процесі геометирялық прогрессия бойынша тек шектеулі процесі геометриялық прогрессия бойынша тек шектеулі уақытта ғана жүретіндігін ал одан кейін  оның әсерлігі критикалық деңгейге дейін түсіп кететіндігіне ерекше көңіл бөлу қажет. Бұл процесс «плато әсері» деп аталатын механизіммен байланысты.

Амплификация реакциялыраның айналымдарының жағдайлары мен санына байланысты «плато әсері» сәтіне жетуіне: субстраттардың қолданылуы (дНТФ және прайерлер) реагенттердің (дНТФ және ферменттердің) тұрақтылығы; ингибиторларды, трифосфаттар мен ДНҚ-дуплекстердің саны; праймерлер дНТФ және полиераза үшін бәсекеге түсетін праймер димерлер емес жай өңімдер; амплификация өңімдерінің жоғары құрамдық көрсетуі барысында ерекше өнім концентрациясы мен толық емес денатурация ықпалын тигізеді. ДНҚ-мишенінің бастапқы құрамы қаншалықты аз болса, платоға реакциялар шығымды қауіпі соншалықты жоғары болады. Бұл сәт амплификацияның ерекше өңімдерінің саны оларды талдау үшін жеткілікті болғанда түсуі мүмкін. Жақсы дайындалған тест жүйелер бұл сәттің түсуіне жол бермейді. [26-31]

 

2.2 Биологиялық материалдың үлгісін дайындау

 

ПТР – талдау үш сатыдан тұрады.

ПТР-дің орын алуына үлгілерді даярлау үшін қойылатын міндеттерге байланысты әртүрлі әдістемелер қолданылады. Олардың маңыздылығы биологиялық препараттан ДНҚ-ны алып тастауда және амплификация реакцияларының жүруі үшін жарамдылығы және тазалығы сақталған ДНҚ препараттарын алу үшін бөтен қосындылық құралады нейтралдау немесе мүлде жоюда болып табылады.

Кейде үлгіні 5-10 минут ішінде қайнатып алу жеткілікті болады, бірақ көпшілік жағдайда күрделі әдістердің орындалуын талап етеді.

Магнтитпен ұсынылған ДНҚ-ның таза препараттарын алу әдістемесе стандартты және классикалық болып үлгерген әдістеме деп есептеледі. Оның құрамына жасушаларды ферментативті протолизі, кейінгі спиртпен ДНҚ-ны депротеинизациялау және салқындатумен байланысты процестердің жүруі кіреді. Бірақ бұл әдіс өте күрделі болғандықтан, фенол және хлорофром сияқты заттардың агрессивті және қатты иістермен жұмыс істеуді білдіреді.

Қазіргі таңдағы өте танымал әдістердің бірі – Воот және авторлар бірлестігімен  ұсынылған ДНҚ-ны белгілеу әдісі болып отыр. Бұл күшті хаотропты агенттің  — гуанин тиоционатының  (GuSCN) жасушаның лизисі үшін қолданылуда алып жүрушіде (шыны моншақтар, диатомды топырақ және сыны «сүт» және т.б.) ДНҚ-ның кейінгі сіңірілуіне негізделуде.

Жуылып шайылған соң үлгіде буфер көмегімен онай алынатын алып жүрушіде сіңірілген  ДНҚ қалады. Әдіс қолдану ыңғайлы технологиялық және амплификацияға үлгіні даярлау үшін жарамды. Дегенмен де алып жүрушіде қайтымсыз сіңірілуі салдарынан, сондай-ақ жоғалып кетуі мүмкін. Әсіресе үлгіде ДНҚ-нің бірнеше санымен жұмыс істеу бар да бұл әдістің үлкен маңыздылығы көрініс табады. Сонымен қатар, тіпті GuSCN-нің іздің саны ПТР-ді жүргізі алады. Сондықтан да осы әдісті қолдану бар-да сорбитті дұрыс таңдау және технологиялық жаңалықтарды қолдануда жан-жақты қадағалау өте маңызды. Үлгімен жұмыс істеу бар да ертінділерді қосу және жою сатыларының көп болғандықтан жұмысқа тиянақтылық қажет етеді, себебі ДНҚ аэрозолмен пайда болған үлгілер арасында қиылысқан ластану жүзеге асуы мүмкін.

Үлгі дайындаудың басқа әдістер топтамасы Chilex типіндегі ион алмастырушыларды қолдануда негізделген, олардың ионы ыдыстардан өзгешілігі ДНҚ-ны емес, керсінше реакцияның  жүруіне кедергі келтіретін құрамдық қосындыларды сіңіреді. Ережеге сай, бұл технологияның екі сатысы болады: үлгіні қайнату, оның нәтижесінде жасуша қабырғасы бұзылып, нуклеинді қышқылдар ертіндіге шығады және ион алмастырушыда құрамдық қосындыларды сіңіру. Әдіс орындалуы жағынан қарапайымдылығымен танымал. Көпшілік  жағдайларда бұл әдіс клиникалық материалдармен жұмыс істеу үшін тиімді. Өкінішке орай, кейде ион алмастырушысымен жою мүмкін болмайтын құрамдық қосындылары бар үлгілер де кездесіп жатады. Сонымен қатар, кейбір микроағзалардың жасушалық қабырғалары жай қайнату арқылы бұзылмайды. Мұндай жағдайда үлгіні залалсыздандырудың қосымша сатыларын енгізу қажеттілігін тудырады.

Статистикалық мәлеметтердің алу үшін маңызды жаппай скрининг процесі бар да детергентерді немесе биологиялық материалдарды кейінгі нейтрализациялауымен бірге келетін сілтемемен залалсыздандыруды қолданатын қарапайым әдістердің қолданылуы жүзеге асады. Осыған орай,  үлгі дайарлаудың осыған ұқсас әдістерінің клиникалық диагностика жасау үшін қолданылуы қате нәтижелерге алып келеді, оның салдары реакциялық қосындыда ДНҚ-ның сапасыз препаратын қолдану.

Қортындылай келсек, үлгі дайарлаудың әдістерін таңдауда алдын-ала болжамдалған анализдерді жүргізудің мақсаттарын түсініп барып ат салысу қажет. [7]

Амплификация. Ампрификация реакцияны жүргізу үшін реакциялық қосынды дайындап, оған ДНҚ-ның талданбалы үлгісін енгізу қажет. Бұл ретте праймерлерді күйдірудің ерекшеліктерін есепке алу маңызды. Оның мәні әртүрлі молекулалары болуында, оларға реакцияда пайдаланылатын праймерлер жеке, кейбір жағдайларда ауқымды гомологиялық қатысы бар. Осыған қарамастан, праймерлер праймер-димерлерді құрап отырып, бір-бірімен күйдіріле алады. Праймер-димердің екеуінде праймерлердің реакцияның (ерекше емес) жанама өнімдерін синтездеу үшін үлкен шығынға алып келеді және соның салдары ретінде жүйенің сезімталдығын біраз төмендетеді. Бұл электрофорезді жүргізу барысында реакция нәтижелерін есепке алудың мүмкіндігін шектейді немесе қиындата түседі.

ПТР-дің «ыстық бастаманы» қолдану арқылы жүзеге асырудың жолдары. Амплификация реакцияның жанама өңімдерінің пайда болу қауіпін азайту үшін «ыстық бастама» деген атауға ие болған (ағылшын тілінең «hot start»  сөзінен) жолды қолданады. Оның мәні праймерлердің ерекше күйдірілуін қамтамасыз ететін жағдайларға пробиркада жету сәтіне дейін реакцияның жүруі басталуын болдырмау мүмкіндігінде.

Бұл негізінен, ГЦ-құрам мен өлшеміне байланысты праймерлер ерудің (ТШ) белгілі бір температурасы болатындығымен түсіндіріледі, мұндай температура барысында сутектік байланыстардың пайда болуы тұрақсыз. Егер жүйе температурасы асып кетсе, праймер ДНҚ тізбегінде тұра алмай, денатурленеді. Қажетті жағдайларды қадағалау барысында, яғни күйдіру температурасы, еру температурасына жақын болғанда праймер екітізбектік молекуланы құрайды, бұл процесс тек оның толықтырғыштық жағдай барысында жүзеге асады, осылайша, реакцияның ерекшелігін қамтамасыз етеді. «Ыстық бастаманы» жүзеге асырудың әртүрлі нұсқалары да бар:

А) реакциялық қосындыға пробирканы денатурация температурасына дейін қыздырғаннан кейін алғашқы айналым кезінде Taq-полимеразаны енгізеді;

Ә) реакциялық қосындының құрамдарын қабаттарға бөлу, мәселен, парафин немесе воскты бөліктерге (астыңғыда-праймерлер, үстіңгіде- Taq-полимераза және ДНҚ-мишені) бөледі, олар қабат материалдарының еру температурасына жету барысында араласып кетеді. (~45-85°С);

Б) Taq-полимеразада моноклональды антиденелерді қолдану. Моноклональды антиденелермен байлансты ферменттер моноклаональды антиденелер қайтымсыз денатурленгенде және Taq-полимеразаның белсенді орталық сатысынан кейін ғана белсенді болады.

Барлық сипатталған жағдайларда, егер жанама күйдіру температуралық айналымның жүруі басталғанға дейін жүзеге асса, элонгация жүрмейді, ал кешенді қыздыру барысында ДНҚ-праймерлері денетурленеді, сондықтан да жанама өнімдер пайда болмайды. Ары қарай пробиркада температура еру температурасынан төмен болуын қамтамасыз етеді.

Жабдықпен қамтамасыз етілуі. Амплификация реакцияның жүруінің маңызды факторы жабдықталуды қамтамасыз ету болып табылады. Амплификатордың сенімділігімен температураларды ұстау дәлдігіген басқа, құрал-жабдықты әдеттегі қадағалау кезіндегіге қарағанда, біршама  аз уақыт аралығында пробирка ішінде реакциялық қосындының қажетті температураға жетуге мүмкіндік береттін маңызды қасиетін ескеру қажет. Осыған байланысты реакция уақыты қысқарады (1,5-2 есе); Taq-полмераза белсенділігінің сақтау уақыты ұзарады, бұл амплификация айналымдарының саны көбеюіне  мүмкіндік береді, ал праймерлердің жанама күйіп кету қауіпін төмендетуге, сәйкесінше, реакцияның сезімталдығы мен ерекшелігін жоғарлатуға мүмкіндік тудырады. [40, 23]

Мұндай топтың құралдарына амплификаторлардың «РСР-Systm 2400» немесе  «Model 9600» (Perkin-Elmer, АҚШ) «Touch Doun»  (HyBaid, Ұлыбритания ), «РСР 200» (МJResearch, АҚШ), «Терцик» (НПФ ДНҚ-Технология, Ресей) деген модельдерін жатқысуға болады. «Белсенді қадағалауы» бар құралдарды қолданған кезде ПТР-пробиркалардын типін ескерту қажет және дайындаушы фирмалардың ұсынымдарына сай қолдану қажет. Бұл температураның өзгеруінің жоғарғы жылдамдығы орнаған кезде амплификатор ұяшықтарының құрылымындағы кішігірім өзгешеліктер мен ПТР-пробирканың конус пішінді «белсенді қадағалау» басымдылығын жоққа шығарып, жылулық байланыстың нашарлауымен байланысты температуралық қателіктер кесірінен реакцияның сезімталдығын төмендете алатындығымен түсіндіріледі.

РНҚ молекуласының амплификациясы. ПТР үшін РНҚ-ы мишень ретінде қолдану мүмкіндігі бұл әдісті қолданудың аясын мағаналы қеңейте түсті. Мысалы, көптеген вирустардың (С гепатиті, инфлюэнца вирусы, пикорнавирустар және т.б.) геномдары дәл РНҚ-ның өзінде ұсынылады. Олардың өміршендік айналымдарына ДНҚ-ға ауысудың аралық фазасы болмайды.  РНҚ-ны анықтауда бірінші ретте оны ДНҚ пішініне ауыстыру  қажет. Бұл үшін ферменттік қайтымды транскриптаза да қолданылады, оларды әртүрлі екі вирустардан бөліп шығарады: Avian myeloblastosis virus және Moloney murinebeukemia virus. Бұл ферменттерді пайдалану кейбір қиындықтармен байланысты. Ең алдымен, олар термолабильді және сондықтан да 42°С-танжоғары емес температурада пайдаланыла алады. Себебі, осындай температурада РНҚ молекулалар екінші құрылымды оңай құрайды, ал реакция тиімділігі және әртүрлі баға беру бойынша шамамен 5%-ға тең.

Бұл кемшілікті Мn²⁺ барысында транскриптазалық белсенділігін көрсететін Thermus Thermophilus термофильді микроағзасынан алынған термотұрақты полимеразаны қайтымды транскриптаза ретінде қолдана отырып, жою жолдарын жүзеге асыруда. Бұл политізбекті, транскриптазалық белсенділікті көрсетуге қабілетті жалғыз танымал фермент.

Қайтымды транскрипцияның реакциясын жүргізу үшін реакциялық қосындыда ПТР-дегі сияқты праймерлер улы заттар ретінде болуы шарт және 4 дНТФ қосындысы «құрылыс материалы» ретінде болуы керек.

Қайтымды транскрипция реакциясы жүргеннен кейін пайда болған молекулалар ДНҚ-ға ПТР жүргізу үшін мишень ретінде қызмет атқарады.

Детекция. ПТР-дің нәтижелерін дұрыс бағалау үшін берілген әдіс сандық болып табылмайтындығын түсіну маңызды. ДНҚ-мишенінің бірліктік молекулаларының амплификация өнімдері теориялық түрде электрофорез  көмегі 30-35 айналымнан кейін анықталады. Дегенмен  де, тәжірибе жүзінде бұл процесс тек реакцияның өмірде сирек кездесетін үлгіге жақын жағдайларында жүргенде ғана орындалады. Әсіресе,  амплификацияның әсерлілігіне үлкен ықпалды ДНҚ препаратының тазалық деңгейі тигізеді, яғни реакциялық қосындыда сол немесе басқадай ингибиторлардың болуы, кейбір кездері олардан құтылу өте қиынға соқтырады. Кейде олардың құрамдық болуының кесірінен ДНҚ-мишенінің тіпті он мыңдаған молекулаларын амплифицирлеу жүзеге аспай жатады. Сонымен, ДНҚ-мишенінің соңғы саны мен амплификация өнімдерінің соңғы санының арасында тікелей байланыс жиі болмайды.

Көлденең электрофорез әдісі. Амплификация нәтижелерін көзбен көру үшін әртүрлі әдістер қолданылады. Бүгінгі таңдағы ең көп таралған әдіс ол электрофорез әдісі болып отыр, бұл әдіс ДНҚ молекулаларының өлшемі бойынша бөлуде негізделген. Ол үшін ДНҚ-нің арнайы бояғышын қосу арқылы 1,5-1,2% құрамындағы агарозының электрофорездік буферде балқуынан кейін қатқан агорозды гельдің жалпақ тілімін дайындайды, — мәселен, бромды этидия. Қатқан агороза кеңістіктік тор көздерді құрайды. Ожау көмегімен құйғанда гельде арнайы айырмашылықтардың пішініне келтіреді, олраға кейіннен амплификация өнімдерін енгізеді.  Гельдің жалпақ тілімін көлденең  гель-электрофорезі үшін аппаратқа салады және тұрақты электір көзіне қосады. Теріс зарятталған ДНҚ гельде минустан плюске қарай жылжи бастайды. Бұл ретте, ДНҚ-ның қысқа молекулалары ұзын молекулаларына қарағанда  жылдамырақ жылжиды. ДНҚ-ның гельдегі қозғалысының жылдамдығына агороза құрамы, электір жүйесінің қысымы, температура, электрофорезді буфердің құрамы және аз деңгейде ДНҚ-ның ГЦ құрамы әсер етеді. Бір өлшемді барлық молекулалар бірдей жылдамдықпен қозғалады. Бояғыш зат ДНҚ молекулаларына бір теріс тобымен тізбектеліп тұрады. 10 минуттан 1 сағатқа дейін жалғасқан электрофорездің аяқталуынан кейін, гельді трансиллюминатор сүзгішеге салады, онда ультракүлгін диапазонында (254, 310 нм) жарықшығарады. 260 нм аясында ДНҚ арқылы сіңірілетін ультракүлгін энергиясы бояғыш затқа көріну спектірінің сары-қызыл түсіне бояуы арқылы беріледі (590 нм).

Амплификация өнімдері жолақтарының  жарықтығы әр түрлі болуы мүмкін. Сол себепті, ПТР-зертханаларда жиі нәтижелері үш, төрт немесе бес балдық жүйемен бағалау қабылданған. Бірақ, жоғарыда айтылып кеткендей, мұны ДНҚ-мишенінің үлгідегі бастапқы санымен байланыстыруға болмайды. Жолақтардың жану жарықтығының азаюы жиі ингибиторлар ықпалы астында немесе басқа да факторлар әсерінен амплификацияның әсерлілігінің төмендеуімен байланысты.

Тік электрофорез әдісі. Тік электрофорез әдісі көлденең электрофорезбен принциптік ұқсайды. Олардың өзгешелігі агароза орнына мұнда полиакриламид қолданылады. Оны арнайы камерада тік электрофорез үшін өткізеді.

Полиакриламд геліндегі электрофорез агарозалық электрофорезбен салыстырғанда үлкен шешуші қабілетке ие және әртүрлі өнімдерін ДНҚ молекулаларын бір нуклеотид дәлдікпен ажыратуға мүмкіндік береді. Полиакиламид гелін даярлау агарозды гельге қарағанда қиындау. Сондай –ақ акриламид улы зат болып табылады. Амплификация өнімдерінің өлшемін 1 нукелеотидке дейінгі дәлдікпен анықтау мүмкіндігі сирек туатындықтан, көп жұмыста бұл әдісті қолданбайды.

Гибридизациялық зондтардың  әдісі. Амплификация өнімдерін анықтаудың  (детекция) басқа бір жолы арнайы құралдармен белгіленетін қандай да бір белгілерді құрайтын амплификация өнімдерімен бірге келетін олигонуклеотидті зондтардың ДНҚ-ның жасанды жолмен синтезделген учаскілерінің гибридизациялауға негізделеді. Бұл жағдайда, көбінесе, плашеттік формат және ИФА-да талданбалы қолданылатын детекция жүйесі қолданылады. Гибридизациялық әдістер олардың ұзақтығы мен әдістемелік іс-әрекеттердің қиындығына, қажырлы еңбекті көп талап етеіндігіне байланысты кеңінен  таралмаған. Бірақ олар жаппай скринг жүргізу жағынан қызықты, себебі сәйкес құрал-жабдықтардың болуы арқасында оңай автоматтандырылады.

Амплификация реакциясының жүруін бақылау. Оң бақылау реакциялық қосындының қылыпты кіретін барлық компоненттер реакциясының қалыпты жүруін қамтамасыз ететіндігіне көз жеткізуге мүмкіндік береді. Ол үшін праймерлерді күйдіру үшін сайттарды құрайтын ДНҚ препаратын пайдаланады: мысалы, ізделіп отырған микроағзалардың ДНҚ-сы немесе оның геномының клондағанда ерекше учаскілері. Жанама амплификондар ДНҚ-ның бақылаушы препараттарымен амплификация нәтижесінде пайда болған амплификондардан өлшемі бойынша өзгешеленеді. Олар үлкен, сондай-ақ кіші өлшемдер болады. Жағымсыз жағдайда олардың өлшемдері бірдей болуы мұмкін және электрофорезде оң ретінде оқылады.

Амплификацияның пайда болған өнімінің ерекшеліктерін бақылау үшін флюросцентті  (түсті) белгілер мен және радиоактивті изотоптармен және праймерлер сияқты ұқсас принциптермен сәйкес ДНҚ мен өзара әрекет етулерімен белігіленген гибридизациялық зондтар қолданылады.

Ішкі бақылаулар. Биологиялық материалдан ПТР-ға дайындалған ДНҚ препараты реакциясының әсерлілігін біраз төмендететін, ал кейбір жағдайда тіпті  ізделіп отырған қоздырғыштың болуы ерекше амплификондардың болмауына алып келетін ингибиторлардың құрамдық қосындысын алып жүре алады. Сол себепті реакциялық қосындысы бар ір пробиркада амплификацияның  жүруін қадағалау қажетті болып отыр.  Осы мақсатпен әр пробиркаға ішкі бақылау деп аталатын қосымша бақылауды қосады. Ол ізделуші микроағзасының ДНҚ-сымен сәйкес емес кез-келген  ДНҚ препаратын білдіреді.  Инфекциялық тест-жүйелер үшін кейде, мысалы, Р-глобинді гельді пайдаланылады, олардың ұштарына  гендік-инженерлік іс-әрекеттер көмегімен тест-жүйе  құрамына кіретін праймерлерге  гомологиялық қатынасы бар ДНҚ учаскілерін «жамайды».

ДНҚ-ның ішкі бақылауын жолағы мен ерекше жолақтың болмауы барлығындағы нәтижені бұрыс деп есептеу керек. Бұл жағдайда зерттеліп отырған үлгі үшін ДНҚ-ны қайта белгілеу ұсынылады.

Егер ішкі бақылауды реакциялық қосындыға енгізетін болсақ, ол инфекцияның ізделуші қоздырғышының ДНҚ-сы сияқты праймерлерді  күйдіру үшін сондай мишень болып қалыптасады. Ішкі бақылаудың амплификация өңімінің өлшемін ерекше ампликондардан 2 және одан да көп есе ажыратылсын деп арнайы таңдалып алынады. Реакциялық қосындыға зерттеліп отырған үлгімен бірге ішкі бақылаудың ДНҚ-сын енгізетін болсақ, нәтижесінде биологиялық үлгідегі микроағзалардың болуына қарамастан, ішкі бақылау микроағзаның  ерекше ДНҚ-сың болуы барысында ПТР-дің орын алуынан кейін алынған ерекше амплификондардан өлшемі бойынша өзгешеленетін амплификондардың  пайда болуының нәтижесі бола бастайды. Реакциялық қосындыда ішкі бақылау амплификондарының  болуы ингибиторлардың болмауы мен амплификация реакциясының қалыпты жүруіне куәлік етеді. Егер қажетті өлшемнің амплификондары пайда болмаса, бірақ сондай-ақ ішкі бақылаудың  амплификондары түзілмесе, тазаланбаған үлгіде қажетсіз құрамдық қосындылардың болуы салдары ретінде ПТР-дің жүруі барысындағы пайда болған қиындық туралы қорытынды жасауға болады, ол қажетсіз қосындылардан, не технологиялық қателіктерден арылу қажет. Қандай жағдайда болмасын, реакция нәтижесін дұрыс деп есептеуге болмайды.

Егер реакциялық қосындыда қажетті ДНҚ болса, онда оның амплификациясының әсерлілігін ішкі бақылаудың праймерлері үшін бәсекелестігі кесірінен біршама төмендейді. Бұл әсіресе, зерттеліп отырған үлгідегі ДНҚ-ның төмен құрамында білінеді және ол теріс-қате нәтижелерге алып келуі әбден мүмкін. Сондықтан да, ішкі бақылаудың құрамы ДНҚ-ның тіпті бірліктік ізделуіші молекулаларының амплификациясы  үшін бәсекелестік жағдай тудырмауы қажет. Бұл ретте ішік бақылауы жүзеге аспайтын, сәйкесінше, қайта құрылуға дайын үлгілер саны ДНҚ-ның алынған препараттарының сапасына сай үлгі дайындаудың қолданбалы әдісіне пропорционалды түрде өзгереді.

ПТР-дің «Nested» әдісі. Реакциялық сезімталдығын жоғарлату жолдарының бірі амплификацияның  «nested» (ұя) әдісінің қолданылуы. Оның мәні екі жұп – ішкі және сыртқы праймерлердің кейінгі қолданылуында. Алғашқы жұп праймерлерді қолданылған кейін амплификация өнімін праймерлердің ішкі жұбы бар басқа пробиркаға ауыстырылады. Кейде «nested» амплификациясы орнына реамплификация процесін қолданады. Бұл жағдайда амплификацияның қосалқы кезенің жүргізеді, онда праймерлердің бұрынғы жұбын ДНҚ-мишені ретінде-амплификация бірінші реакцияның өнімі ретінде қолданылады.

Амплификацияның жүзеге асуының осындай сызбасы өте күрделі, себебі ережеге сай амплификацияның бір реакциясының орнына екі реакцияның жүруі бұл процестің маңыздылығын арттырады және сыртқы праймерлер жұбы қолданылғаннан кейін реакция өнімдерімен ластану кепілді түрде мүлде болдырмайтын зертханалық  бөлімдерді жан-жақты жабдықтауды талап етеді. «Ұяшықтық» амплификацияға немесе қайта амплификацияға тек ерекше жағдайларда жүгінеді, себебі нәтижелерді басқа тәсілдері арқылы жетуге мүмкіндік береді.

Жартылай сандық талдау. ДНҚ-мишенінің санын тура бағалау үшін реакциялық қосындыда жартылай сандық ПТР-талдау деген жалпы атауымен әйгілі арнайы жолдарды қолданады. «Жартылай» деген сөздің қолданылуың принципиалды мағанасы дәлдігі болатындығын білдіреді.

Мұндай жағдайда  арнайы құралдармен қамтамасыздандырылуын танымал құрамы бар ерекше ДНҚ перпараттары бірлестігін жатқызуға болады.

ПТР талдауының жартылай сандық нәтижелерін алуға мүмкіндік беретін құралдық қамтамасыз етілуіне «iCycler IQ^tm» (БиоРад, АҚШ) және «СОВАS Амрlicor» (Roche, АҚШ) модельдерін жатқызады, олар амплификация өнімдерін жиналуының кинетикасын қадағалауға саласында әдімі шешім арқылы жетуге болады. Реакциялық қосындыға құрамына флуорофор және сөндіруші – ерекше реактивтермен белгіленген нуклеотидтері бар гибридизациялық зондтарын енгізеді. Флурофорлар сөндірушіден бос жағдайларда ғана энегргия бөлуге қабілетті. Күйдіру сатысында амплификондардың ішкі учаскілері бар зондтарды гибридизациялау жүзеге асады. Таq-полимеразаның элонгация процесінде  өзінің экзонуклеазды белсенділігінің есебімен зондтарды бұзады. Бұл ертіндіге белгіленген нуклеотидтердің түсіп кетуіне әкеледі, онда олар флуоресценцирлейді. Флуоресценцияның интенцивтілігі арнайы детектормен тіркеледі және амплификация өнімдерінің санына пропорционалды. Егер гибридизация процесі жүрмесе, зонд сол күйінде қалады, ал оның құрамына кіретін флуорофорлар сәулелейді.

Үлгілерді зерттеу барысында эксперименттің әр сериясы ДНҚ көшірмелерінің саны алдын-ала белгілі бақылау үлгілері бар амплификацияның жүруімен бірге келеді. Реакциялық қосындыларда амплификация өнімдерінің жиналуының кинетикасын салыстыру сынаушы және бақылау препараттарын жібіту диапазонында жартылау сандық бағалауға мүмкіндік береді.

Ерекше ДНҚ санын бағалаудың өте қарапайым, бірақ сенімсіздеу нұсқасы жібіту әдісі болып табылады.  Детекцияны ДНҚ-зондтары мен гибиридизациялаудан кейін жүргізеді немесе жұмыс атқарушы жібімелердің санын анықтай отырып, электрофорез әдісін қолданады.

Жартылай сандық талдау қаншалықты тартымды болса да,  оның орындалуы үшін тек тазарту жұмысының жоғары деңгей  ДНҚ препаратының  қолданылуы қабылданатындығын ескеріп кету қажет. Сондай-ақ, сыналушы және бақылау ДНҚ-ның амплификациясының әсерлілігіне әртүрлі ықпал жасайтын қосындылық құрамдардың болуын атап кету керек. ДНҚ-ны белгілеудің қарапайым әдістерін қолдану  барысында көпшілік  жағдайда клиникалық үлгілерде қоспалар құрамы мен санын алдын-ала болжауға мүмкіндік тумайды. Кейбір жағдайларда белгулеу сатысында ДНҚ-ның жоғалып кетуі ықтимал екендігі белгілі, бұл үлгідегі ДНҚ –ның шынайы санының мәнін біраз ауытқуына алып келуі мүмкін.

Сонымен қатар, нақты клиникалық үлгіде қоздырғыштар санын тура дәлме-дәл білу инфекциялық процесс туралы толық көріністі  ылғи да бере бермейді, мәселен, микроағзаның  әртүрлі жерде  шоғырлануы мен вируленттілігіне, сондай-ақ не ағзасының иммундық жүйесінің жағдайларына байланысты.

Сонымен, жартылай сандық талдаудың бар нұсқалары жаппай тәжірибелік  құндылықты көрсетпей отыр. Алайда, олардың пайдасы кейбір инфекциялық аурулар барысында терапия әсерлілігін бағалауда дауасыз болып отыр.

Ластану мәселелері. Политізбектік реакцияның тұтынушылық жоғары сезімталдығын ПТР-зертханаларын жан-жақты жабдықталуының қажеттілігін туғызады. Бұл әдістің өте үшкір – ластану мәселелерімен тығыз байланысты.

Ластану немесе контоминация – амплификация реакциясында мишень ретінде қызмет етуге қабілетті ДНҚ-ның ерекше және жанама молекулаларының сыртқы ортадан реакциялық қосындыға түсуі және қате-оң немесе  қате-теріс нәтижелерді беруі.

Мұндай мишендерге  — амплификация процесі сәтті орындалған пробиркалардан детекция сатысында үлгілерден түскен ерекше ДНҚ жатады.

Бұл жағымсыз құбылыспен күресудің бірнеше жолдары бар. Олардың бірі N-урацил-геликозилаза (УГ)  ферментін қолдану болып табылады. Бұл әдістің негізінде УГ-нің ДНҚ молекуласын енгізген урацилмен бөлшектеу қабілеті жатыр. Амплификация реакциясының  дНТФ молекуласын енгізілген урацилмен бөлшектеу қабілеті жатыр. Амплификация реакциясын дНТФ қоспасын  қолдану арқылы жүргізіледі, оның құрамындағы дТТФ  дУТФ-ке алмастырылған, және термоайналымнан кейін пробиркадағы барлық пайда болған амплификондар урацилді құрамын енгізеді. Егер амплификацияға дейін реакциялық қоспаға алмастырылған және термоайналымнан кейін урацилді құрамына енгіздіреді. Егер амплификацияға дейін реакциялық қоспаға УГ-ны қосса, онда реакциялық қоспаға түскен күйімен қолданылады да, ары қарай амплификация үшін мишень ретінде қызмет атқарады.

Амплификондарды әрекетсіздендірудің басқа бір жолы ДНҚ молекуласына фотохимиялық ықпал ету. Бұл үшін жоспармен немесе изопсорамен қолданылады, олар қысқа мерзімдік қосындылармен модифицирленген ДНҚ молекулалары амплификация реакциясына қатыса алмайды.

Дегенмен де, биологиялық немесе химиялық реакциялардың ешқайсысы 100%-дық әсерлілікпен жүрмейтіндігі белгілі болғандықтан, сәйкесінше, амплификацияланған үзінділердің миллартаған көшірмелерінен амплификация өнімдерінің әрекетсізденуінен кейін бірнешеуі болса да сол күйімен өзгермей қалады, бұл осы тәсілдің құндылығын біршама төмендетеді. Сонымен қатар, үлгі дайарлау процесінде үлгіден үлгіге қиылсықан-контоминация қауіпі әрдайым болады.

Сонымен, осы екі әдістің екеуі де қандай да бір деңгейде контаминация көзін  (ластану)  жоюға мүмкіндік береді және қате оі және қате теріс нәтижелерді алуға дәл кепілдеме бермейді.

Ластану нәтижелерімен күресудің үшінші жолы да бар, ол реакция  айналымдарының санын біршама азайту ретінде қарасытырылады (25-30 айналымға дейін). Бірақ тіпті мұндай тәсілмен қате-оң және қате-теріс нәтижелерді алу қауіпі үлкен.

Ластанудың болмауына сенімділік туғызу үшін сынақтың әрбір сериясын теріс бақылауды бірге алып жүру қажет. Теріс бақылау ретінде үлгі даярлау бөлмесіндегі суды қолдану ұсынылады (әрбір оныншы клиникалық үлгіден кейін биологиялық үлгі орнына суы бар пробирканы залалсыздандыру керек).

Барлық реактивтерді жеке порцияларға құйылған күйінде (аликвоттар) сақтау шарт.

Егер қабылданған шараларға қарамастан, ластанудың іздері анықталған күннің өзінде, реактивтердің барлық қолданылған порцияларвн жаңаларына ауыстыру міндетті, ал бөлменің заттарының үстін, құрал-жабдықтарды, пипеткаларды және басқаларын  0,1 МНСl-мен,  немесе құрамында хлоры бар препараттармен залалсыздандыру қажет, мәселен, эпидемалогияның орталық ғылыми – зерттеу институты мен ұсынылған ДП-2Т препараты.

Сонымен, қорта келе, қате-оң және қате-теріс нәтижелерінің пайда болуына себепкер ретінде қызымет ететін ДНҚ молекулаларының әрекетсіздендіруіне бағытталған алдын-ала амплификациялық іс-шаралардың пайдасына қарамастан ПТР-зертханаларының алдын-ала жан-жақты ойластырылған ұйымдастырылуымен түпкілікті құрал болып табылатындығы туаралы ой-тұжырымға келеміз.

ПТР-зертханаларының құралдары. ПТР-зертхана технологиялық опреациялар саны бойынша үш аймаққа бөлінуі тиіс:

Реакциялық қоспаны дайындау аймағы («таза» аймақ);

Үлгі дайарлау аймағы;

Детекция аймағы;

Барлық үш аймақ предбоксиниктермен жабдықталған жекешендірілген бөлмелер болуы тиіс. Ауаны сүзу жабдығы болған пайдалы.

Егер бірінші және екінші  аймақтарды болмай бара жатқанның өзінде біріктірвді қажет етсе (арнайы бокстың болса), онда детекция аймағы басқа екі аймақтан оқшаулана алысырақ орналасуы керек (басқа қабатта, басқа ғимаратта) және де басқа аймақтармен байланысты вентиляция жүйесі болуы тиіс. Бұл ПТР-зертханаларды ұйымдастыру барысында түпкілікті талаптардың бірі болып табылады.

Сонымен қатар, киіну және сыртқы киімді сақтау, тамақ ішу үшін арналған жеке бөлмелер, зертханалық материалдарды сақтауға арналған бөлмелерді алдын-ала қарастырған абзал.

Барлық өндірістік  бөлмелер  қысқа толқынды ультракүлгін лампалармен қамтамасыз етілуі тиіс.

Зертханаға түскен клиникалық материал үлгі даярлау бөлмесінде жедел залалсыздандыру қажет. Тап осы бөлмеге ДНҚ препараттарын құрамына енгіздіру үшін «Таза» аймақтан реакциялық қоспасы бар пробиркалар жеткізілуі тиіс. Осыдан кейін пробиркаларды амплификаторға салады және термоайналым біткеннен кейін, қақпақтарын ашпастан детекция аймағына көшіреді.

Барлық операцияларды (үлгі даярлау, реакциялық қоспаны дайярлау, электрофорез) әртүрлі адамдар орындауы шарт.

Клиникалық үлгілерді залалсыздандыру үшін инфекциялық материалмен жұмыс барысында маман иелердің қауіпсіздігі үшін ауаның вертикалды ағымын қамтамасыз ететін, сондай-ақ ламинарлы ағымсыз жұмыс мүмкіндігін және ультракүлгін жарығымен ішкі заттар үстін сәулелендірудің  ұзақ экспозициясын қарастыратын ламинарлы шкафтар құрылуы тиіс.

Реакциялық қоспаның дайындалуы күндізгі және ультракүлгін жарығы бар лампочкалармен, электірлі розеткалармен қамтамасыздандырылған ПТР-бокысында жүзеге асуы тиіс.

Биологиялық материалдардың әрекетсіздендірілуі автоклавта 1,5 атм. барысында 1 сағат ішінде жүргізіледі. Үстел автоклавтарының қолданылуы тиімді.

Оң бақылаулары немесе клиникалық үлгілері бар пробиркаларды залалсыздандырғанға дейін де, кейін де реакциялық қоспаны дайындау бөлмесіне («таза» аймаққа) алып келуге тыйым салынады.

Барлық өңдірістік бөлмелер қажетті құрал-жабдықпен және шағын материалдармен, оының ішінде сәйкес бөлмелерге тіркелген залаттармен қамтамасыз етілуі тиіс.

Праймерлерді таңдаудың негізгі принціптері. ПТР-тест-жүйесін құрастыру  бірқатар критерияларға жауап беретін праймерлердің  таңдалып жинақтау негізгі міндеттердің бірі  болып табылады:

1. Праймерлер ерекше болуы тиіс. Праймерлердің 3′-соңына Таq-полимераза ДНҚ-ның толықтырушы тізбегін құрастыруды бастайды. Егер олардың ерекшелігі жеткіліксіз болса, онда реакциялық қоспасы бар пробиркада қажетсіз процестер, нақтырақ айтқанда жанама ДНҚ-ның синтезі (қысқа немесе ұзын үзінділердің) жүретіндігі көзге айқын. Олар электрофорезде ауыр немесе жеңіл қосымша жолақтар түрінде көрінеді. Бұл реакцияның нәтижелерін бағалауға кедергі жасайды, себебі бөтен синтезделген ДНҚ-сы бар амплификацияның ерекше өнімін шатыстыру оңай. Праймерлердің бір бөлігі және дНТФ жанама ДНҚ-ның синтезіне шығындалады, бұл сезімталдығын біршама кетуіне алып келеді.
2. Праймерлер димерлер мен петляны құрамауы қажет, яғни праймерлердің өздерін немесе бір-бірімен күйдіру нәтижесінде тұрақты екі тізбек құрылуына жол бермеу қажет.
3. Праймерлердің күйдіру обылысы мутация аймағының сыртында, праймерлерді, ерекшелікті таңдау барысындағы критериялар ретінде алынған түрлік немесе басқа делеция немесе инсерция ішінде болуы қажет. Осындай аймаққа түскеннен кейін праймерлердің күйдірілуі жүзеге аспайды және оның салдары ретінде нәтижесі қате-теріс болады. Басқаша айтқанда, қандайда бір микроағза ерекше түрлік тест-жүйесін жасау көзделсе, берілген түрдің геномының нуклеотидті тізбектелуі ішінде осы талаптарды қанағаттандыратын нақты сол аймақ таңдалады. Және керсінше, осы тізбектелуде барлық жақын-туыс түрлердің ішінде көптеген маңызы бар айырмашылықтар болуы шарт.

ПТР-жинағын қалай таңдау қажет. ПТР әдісінің танымалдылығының өсуімен бірге тест-жинағына ұсыныс та сөзсіз өсуде, соның ішінде отандық өңдірісте де. Дайын емес тұтынушы үшін нарықта қандай да бір ұсынылған диагностикалық жинақты, оған қосалқы құжаттар мен өңдіруші – фирманың коммерциялық белсенділігінің  болуына қарамастан, затты түсіну қиынға соқтырады. Мұндай жағдайда тұтынушылардың өздеріне әртүрлі тест-жүйелерді сынап көруін және олардың сапасын салыстыруды ұсынуға болады.

Осындай тексерудің критериялары, бірінші кезекте тұрған тест-жинақтарының ерекшелігі мен сезімталдығы. Өкінішке орай, барлық тест-жинақтардың сипаттамалары бірдей емес.

Сезімталдықты белгіленген ДНҚ-ның бірнеше онеселік жібітілуін дайындау арқылы (мәселен, микроағзаның жиналған штамынан немесе клиникалық үлгіден, онда сенімді түрде ізделуші қоздырғыш болады, бұл зерттеудің альтернативті әдістерімен расталған) және амплификация нәтижелерін салыстыра отырып тексеруге болады. Егер бұл ретте бір жинақты қалдырып, екіншісіне сезімталдылығы бойынша жол беріп отырса, клиникалық үлгілерде оң нәтижелерді көбірек береді, оның ерекшелігі туралы ойлану мұнда қажет-ақ.

Әртүрлі тест-жүйелерінің қолданылуымен келетін амплификациядан кейін алынған оң нәтижелердің кейбіреулері немесе түгелімен сәйкес келмейтін жағдайлар да орын алып жатады. Өндіруші өз өнімін қорғай отырып, клиникалық белгілер тіпті болмаған жағдайдың өзінде, алынған оң нәтижелер тест-жүйенің жоғарғы сезімталдығы туралы тек айтатындығына сендіре алады.  Нәтижелердің басқа сезімталдырақ жинақпен сәйкес келмеуі барысында басқа емес нақты ізделуші микроағза анықталғандығына сенімді болу қажет.

Бір ғана клиникалық белгілердің болуы болжаған микроағзаның  болуына дәлелретінде қызымет ететіндігін есте сақтау қажет. Бірінші ретте қолданылған тетс-жүйелерінің сапасын реттеу үшін алынған нәтижелерді зерттеудің альтернативті әдістерімен  салыстыру ұсынылады.

Бұл жағдайдың басқа жағы да бар болуы мүмкін, яғни сезімталдылығы бойынша басымдылық алған тест-жүйесі жетерлііктей ерекше емес. Бұған жақын-туыс микроағзалардың панелін қолдана отырып реакцияны жүзеге асырып қана сенімділік алуға болады.

Кейбір жағдайларда жоғары сезімталдығы бар тест-жүйелерді қолдану барысында мутация болуы мүмкін ДНҚ ауданында праймерлерді таңдаудың салдары ретінде оң үлгілерді соңына дейін анықтамауы мүмкін. Кейде реакция үшін критикалық деңгейде праймерлерді күйдіру жерлеріндегі нуклеотидтерді алмастыру басымды болады. Өкінішке орай, ылғи пайдаланылатын тест-жинақтармен сынақтық мүмкіндігі барлығында емес ылғи емес жүреді. Бұл жағдайда, өндіруші ұсынылған тетс-жүйелер қалай құрылып, тексетілгендігі туралы анықтап алу жөн.

1 кезең: ДНҚ денатурациясы. ДНҚ-ң тізбектерін ажырату үшін екі тізбекті ДНҚ-ы 94-96ºС (немесе 98ºС-қа дейін, егер ыстыққа төзімді полимераза) 0,5-2 минутқа дейін қыздырады.  Бұл кезең денатурация деп аталады, өйткенi ДНҚ-ның екi шынжырларының арасындағы сутектi байланыстар үзіледі. Кейде бiрiншi айналым  (полимеразаны қосқанға дейiн) алдында матрицаның толық денатурациясы және праймерлер үшiн 2-5 минуттың аралығында  алдын ала реакциялық жылыту өткiзедi. Бұл реакцияның ерекше өнiмдерiнiң санын азайтуға мүмкiндiк бередi, мұндай қабылдау ыстық бастама (старт) деп аталады.

2 кезең: Праймерлердi қыздыру. ДНҚ матрицасымен праймерлердi байланыстыру. Шынжырлар ажыраған соң, парймерлер бiр шынжырлы матрицамен байланыса  алу үшiн, температураны біртіндеп түсіреді. Қыздырудың температурасы праймерлердi құрамына байланысты және әдетте 50-65ºС температура қажет. Ол кезеңнiң уақыты — 20-60 секундты құрайды. Қыздырудың температурасын дұрыс таңдамау (температураны тым көтерген жағдайда) матрицамен праймерлердi дұрыс емес байланысуға, немесе қате орында байланысуға және (температураны тым төмендеткен жағдайда) ерекше өнiмдердiң пайда болуына да алып келуі мүмкін. ДНҚ тізбегінің бөлігіне қарама-қарсы комплементарлы праймерлердің байланысы  жүреді.

3-ші  кезең: ДНҚ тізбектерінің бірігуі. ДНҚ тізбектерінің бірігуі  5′-соңынаң 3′-соңы тізбегіне қарсы бағытта праймердің қосылу бөлігінен басталады. ДНҚ-ның жаңа тізбегі үшін материал дезоксирибонуклеозидтрифосфаты ертіндіге қосылады. Синтез процессі  taq-полимера ферменті катализдеуімен 70-72ºС-та температурада  жүреді. Синтездiң ағу уақыты 20-40 секунд.  Бірінші амплификация айналымында құрылған жаңа ДНҚ тізбектері матрицамен бірге екінші айналымдағы амплификацияға қатысады,  ДНҚ-ампликон ерекше бөлiктiң бөлiмiнде болады. Келесі амплификация айналымдарындағы ампликондар матрицаның жаңа тізбектеріне қатысады. Қорыта келгенде, ампликондардын жиналуы 2n формуласы бойынша ертіндіде жүреді ал n амплификация циклдер саны. Егер бастапқы ерiтiндiде бір ғана екі тізбекті  ДНҚ молекуласы  табылса, онда 30-40 айналымнан кейін ертіндіде 108 ампликон молекуласына дейін жинақталады.

Политізбекті реакцияның жүру принціпі. Праймерлер — 15-30 нуклеотидттен тұратын синтетикалық олигонуклеотиттер, матрицалық ДНҚ-ың комплементарлы бөліктерін теңеструші. Праймерлер синтезі — едәуір қйындау процесс.  Тiзбектi таңдап алуы қазіргі кезде тиiстi бағдарламалардың қолдануымен автоматты түрде қамтамасыз етiледi. ДНҚ амплификацияның деңгейi праймерлердi дұрыс таңдап алуна байланысты. Айқын генетикалық құрылымда әсiресе маңыздысы праймерлердiң 3′-шеткi нуклеотидтарын комплементарлы болуы, өйткенi осы мәлiметтiң жоқтығы 3′-шеткi жаңа нуклеотидтарға қосудың тиiмдiлiгiн (ондаған есе) қатты төмендетуге алып келедi. Праймерлердi құрастыру секвенирования әдiсі ДНҚ нуклеотид тiзбектерiн анықтаудан кейiн зерттелеіп жүргiзiледi. Политізбектік реакцияға ең қолайлы таңдап алыңған праймерлермен бірге әр түрлі компьютерлік бағдарламалар қолданылады, мысалы OLIGO. Белгiлi ДНҚ-ң нуклеотид тiзбектерiндегі ұқсастықты талдауы үшiн сыналып отырған ДНҚ  Gen Bank және EMBL халықаралық компьютер банктерi мәлiметтердi пайдаланады, талдау  DNASUN немесе DNASIS орнататын бағдарламасы арқылы анықталынады.  Дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) қоспасы — дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат(дГТФ), дезоксицитидиктрифосфат(дЦТФ), дезокситимидинтрифосфат (дТТФ), — «құрылыс маериалы»,  Taq-полимеразамен екінші тізбекті ДНҚ синтезі үшін қолданылады.  Бөлме температурасында дНТФ оңай ыдырататынын естен шыгармау керек, сондықтан оның  ерiтiндiлерiн  10—20 мкл құйып және (20°С — 70°С) мұздатылған күйде сақтайды. Жұмыс үшiн иондамалған (2 мкл әр қайссынан) сумен 100 рет ажыратылып қойылған жiбiтiлгенін (жұмыс үлгiлерi) сынақта қолданады.

Taq-ДНК-полимераза (ыстыққа төзімді фермент). Thermus Aquaticus балдырынан бөлініп алынған,   ыстық бұлақтарда өседі және ДНҚ-полимераза белсенділікке ие. Бiрнеше жыл бұрын Thermus Thermophilis бактериясынан   Tth-ДНК-полимераны бөліп алудың сәті түсті, сонымен қатар ДНҚ  репарацияны және репликацияны қамтамасыз етедi және  керітранскриптаза белсенділікке ие, РНҚ-дан комплементарлы ДНҚ-ы алуға мүмкiндiк береді.  Полимеразаның көмегімен праймердің ұзындығын ұзарту матрицаның 5-соңына жеткенге дейін жүрмейді. Амплификацияның процессi Taq-ДНК-полимеразаны қолдануда тиiмдiрек өтетiнiн тәжірибе жүзінде дәлелдеген.

1.Магний ионы(Mg2 + )- фермент Taq-ДНК-полимераза катализаторы. 

2. Тандалатын үлгі — қайтара бірнеше рет нысанның көшірмесін алуға дайындалған реакциялық қоспа препарат (мысалы, ДНҚ микроорганизімдері).
3. ДНҚ-нысанының жоқтығынан амплификация кезінде ерекше өңім құрастырылмайды.
4. Оң бақылау — биологиялық жүйеден ДНҚ үлгісін бөліп алуға мүмкіндік береді.

Политізбекті реакцияны жүргізу үшін амплификатор

Политізбектік реакцияны амплификаторде жүргізеді — 0,1 °C дәлдікпен әдетте периотты түрде приборларды салқындатып және жылытуын қамтамасыз етеді.

Репликация -ДНҚ-ң екi еселену процессi.

Репликацияның кезеңдерi: инициация, элонгация, терминация.

Репликацияның бiрлiгi — репликон.

Репликацияның шарты:

1. Матрица
2. Ферменттер
3. Еркін нуклеотид
4. Mg 2 +, K+, Ca2 +, Cl ион — және басқалар.
5. АТФ көзі.
6. Оңтайлы температура.
7. SSB-ақуыздар — бiр шынжырлы күйде ДНҚ-ы тұрақтандырады.

 

Репликация  принцптері:

1.Матрицалылық — аналық молекуланың тізбегі жаңа тізбегі синтезі үшiн матрица болып табылады.

2.Комплементарлылық — синтезделетін тізбек комплементарлы принціппен матрицалық тізбекке жинақталады.

3.Антипараллельдік — жаңа шынжырды синтездiң бағыты — 5’-3’. Матрицалық тізбек (3’-5’) қарама-қарсы бағыты болады.

Репликация механизімі- жартылай консервативті

Дезоксинуклеозидтрифосфатты қосу комплементарлы принціп бойынша  3’- соңынан өсуші тізбекке қарай жүреді.

Озып келе жатқан тізбек Оказаки ферментімен үздіксіз синтездейді.

Репликацияны жүргізетін ферменттер

1. Геликаза ферменті — сутектi байланыстарды үзiлуін қос спиральдың тарқатуын қамтамасыз етедi.
2. Топоизомераза ферменті — репликативті шанышқының алдында суперспирализациюларды ажыратады.
3. Праймаза ферменті(РНК-полимераза) — РНК шүріпін синтездейді.
4. ДНҚ-полимераза ферменті. [18, 23, 25, 26, 29]

 

2.3Полтитізбектік реакция тізбектері

 

Политізбекті реакция — бұл денатурация кезеңдерінің циклдық қайталануы (ДНҚ матрицасының жекелеген жіп бөлікерінің синтезі), праймерлердің ДНҚ матрицасымен байланысуы (гибридизациясы, немесе күйдірілуі)  және праймерлердің ДНҚ-полимеразамен ұзаруы (жаңа екі фрагментті ДНҚ синтезі). ДНҚ-ның бізге белгілі бір бөлігін аламыз, яғни біз амплификация жасайтын (суретте көрсетілген бұл бөлік нүктелермен белгіленген және без негізді).

Екі праймер жасаймыз AATAA және GCCCG, зерттелетін ДНҚ бөлігін комплементарлы тізбекті 5′-соңы яғни ДНҚ синтезі ылғи 5’→3′ қарай жүреді,  5 және 3 сандары нуклеотидтегі көміртек атомдарының саны. Денатурация үшiн ДНҚ матрицасын шамамен 90°С-ге дейiн 1-2 минут iшiнде қыздырамыз. Праймерлер реакцияға басынан бастап қатысқанымен олар сутекті байланыстарды  90°С-де құрастырмайды. Сондықтан праймерлердің гибридизация процессі комплементерлы тізбектермен келу үшін температураны 50°С-60°С-ге дейін төмендету керек. Неғұрлым праймер ұзын болса, әсіресе ерекше қосылу болады (әдетте бұл 15-20 негіздер).

 Содан соң температураны 70°С-ге дейiн және оны осы деңгей де 1-2 минут аралығында ұстап тұру қажет, праймерлерден бастап ДНҚ-полимераза жаңа тізбекті ДНҚ-ның тізбектерін ұзартуға мүмкіндік береді. Әдеттегiдей, ДНҚ синтезі екi жаңа жіп үшiн  5′-тан 3′-қа бағытына қарай ағады:

 Сонында біз екі бөлікті екі жіпшелі ДНҚ молекуласын аламыз. Алынған екі жіпте ДНҚ-полимеразамен құралған, қанша дегенмен  синтез басталған жерде бір жіпшесі кем болады. Бірақ екі ДНҚ молекуласы да екі жіпшелі зерттелетін фрагмент:

 

 

Цикл-1

Егер циклды қыздырып және суытып реакциялық қоспада қайталайтын болсақ, енді бізде  екі жіпшелі зерттелетін фрагментімен қоса төрт жіпшелі фрагмент аламыз (суретте барлық матрицалар 5′ → 3′ бағытында салынған).

Цикл -2

Суретте көрсетілгендей екі молекулалы біреуінде бір жіп тек зерттелетін тізбектің фрагменті. Сондықтан ПТР-ң  үшінші циклында тізбектің схемаға көрсетуге келмейтін бірінші екі фрагменті екі жіпшелі ДНҚ, сондықтан зерттелетін тізбекке тура сәйкес келеді. Циклды қайта-қайта қайталағнан кезде ДНҚ фрагменттерінің саны геометриялық прогрессияда өседі. Әдеттегiдей, ДНҚ санның жеткілікті мөлшерде алғанша 20-дан 50-ге дейін цикл керек. [38]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.4 ПТР-ді тәжірибелік денсаулық сақтауда қолдану

 

ПТР әдісін микробиология және эпидемиология саласында инфекциялық ауруларды, батериялық, вирусытық аурулардың диагностикасы үішін қолдану  көптеген мәселелерді шешеді. Сонымен бiрге бұл әдiстiң қолдануы созылмалы және аз зерттелген инфекция ауруларын зерттеу төңiрегiдегi iргелi зерттеулерiнiң дамуына мүмкiндiк туғызады. Дегенмен тек қана ПТР әдiсі микробиологиялық диагностикада қолданылатын дәстүрлi әдiстердiң спектрiн толықтыратынын атап өту керек.

Кесте-1.Клиникалық тәжiрибедегi ПТР-ді қолдану.

 

 

ПТР-зерттеуді  өткiзуге көрсетулер	Зерттеу материалы	Қоздырушы	Ескерту
Цервицит, эндометрит	Цервикалдық қырын, жатырдың қуысынан аспираты	Сhlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealiticum, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans Қарапайым ұшықтың вирусы I, II түрлер	Тетрациклиндi қатардың антибиотиктерiне және макролидтарға микрофлораның төзімді (Parvo және T960) U.urealiticum-нiң типтеуiн өткiзу, анықтау.
Сальпингит, периаппендицит	Цервикалдық қырын, лапароскопияның жанында алған биоптаталар
Бактериялық вагиноз, вагинит, вульвовагинитi қыз балаларда	Қынаптан эпители қырыны
Уретрит, простатит	Сулай уретрадан қырыны, қуық ауруының шырыны
Эпидидимит	Сперма
Проктит	Тік iшек қырыны
Бедеулiк, жүктiлiктi төзе алмауы, эктопиялық жүктiлiк	Цервикалдық қырын
Рейтердiң синдромы	Уретра және қасаң қабықтан эпители қырыны
Гениталийды герпетиялық ұтылулар, шырышты қабықтар, түкшелер тағы басқалар.	Зақымдалған жерден эпители қырыны, қан	Қарапайым ұшық вирусы I, II, VI түрлер, Эпштейн-Барра вирусы, Варицелла Зостер вирусы.
Кандиломатоз	Жараланған жерден эпители қырыны	Папилломовирус (HPV)	Вирустың (6, 11, 16, 18) онкоген түрлерiнiң теңестiруi болуы мүмкiн
Туған балалардыі тыныс жүйесiнiң жоғарғы бөлiмдерiнiң қайталанатын созылмалы аурулары пневмониясы	Жұтқыншақтың артқы қабырғасынан эпители қырыны, қолқа таңдай лаваж, қақырық	Сhlamydia trachomatis, Сhlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycobacterium tuberculosis
Конъюнктивит (соның iшiнде жаңа туған балалардың)	Қасаң қабықтан эпители қырыны	Сhlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Қарапайым ұшық вирусы
Цитомегаловирус инфекциясы(соның iшiнде құрсақ iшiндегi және жаңа туылған балалардың ішінде)	Кровь, моча, слюна, амниотическая жидкость, биоптаты	Цитомегаловирус (CMV)
Өкпе туберкулезi	Қақырық, қолқа таңдай лаваж	Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis	Антибиотиктерге микобактериялардың орнықтылығының анықтауы болуы мүмкiн
Зәр нәпсi тағы басқалар органдардың туберкулезi	Сулай, таңдандырылған бөлiмшеден қырын
Асқазанның жарасы, гастрит, дуоденит	Биоптата шырышты	Helicobacter pylori
Вирустық гепатитi	Бауырдың  биоптаталары, қан	В, С, D, G гепатит вирусы	HBV, HCV генотиптеу болуы мүмкiн
Қанның бақылауы және олардың iшiнен трансфузиология және трансплантологиядағы препараттары	Қан	В, С, D, G гепатит вирусы, ВИЧ, ұшық, ЦМВ

 

Микроорганизмдерді табу үшiн ПТР-ды қолдану өте ұтымды және тиiмдi әсіресе, лабораториялық жағдайда қиын таралатын бактериялардың ұқсамайтың формалары табуда өте қажет. Сонымен бiрге оған клетка iшiндегi арамтамақтар және қожайынның организімінде айлап-жылдап өмір сүруге қабiлеттi микроорганизмдер де жатады. Кестеде ПТР әдiсiнiң негiзгi әр түрлi ауруларда қолдану үшін келтiрiлген.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ІV Зерттеу нәтижелері

4.1 Медициналық тәжірибеде ПТР әдісің қолданылуының проблемалары

 

Бүгінгі таңда қоздырғыштардың түрін дер кезінде және сенімді анықтау В және С вирусты гепатитредің урогенитальды инфекциялар туғызатын аурудың өсуімен күресу бойынша терапевтикалық және эпидемиалогиялық шаралардың күрделі тізбегінде бастапқы және өте маңызды процесс екендігін дәлелдеуді қажет етпейді. Егер де бұл проблеманың маңызды клиникалық аспектісі – осы инфекциялардың ылғи симптомдарсыз өтетіндігі, ал олардың клиникалық белгілері өзіне тән еместігі туралы факт болып табылатындығын ескерсек, онда қоздырғыштарды айқындаудың жоғарғы сезімтал және жоғарғы дәлме –дәл арнайы әдістерді іздеуге деген ерекше қызығушылық артатындығы белгілі.

Политізбекті реакцияның пайда болуы клиникалық зертханалық диагностиканың мүмкіншіліктерін біршама кеңейтті. Сондықтан да ПТР-ды ұзақ және қиын жолмен анықтауды қажет етпейтін қоздырғыштарды ағзада табу үшін кең қолданылады, ал диагностиканың имунохимиялық немесе микраскопиялық әдістері сенімсіз. Оларға ағзаның жүйелік, сондай-ақ жергілікті зақымдануына алып келетін хламидияларды, мико-уреаплазмалар, цитомегаловирусты, сондай-ақ В және С гепатиттерінің вирустарын жатқызуға болады.

ПТР-дің басты қасиеті – өте жоғары сезімталдылық, Л.В.Лопуховтың (2000 ж.) алған мәлеметтері бойынша зәрді, прифериялық қанды зерттеу барысында ПТР көмегімен 1 мм-да екі элементарлы денені, синовиалды сұйықтықта – 200 элементарлы денені 1 мл-да анықтауға болатынына көз жеткізуге болады. Дегенмен, ПТР-дың жоғарғы диагностикалық сезімталдығының басқа қыры бар – ол ПТР әдісін қолдану барысында, алынған оң нәтижелер, ал аурудың клиникалық белгілерінің көрінбеуі кезінде басқа да зертханалық зерттеулердің теріс нәтижелері жиі бірге жүруі гипердиагностиканың мүмкіншілігін болжауға негіз болады. Басқа қырынан алып қарайтын болсақ, дәстүрлі зерттеуде оң нәтижелер көрсетуі және ПТР барысында теріс нәтижені беруі түсініксіз, сондай-ақаурудың асқынуына қарамастан ПТР-дің басқа да қосымша кешенді клинико-зертханалық зертханалық зерттеуді қажет етеді.

Біздің ойымызша, ПТР-дің диагностикалық зертханалардың жұмыс тәжірибесіне кең түрде енгізілуі дұрыс, бірақ басқа жағынан алып қарасақ әдістің атауына қатысты біраз кері әсерін өзімен бірге әкелді. Олардың бастысы – биологиялық заттың үлгісінің сапасы, затты тасымалдау кезеңінде бұзылуы, өмір сүретін патогендердің жеткіліксіз саны, биологиялық затта ПТР ингибиторлардың бар болуы, ДНҚ анықтау әдістемесінің жеткіліксіздігі, жұмысшылардың біліктілігі және зертханалардың ПТР жұмыстарын ұйымдастырылуы, нәтижелерді есепке алу барысында субективті бағаның элементтің болуы, емдеуші дәрігер мен зертхананы-дәрігердің арасында диалогтың болмауы, терапияны жүргізудің тиімділігінің бағасы үшін ПТР зерттеулерді жүргізудің  мерзімдерінің дұрыс емес қойылуы. Осы жұмыста осы себептер жан-жақты талқыланады.

Биологиялық затты алу кезеңі-преаналитикалық кезең – ПТР-дыі мүмкіншіліктеріне шек қоятын, диагностикалық әдістердің «әлсіз қыры» болып табылады. Биологиялық затты алуда сапасыздық зерттеудің теріс нәтижелеріне әкеледі, ол өз тарапынан аурудың клиникалық көрінісімен сәйкес келмейді. Тек екінші реттік заттың зерттелуі дәрігердің бұл жағдайды түсінуіне көмегін тигізеді. Сондықтан-да, ПТР зерттеу үшін затты алу барысында осы әдістің жоғарғы сезімталдылығына сеніп дәлдігене көңіл бөлу қажет емес.

Затты алу үшін үстіңгі бөліктің ауданы мен жерінің максималды ұлғайтылуына зер салу керек. Мәселен, қынап мойнының уретрасы, түтікшесі және үстінгі бөлігі. Бұл ретте, әр қоздырғыштың шоғырлану жерлерін де ескеру қажет. Мәселен, хламидиялар плазматикалық эпителияларды қоршап алса, мико-ураплазмалар, трихомонадтар, гарднереллалар, қыныптың шырышты қабғына жабысады. Сондықтан да эктодермалды көрінісі бар және жазық эпителиялардан тұратын қынаптың шырышты қабығынан алынған үлгі цервикальды түтікшеден алынған эпителиалды клетканың үлгісімен салыстырғанда хламидияларды анықтауда ақпарттылығы төмен болады.

Барлық жағдайда эпителиалды клетканың үлгісін алу барысында олардың саны зерттеудің соңғы нәтижесін беретіндігін еске сақтау маңызды. Бірінші және екінші анализ арасындағы мерзімнің қысқартылуы Chlamydia trachomatis инфекциясы ПТР зерттеу жүргізу үшін цервикальды түтікшеде эпителиалды жасушалардың санының жоюлуына алып келеді, яғни қате нәтиже көрсетеді.

Құралдардың көпреттік және бірреттік қолданылуы, біздің ойымызша, шексіз себебі дәрігерлік құралдың екі типінде де қолданысы барысында егер бұл процедураның дұрыс орындалуына қарай әрине, материалды сәйкесінше алуға қол жеткізуге болады. Тек зат алмасу реакциясын қоздыратын, қан, шырыш т.с.с. заттардың пробиркада болмауын қамтамасыз ету қажет. Сонымен қатар эпителиалды жасушалардың үлгісін алу кезіңде алынған заттың мөлшері зертеудің соңғы нәтижесін көп жағдайда анықтайды. Сондықтан да биологиялық материалды алудың сапасын жан-жақты бақылау-бұл минутына 12-15 мың айналым барысында 15 минуттай аралығында ДНҚ-ның бөлінуі кезеңінде лизирленген ертіндіні қосу алдындағы центрифугалау болып табылады.

Екінші маңызды сұрақ, ол жағымсыз температурада биологиялық материялдың сақталуы мен тасмалдануы. Алынған мәлеметтер бойынша биологиялық материалда урогенитальды хламидиозды анықтау барысында, температуралық режимі бұзылғандықтан, ПТР дәстүрлі әдістің оң нәтижесін көрсете тұрып, 17,4% жағдайда кері жауап береді және осы емделушілердің қан сарысуына диагностикалық маңызды титірінде G классына жататын иммуноглобулиндер болады.

Жасушалар, вирустар, нейтралды және әлсіз қышқылды рН барысындағы бактериялар ДНҚ матрицасы ПТР үшін ұзақ уақыт аралығында қажет болады, ал вирустар мен бактериялардың жасушаларының РНҚ-матрицасы тұрақты емес. рН-тың қышқыл белгілерді беруі барысында өте белсенді эндогенді және эгзогенді РНК-азалар арқылы тез гидролизденеді, сондықтан ОТ-ПТР әдісі арқылы алынған анализ үшін қажетті материал тез арада зерттелуі керек немесе РНҚ-аза ингибиторлардың болуымен — 70ºС температурада  сақталуы шарт.

Реакциялардың оптималды параметірлері қалыптасу барысында ПТР анализдің сезімталдылығы ДНҚ/РНҚ көзінің үзіндісін ала жүретін зерттелетін биологиялық материалды дайындау процедурасына байланысты. Осының арқасында зерттелетін ДНҚ/РНҚ – матрицасының аз мөлшерде тек концентратталуы ғана емес, сонымен қатар ПТР ингибиторларының жойылуы жүзеге асады. Ингибиторлардың нақты белгілері биологиялық матрицалардың тән. Жалпы қан үлгілерін зерттеу барысында ПТР ингибиторлар детергенттер, лактоферин және гемоглобин көмегімен жүзеге асады, бірақ мұнда құрамында иондар немесе төмен молекулалы қосындылары бар қан сұйықтығы үлкен ықпалын тигізеді. ПТР биотоптарында құрамында сынабы бар қосындылар, формалин және рибонуклеат ванадиядан тұратын  консерванттар болады, қақырықта-гемоглобин және қақырықтық заттар болады, зәрде мочевина, уретра және цервикальды түтікшенің эпителиалды жасушаларынан алынған үлгіде – гемоглобин, егер қан сұйықтығы табылса шырыш болады.

Зертеліп отқан затқа қарамастан, клиникалық материалдың лизисінің тиімділігі мен ДНҚ/РНҚ үзіндісімен, ДНҚ/РНҚ – матрицасының деградациясымен немесе ДНҚ-полимеразасының белсеңділігімен байланысты кезеңдерде ПТР сезімталдылығының төмендеу процесі жүреді. ПТР-дің төменгі сезімталдылығы ДНҚ-ақуыздарының күрделі кешенінің пайда болуымен анықталады.

ПТР-дің төмен тиімділігінің себебі ретінде деградация негізінде немесе ДНҚ/РНҚ үзіндісінің негізінде, реакциялардың қосылуы жүреді. ДНҚ/РНҚ биодеградация маңыздылығы клиникалық үлгілерде жиі термотұрақты рестриктазалармен байланысты, олар ПТР-дің термиялық циклі процессінде өзінің белсенділігін көрсетпейді қан плазмасы мен оның сарысуын зерттеу барысында ДНҚ-мишенінің нақты бөлігі G иммуноглобулиндермен ерекше байланысқа түсе отырып, реакциядан босатылады. Қанда ДНҚ үзіндісімен әрекетке түседі, ол М²+ иондарымен жылдамдатылады, қайнатылуымен немесе  рН-тың өзгеруімен, спиртке салынуымен, фенолды хлорофромды сұйықтықпен оған кедергі туғызылмайды, мұның негізі – ДНҚ және гепарин молекулалары сияқты жоғарғы деңгейі болып табылады.

ПТР-дің құрамын толықтыратын ингибиторлар үшін сезімталдарының бірі – ДНҚ-полимераза, оның белсенділігі табиғатына қарай өзгеріп отыратын көптеген факторларға байланысты. Ағуыздың денатурациясы үшін қолданылатын литиялық ферменттер мен заттардың іздері сияқты, сондай-ақ иондар да маңызды рол атқарады, мәселен Nа+ және К+. Ал FeCl2 концентрациясы реакциялық реакциялық қосындысының құрамында 2 меМ-нан жоғары болғанда, кейбір полимеразаның  белсенділігін 10%-ға төмендететіндігі көрсетілген. Ион негіздері ингибирлеудің механизімі ДНҚ-полимеразаның деңгейінде Са²+-тің Мg²+ иондарымен бәсекелестігі болып табылады. ДНҚ-полимераза құрылымының бұзылуына мочевина, гемин, фенолдар ықпалын тигізеді. Олар полимеразаны не онымен байланысқа түсе отырып, не белсенділігін жоя отырып кеңістік құрылымын бұзады. Контаминантты ферменттердің белсенділігін төмендету үшін қосындыға сиыр сарысуының альбуминін енгізуді қажет етпейтін, лизистен кейін протеиназа-ң қанағаттандырарлықсыз алынып тасталуы салдары әсерін тигізеді. [12]

Биологиялық үлгілерден ДНҚ және РНҚ-ны тазарту және бөліп көрсету әдістері ингибиторларды жоюға әрдайым мүмкіндік бермейді, сондықтан да ПТР ингибиторларды жою үшін ДНҚ/РНҚ бөліп көрсету кезеңі алдында биологиялық материалды алдын-ала дайындау қажет: мысалы, пробаларды мұздату-қайта еріту, зерттеу жұмысының мерзімдік жүргізілуі, концентрациялар градиентінде центрафигуралау, биологиялық материалды алу, ДНҚ экстракциясының қолданылуы, зерттелетін заттың байытылуы, оның алдын-ала сүзілуі, тазартылуы.

Амплификация және қоздырғыштары болса да арнайы ампликондардың қосылмауына алып келмейтін полимераза ингибиторларының болуына реакциялардың тиімділігін бақылау үшін ДНҚ-ның кез-келген стандартын көрсететін «ішкі бақылау» көмегімен амплификациялардың жүруін бақылау қажет. Егер реакция процесі барысында жағымды бақылау мен ішкі бақылау ампликондары пайда болмаса, талданып отырған үлгіде қажет емес қосындылардың бар болуы туралы қорытындыны жасауға болады, бірақ ДНҚ көрсеткіштері жоқ деген қортынды жасауға болмайды. Осындай жолмен талдау жасау қызықты болғанымен, оының өзіндік кері әсері бар: егер реакциялық қосындыда қажетті ДНҚ бар болса, оның амплификациясының тиімділігі праймерлер үшін ішкі бақылаумен бәсекелестік кесірінен төмендейді. Бұл зерттеліп отырған биологиялық үлгіде ДНҚ-ң төмен концентрациясы барысында ерекше маңызды, ал мұндай көрсеткіш өз кезегінде қате нәтижелерге алып келеді.

ДНҚ-ны бөліп көрсету жолы нақты қоздырушының түрі, сондай-ақ клиникалық үлгінің түріне байланысты. Уретра мен цервикальды түтікшеден алынған  эпителиалды жасушалар үлгілерімен жұмыс істеу кезінде  ДНҚ-ны бөліп көрсету сызбасы келесі кезеңдерден тұруы қажет: құрамында гуанидин ертіндісі бар лизирленген затты енгізу; сорбентте ДНҚ-ң сорбцциясы (сіңіуі); көпреттік жуылып-шайылуды; ДНҚ-ң резорбциясы (шығуы). Жасушалық массасына және қанның сарысуына (оновирустар, парентеральды гепатиттер) ПТР зерттеу жүргізу барысында фенол) хлорофорымның депротеинизациялау қажет, соңынан ДНҚ/РНҚ этанол немесе изопротанольды енгізіп отыру қажет.

Қате нәтижені болдырмау үшін таза қолғаптардың, бірреттік пробиркалардың  және автоматтандырылған пипеткалар ұштауыштарының қолданылуы, сондай-ақ бөлменің, үстелдердің жұмыс істейтін үстінгі беттері және пробиркаларды алдын-ала ультракүлгін тазарту жұмыстарының жүргізілуі қажет.

ДНҚ-ның амплификация үшін пробиркаға салынған жалпы саны 1 мкг-нан аспауы керек, егер асып кеткен жағдайда ДНҚ-материалының амплификациясының ерекшелігін және сезімталдылығын төмендетеді. ДНҚ санының асып кетуі бернеше үлгілерді 0,01; 0,001; 0,0001 ретпен жүргізуді талап етеді.

ПТР-ді жүргізу барысында заттың тура емесе амплификациясы есебінен қате – оң реакциялар жүруіне мүмкіндік береді, ол нәтижелерді алуға қиындық туғызады. Соңы 2 жылы ПТР-дің максималды ерекшелігі және сезімталдылығын көрсететін қарапайым әдіс қолданылуыда, «ПТР-дің ыстық бастамасы» деп аталатын бұл әдіс 3-5 минут 95ºС температурада ПТР-амплификациясының қосындымен пробиркалардың  алдын-ала қыздырылуымен басталады. Мұндай әдіс праймерлердің өзара өажетті емес төменгі температурада әрекеттесуін тудыратын ДНҚ-үзінділерінің амплификациясының алдын алады.

Қате-оң нәтижелердің жиі себептеріне айналған амплификондар тұратын контаминация туралы айтпауға болмайды, себебі жұмыс барысында амплификондар көп мөлшерде жиналып, приборлар мен ауа арқылы өте оңай тарайды. Мұнда концентарция қайнар көзін анықтау қиын болады және уақыт пен қаражаттың көп жұмсалуын қажет етеді, сондықтан да алынып отырған әрбір нәтиженің сапасын зертхана ішінде бақылап отыру қажет: зертханалық өзіндік бақылауды қолдану және шифрленген оң және теріс бақылау үлгілерн мерзімдік  қолдану, сондай-ақ приборлардағы жазылған ақпараттарды мұқият тексеріп отыру қажет, т.с.с.

Қоқыстың әрдайым жиналуынан құтылу үшін және қате-оі нәтиженің алынуын алдын-алу үшін ферментативті немесе фотохимиялық тазарту жұмыстарын атқару қажет. Мысалы, «Амплисенс» атты жиынтықта ферментативті тазарту жұмысы қолданылған, яғни әрбір жаңа цикл алдында урацил –N- гликозилазаны (УДГ) ДНҚ-ның поли-У құрамын күйдіру мақсатымен қосып отырған. 95º С-ға дейін жылыту процесі болмағанда У-дің күйдірілуі гелдегі амплификондардың қосғалысына әсерін тигізбейді, бірақ жаңа ПТР қосындыға түскенде бірінші кезеңде олардың деградациясы жүзеге асады.

ПТР барысында синтезделген заттар реакциялық қосындыда жиналады, салыстырмалы талдау жасауда бұл өзінің септігін тигізеді. Ол үшін алынған амплификациондық заттар гель құрамында электрофорез көмегімен ұзындық бойымен бөлшектенеді. Көбінесе  электрофореграммда этидиум бромидтің флюоресцентті бояғышы көмегімен жолақтар кқрінеді (бір өлшемді ДНҚ үзінділерінің шоғырлану аймақтары), және де одан кейін Ултракүлгін-жарығында көрінеді.

ДНҚ-ның ерекшелігі гель жолында нақты орналасуымен сипатталатын полиморфты үзінділер арасынан электрофореграммдағы жолақтар) жеке комбинация түрінде жүзеге асады. Бұл ДНҚ-ның амплификациондық қыры деп аталатын қоздырғыштың геномды сипаты болып табылады. ДНҚ-ның амплификондық қырларын айқындау мақсатында немесе олардағы ұқсастық және айырмаылық белгілерін көрсету мақсатымен олардың тізбектік салыстырылуын жүргізеді.

Электрофореграмма талдауы барысында екі аспектіні бөліп көрсетуге болады: а) ұқсас немес ұқсас емес жолақтардың салыстырмалы гель  жолындағы орналасуы;

б) сәкес келетін немесе сәйкес келмейтін үзінділердің орын алуы. Объектілер арасынан таңдалып алынған ДНҚ препараттарын талдау барысында алынған амплификациондық қырлардың бірдейлігі немесе әртүрлілігі туралы сұрақ субъективті болып табылады. Яғни, ДНҚ немсе РНҚ-ң геномды қырларының ұқсас немсе ұқсас еместігі туралы мәселе бұрыс шешімнің қауіпін өзінде сақтайды. Бір геномды қырдың екіншісіне  ұқсас болуына келетін болсақ, онда мұнда қате нәтиже ДНҚ-ң салыстырмалы препараттарында бөтен генетикалық материалдың (көбінесе кездейсоқ ластануы нәтижесенде) болуымен түсіндіріледі, ал бұл өз кезегінде геномды қырлардың сәйкестігін, сондай-ақ сәйкессіздігін де туғызуы мүмкін. Соңғы кезеннің бағалауының қолданылған сапалы параметірлері: нәтижлердің көрінуі және электрофорез – аз ақпарат береді, зерттеу жұмыстарынан алынған нәтижелердің оқылуында субъективтілікті анықтайды, жеткілікті емес дұрыс нәтижелерге қол жеткізуге болады деген түсінік туғызады, сондықтан да жоғары әдістемелік біліктілігі бар дәрігер-зертханашыны талап етеді. Талдаудың қосалқы әдістерінің қолданылуы алынған нәтижелердің жартылай автоматты ақылуына мүмкіндік береді және электрореграмманы субъективті бағалау проблемасы болдырмайды. Гель-электрофореграммада амплификондардың сапалы анықталуы үшін кішкентай видеокамераның қолданылуын ұтымдырақ,  оның көмегімен  зерттеліп отырған инфекциялық агенттің ДНҚ-амплификондары мен ДНҚ-стандарттық жолақтардың бір-біріне байланысын бір уақытта алу үшін де арнайы рестриктазалы ферменттермен күйдіру жолы немесе арнайы радиоактивті немесе флуорсцентті олигонуклеотидті зонды бар гибридизация әдісін қолданғанда зондты бар гибридизация әдісі қолданылады. Сұйықтықты-фазалы гибридизация әдісін қолданғанда зондты амплификатқа қосады, содан кейін гельде электрофорез жүреді. Қатты фазалы гибридизация әдісінде амплификат мембранада бекінеді де, одан кейін зондпен бірге гибридизирленеді.

Емделуші дәрігер мен дәрігер-зертханашы арасындағы диалогтың, байланыстың бар болуы маңызды. Бұл табылған микроағзаның аурудың пайда болуына қатысын түсініп, кеңесе отырып шешім қабылдауына мүмкіндік береді. ПТР әдісін қолдана отырып науқасты қарағанда, дәрігер дұрыс емес ем қолдану мүмкіндігінде жоққа шығармау керек. Бұл көбінесе нәтижені жылдам алу қажеттілігінен туады, себебі емдеу тактикасын таңдау үшін бұл жағдай шешулі рол атқарады. Бұл ретте ПТР-ң оң нәтижесі зерттеліп отырған биологиялық материалда қоздырғыштың геномының арнайы үзінділері болуы туралы ақпаратты ғана растайтындығына көңіл аудармайды.

Сапалы әдістің қолданылуы жүргізіліп отырған ықпалмен қоздырғыштың таралу динамикасын дұрыс бағалауға мүмкіндік бермейді. Әдістің жоғары сезімталдылығы инфекциялық агентті анықтауға мүмкіндік береді,

Ал оның ДНҚ-сы көптеген көшірмесе түрінде көрініп, амплифицирленеді және асқыну процесінің этиологиялық факторы ретінде қабылданады. Сондықтан да терапия курсының аяғында ДНҚ микроағзаларының жойылу динамикасы туралы есте сақтау маңызы, ПТР-дың қолданылуының мүмкіндіктерін анықтау да қажет, сонымен қатар терапия курысының аяқталуынан кейін материалдық алыну мерзімін анықтауда да маңызды. Инфекциялық аурулардың ДНҚ қоздырғыштары микроағзалардың жайылуынан кейін де ұлпаларда және биологиялық сұйықтарда бірнеше уақыт бойы болуы мүмкін екендігі белгілі. Осыған орай, саны азаймаған ДНҚ мишендер ПТР кезінде ем қабылдағаннан кейін де қандай да бір уақыт аралығында көрінеді.

          ПТР әдісі бойынша емдеу курсы біткеннен кейін ДНҚ микроағзалардың жойылу динамикасы зерттеу барысында антибактериалды препараттарды ішіп болғаннан кейін  35-45 күнде ДНҚ-нің құлдырауы басталатындығы айқындалды. Осыған байланысты ПТР әдісі бойынша бақылаудың алғашқы сатысын дұрыс нәтиже алу үшін емделу курсының аяқталуына қарай 45 күннен кейін бастауды ұсынып отырмыз.

          Сонымен қатар, екі-үш реттік бақылау жұмыстарын жүргізу қажеттілігіне көңіл аударылады. Қоздырғыштардың антибиотиктерге қарсы тұруы бола тұра, кейбір жағдайларда орардың саны емдік курстан кейін 2 және тіпті 3 ай аралығында ДНҚ анықталуы мүмкін емес дәрежеге дейін төмендеп кетуі ықтимал. Көрсетілген мерзім өткеннен кейін ДНҚ қоздырғыштардың көшірмелерінің саны көбейеді және ПТР нәтижесі оң көрсеткіш көрсетеді.

          Қазіргі кезде денсаулық сақтау тәрбиесіне инфекциялық аурудың ДНҚ/РНҚ  қоздырғыштарының сандық анықтаудың молекулалы-биологиялық әдістері қажет, себебі ПТР-клиникалық-зертханалық диагностиканың жоғарғы сезімтал әдіс ретінде ДНҚ қозлырғыштарының іздік санын қоса анықтауға мүмкіндік беретіні сонша, ол гипердиагностика жасауға дейін әкеледі. Сандық ПТР-ді жасау үшін әр үлгіге шаққандағы әртүрлі сандық көшірмесі бар ішкі бақылау-стандарттарын қолданатын әдістер, сондай-ақ «соңғы көбейту әдісі» деп аталатын әдіс қолданыста кеңінен таралған. Әдістемелік қарапайымдылығана қарамастан, жоғарыда берілген әдістер жұмыстың қосымша, қажырлы еңбек етуді қажет ететін кезендерден өтуін талап етеді, амплификация процесін бақылауға мүмкіндік бермейді және алынған нәтижелерді талдаудың қиындығына алып келеді.

          Бүгінгі таңда жоғарыда айтылып кеткен жетіспеушіліктерден арылған амплификация заттарын сандық анықтау әдісі бар, ол-полимеразды тізбекті реакция  (ПТР) шынайы уақыт режімінде деп аталады (Rea-time PCR). Әдістің маңызды шынайы уақытта реакция заттарының жиналуын тіркеуде болып отыр және әрбір нақты талдау үлгісінде  жүзеге асатын реалды процестер бойынша калибрлі қисық сызықтың салынуында болып отыр. Белгінің жиілігі соңғы заттың тіркелуіне пропорцианалды. Дегенмен де, сандық ПТР нәтижелерін бағалау үшін зертханалық диагностикалық көрсеткішер жасалмаған, соның ішінде клиникалық болжамды бағалауға, жүргізіліп отырған терапияның тиімділігінің жылдам мониторингін енгізуге мүмкіндік  беретін ДНҚ қоздырғыштардың диагностикалық маңызды концентрациялары да жасалмаған.

          Урогенитальді микрофлораны сандық бағалау үшін ПТР әдісінің тәжірибелік қолданылуына үлкен кедергінің барлығын ескереміз. Урогенитальді материалды зерттеу үшін алынған стандартизациялау мәселесі туарлы сөз болып отыр, сондықтан да алынған нәтижелердің дәлдігі көп сұрақ туғызады.

          Жауапкершілігі мол дәрігердің нәтижесі үшін нәтиженің алынуы болмайтындығы қабылданады. ПТР зерттеулердің сандық әдістерін тәжірибелік енгізілуі  үшін биологиялық матеиалдың стандартизациялау бойынша  және нәтижелерді клиникалық талдау бойынша үлкен жұмыс алдын-ала жасалуы тиісү

          Қазіргі уақытта, клиникалық зартханалық тәжірибеде ПРТ әдісін қолдануға рұқсат берілгендігіне қарамастан, аурудың нақты нозологиялық формасында ПТР-дің қолданылуының диагностикалық алгоритімдері заңдастырылмаған. Осыған орай, біз ұзақ та, белсенді өмір сүретін микроағзаларды анықтауда ПТР-дің қолданылуы дәлелденген, ал иммунохимиялық әдістер сенімді емес деп ойлаймыз. Егер клинико-диагностикалық зертханаларда әртүрлі әдістерді қолдану  мүмкіндігі болса, онда параллелді зерттеу жұмыстарын қатар жүргізу қарастырылған. [26, 28]

 

4.2 Өсімдіктер ДНҚ-ғы бөтен ДНҚ-ң процентік  көрсеткішін тест-жүйе арқылы анықтау

 

          Тамақ өнімдеріндегі ГМО-ның мөлшерін анықтауда әлемдік тәжірибеде тест-жүйені қолданады, дәлірек айтатын болсақ ПТР әдісі арқылы ДНҚ-дағы бөтен генді анықтауға мүмкіндік береді.

          Кесте-2.  Тамақ өңімдерінде қолданылатын ГМО элементтері.

 

 

 

 

Өсімдіктердегі ГМ түрлері	Линия (сорт) өңдеушілер	Промотор 35 S	Терминатор NOS
Соя	40-3-2 (Моносанто, США)	+	+
	А 2704-12 (Байер Кроп Сайенс,  ФРГ)	+	—
	Ф 5547-127 (Байер Кроп Сайенс, ФРГ)	+	—
Жүгері	MNO-810 (Моносанто, США)	+	—
	MNO-863 (Монсанто, США)	+	—
	NК-603 (Монсанто, США)	+	+
	GА 21 (Монсанто, США)	—	+
	Т25 (Байер Кроп Сайенс, ФРГ)	+	—
	Вt-11 (Сингента Сидс, Франция)	+	+
Картоп	Superior New Leaf сорты (Моносанто,  США)	+	+
	Russet Burbank New Leaf сорты (Монсанто, США)	+	+
Қант қызылшасы	Линия-77 (Сингента Сидс, Франция)	+	+
Күріш	LL62 (Байер Кроп Сайенс, ФРГ)	+	—

 

          Амфлипикацияның эффективтілігі бөтен және номерлік ДНҚ-сы сәйкес келсе келесі формула қолданады:

 

ΔС_t=С_{t (бөтен ДНҚ)} -С_{t(номерлік ДНҚ)}

 

                Осы формула рақылы ДНҚ-ғы ГМ проценттік мөлшерін анықтауға мүмкіндік береді.

          Қортындылай келе, ПТР әдісі тамақ өнеркәсібінде өнімдердегі ГМ мөлшерін білеміз.

Кесте-3. Тамақ өнімдеріндегі ГМО-ны анықтауда қолданылатын әдістердің салыстырмалы кестесі.

 

Әдістер	Ерекшелік	Универсалдылық	Қол жетімділік
Химиялық анализ	+	—	—
ИФА	+	—	—
ПТР	+	+	+

 

          Әр әдістің өзінің кемшілігімен артықшылығы бар:

1. Химиялық әдіс анализіне келетін болсақ ол өте сезімтал және ең бастсы олар тек зиян гербицитті генетикалық модификацияланған организімдерден  детектірлеуге мүмкіндік береді. Сонымен қоса химиялық әдісті қолдану қымбатқа түседі. Бұл әдісті тек үлкен көлемдегі лабараторияларда  жасауға мүмкіндік бар.
2. Иммуноферменттік анализ әдісі химялық әдіске қарағанда кішкене кең таралған және қол жетімді әдіс болғанымен олар тек рекомбинантты ДНҚ – ы айқындауға ғана мүмкіндік береді.
3. Политізбекті реакция әдісіне келетін болсақ (ПТР), Химиялық әдіс пен ИФА-ға қарағанда рекомбинатты ДНҚ-ы анықтауға мүмкіндік береді. Сонымен қатар жоғарғы сезімталдықпен кез-келген өнімнен рекомбинатты ДНҚ-ы айқындауға болады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Қорытынды

 

          ПТР әдісінің жоғары сезімталдығына байланысты аурулардың диагностикасын ерте анықтауға мүмкіндік береді. Бұл әдістің бір ерекшелігі ДНҚ-ның  репликациясы табиғи ДНҚ репликациясынан кем емес.

Политізбекті реакция –ДНҚ-ң репликациясының  жүруін айқын көрсететін ең негізгі әдістердің бірі. ПЦР әдісінің ашылуымен  спецификалық молекула ДНҚ-ң  миллиондаған молекула арасындағы маңыздылығы анықталды.

Политізбекті реакция әдісінің ашылуы молекулалық биология саласындағы соңғы онжылдықтағы негізгі жаңалық болып табылады. Ашылған жаңалық медицина саласындағы диагностиканы  жаңа, жоғары сатыға көтерді. Политізбекті реакция әдісінің маңыздылығы – ДНҚ-ң  участогын лабораториялық жағдайда  температуралық цикл барысында пробиркада амплификациялау (бірнеше қайтара көшірмесін түсіру).  ДНҚ-ң  әрбір көшірмесін жасау барысында алдыңғы процесте синтезделген ақпарат  қайта синтезделіп, ДНҚ полимеразамен қайта көшіріледі. Осы процесс барысында ДНҚ-дағы ақпарат түрленіп, күрделене  түседі де синтез процесінің жүруі  жеңілдей  түседі.

ПТР әдісін микробиология және эпидемиология саласында инфекциялық ауруларды, батериялық, вирусытық аурулардың диагностикасы үішін қолдану  көптеген мәселелерді шешеді. Сонымен бiрге бұл әдiстiң қолдануы созылмалы және аз зерттелген инфекция ауруларын зерттеу төңiрегiдегi iргелi зерттеулерiнiң дамуына мүмкiндiк туғызады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Пайдаланылған әдебиеттер тізімі

 

1. ПЦР «в реальном времени»/Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др.; под ред. Д.б.н. Д.В. Ребрикова; передисл. Л.А. Остермана и акад. РАН РАСХН Е.Д. Свердлова; 2-е изд., испр. И дпо. – М.: БИНОМ. Лабаратория заний, 2009. – 223 с.: ил.
2. С. Ж. Стамбеков, В. Л. Петухов. Молекулалық биология. Новосибирск-2003г.
3. А. Ж. Сейтембетова, С. С. Лиходий. Биологиялық химия. Алматы «Білім»-1994ж.
4. Сартаев А.С. Адам генетикасы. Жоғарғы және орта оқу орындарының студенттеріне арналған оқу құралы. Алматы, 2006.-215 бет.
5. Бочков Н.П. Генетика человека М.Медицина, 1978.
6. Дубинин Н.П. Генетика, Еишинев, 1985
7. Мұхамбетжанов К.Қ. Генетика: Оқулық.- Алматы: Print-S, 2005.-244 б.
8. С.А. Әбілаев. – Медициналық биология және генетика. Оқулық.-Алматы: «NURESS» баспасы, 2011.-356 бет.
9. Айала Ф., Кайгер Д.Ж. Современная генетика. В 3-томах. – Москва, 1988.
10. Әбілаев С.Л., Қуандықов Е. Ө. Төлебаев Р.К. Медициналық биология және генетика. Шымкент, 1996.
11. Гофман – Кадашников. П.Б. «Задачи по общей и медицинской генетике». –М., 1969.
12. Заяц Р.Г., Бутвишовский В.Э., Рачковская К.В., Давыдов В.В. Общая и медицинсакя генетика Лекции и задачи.-Родтов на Дону, 2002.
13. Петрова Р.А. Основы генетики.-М.: Дрофа, 2004. – 96 с.: ил.
14. Общая биология: Учеб. для. студ. образоват. учереждений сред. проф. образования/В.М. Константинов, А.Г.Резанов, Е.О.Фадеева; Под ред. В.М.Константинова.-2-е изд. Стреотип.-М.: Издательский центр «Академия», 2004.-256 с.
15. Б.К. Бегімқұл. Генетика. Алматы, 2000 ж. 388 бет.
16. Богданова Т.Л., Солодова Е.А. Биология: справочник для старшеклассников и поступающих в вузы /Т.Л.Богданова, Е.А. Солодова.-3-е изд.-М.: АСТ-ПРЕСС ШКОЛА, 2006.-816 с.
17. Биотехнология. Отв. Ред. Баев А.А. 1984, Москва.
18. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология, 2003. Москва.
19. Биологический энциклопедический словарь. М., Советская энциклопедия, 1989.
20. Босток К., Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки. М., Мир, 1981.
21. Генетика и наследственность. Сб. Статей. М., Мир, 1987.
22. Инге-Вечтомов С.Г. Введение в молекулярную генетику. М., Высшая школа, 1983.
23. Картель Н.А. Макеева Е.Н., Мезенко А.М. Генетика. Энциклопедический слоарь. Минск, Тэхнология, 1999.
24. Фогель Ф., Мотульский А. Генетика человека. М., Мир, 1989.
25. Avery O.T., Macleod C.M., McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of  Pneumococcal types. J. Exp. Med., 1944, 79,137-158.
26. Barr M.L., Bertram L.F. A morphological distinction between neurons of the male and the female and behavior of the nucleoprotein synthesis. Nature, 1949, 163, 676-677.
27. Dobzhansky Th. Genetics of the evolutionary process. N.Y.- London – Cambridge – Amsterdam. Holden –Day, 1970.
28. Gilbert W. Introns and exons. N.Y., 1979.
29. Gilbert W., Maxam A. The nucleotide sequence of the lac operator. Proc. Natl. Acad. USA, 1973, fo, 3581-3884.
30. Kettlewell H.B.D. The phenomen of industrial melanism in the  Lepidoptera, Annu. Entom., 1961.
31. Meselson M., Stahl F. The replication of DNA in Escherichia coli. Natl. Acad. Sci. USA, 1958, 44, 671-682.
32. Nadler C.F., Bunch T.D. G-band patterns of the Siberian Snow sheeps and their relationship in sheep. Cytogenetics and Cell 1977.
33. Nilsson-Ehle H. Kreuzungs-untersuchugen an Hafer and Weizen, Lunds Univ. Arskr. N.F. Atd., 1909, 2,5,1-122.
34. Robertson W.R.B. Chromosome studies. Taxanomic relationships shown on the chromosomes of  Tettigidae and Acrididae. J. Of  Morphology, 1916.
35. Sanger F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Science, 1991, 214, 1205-1210.
36. Science et Vie. France, c 1987 y.
37. Sturtevant A. H. The linear arrangement of six-linked factors in Drosophila, as shown by their mode of association. J. Exp. Zool., 1913, 14, 43-59.
38. Temin H. M. The DNA provirus hypothesis. Science, 1976, 192, 1075-1080.
39. Tonegawa S. Somatic recombination and mosaic structure of immunoglobulin genes. Harvey. Lectures. 1981, 75, 61.
40. Watson J.D., Crick F. Molecular structure of nucleic acids. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature, 1953, 171, 964-697.
41. Bordoni R., Germini A., Mezzelanni., Marchelli R., De Bellis G.A. microarray platform for parallel Detection of five transgenic events in foods: a combined polymerase chain reaction-ligation detection reaction-universal arry method.// J Agric Food Chem., 2005, 53: 912-918.
42. Hernandez M., Rodrnguez-Lozaro D., Zhang D., Esteve T., Pla M., Part S. Interlaboratory transfer of a PCR multiplex method for simultaneous detection of four genetically modified maize lines: Bt11, MON810, T25, and GA21// J Agric Food Chem., 2005, 53: 3333-3337.
43. Holst-Jensen A., Running S.B., Luvseth A., Berdal K.G. PCR technology for screening and quantification  of  genetically modified organisms `(GMOs). // Anal Bioanal Chem., 2003, 375:985-933.
44. Ronning S.B., Vaitilingom M., Berdal K.G., Holst-Jensen A.Event specific real-time quantitative PCR for genetically modified Bt11 maize (Zea mays) // Eur. Food Technol., 2003, 216:347-354.