КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ АЛЬ — ФАРАБИ

 

 

 

 

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

 

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

 

 

 

ВЫПУСКНАЯ РАБОТА

 

 

 

Идентификация нефтеокиcляющих бактерий

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СОДЕРЖАНИЕ

 

ВВЕДЕНИЕ

 

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Углеводородокисляющие микроорганизмы

 1.2 Микробная деструкция углеводородов нефти

               и нефтепродуктов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

       2.1. Объект исследования

       2.1. Питательные среды

       2.3. Методы исследования

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

        3.1. Отбор активных нефтеокисляющих бактерий

        3.2. Идентификация отобранных бактерий ……………………………….

 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ………………………

 

 

 

 

                    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РЕФЕРАТ

 

 

 

 

 

      

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Проблема охраны окружающей среды от нефтяных загрязнений приобретает все большую остроту в связи с ограниченностью возможностей и дороговизной применения для этих целей механических, физических способов очистки. [1]

Нефть и нефтепродукты являются одними из самых опасных и широкомасштабных загрязнителей окружающей среды, поскольку при современных объемах добычи их потери составляют 50млн тонн в год. [2]

Попадая в окружающую среду углеводороды нефти оказывают угнетающее действие на локальные экологические системы: губят живые организмы и существенно изменяют условия их обитания.[3]

Если нефтяные загрязнения характерны в основном только для районов добычи нефти, ее переработки и транспортировки, то загрязнение нефтепродуктами, такими как дизельное топливо, керосин, смазочные масла, мазут и т. д. распространены повсеместно.

Процесс самовосстановления загрязненной среды, по мнению большинства исследователей, идет более 15 – 20 лет. По данным Оборина с соавторами, полного восстановления нефтезагрязненных почв не происходило ни через 15, ни через 25 лет после загрязнения.

Среди мер, принимаемых с целью очистки окружающей среды от указанных загрязнителей, важное место занимает интенсификация микробиологических способов деструкции нефти и нефтепродуктов.[4]

          Целью  данной  работы  является  отбор  активных  нефтеокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почв Тенгизского месторождения, обладающих способностью к деструкции нефти и их идентификация. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Изучение способности культур к росту на средах, содержащих высокие концентрации нефти и отбор активных штаммов.
• Первичная идентификация бактерий.
• Определение их родовой принадлежности.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Углеводородокисляющие микроорганизмы.

 

Общая характеристика.Микроорганизмы, использующие углеводороды широко распространены в природе.[5]  Углеводородокисляющие микроорганизмы – составная часть гетеротрофного микробиоценоза. Присутствие углеводород усваивающих бактерий в окружающей среде – важный экологический фактор. В условиях увеличивающегося загрязнения экологическая роль этих микроорганизмов возрастает.[6]

Известно около 150000 видов микроорганизмов, из них более 100 видов способны использовать углеводороды нефти в качестве источника энергии.[7].  Микроорганизмы – деструкторы нефти в основном относятся к аэробным и факультативно аэробным организмам.[6]  Там, где среда загрязняется нефтью, эти микроорганизмы находят благоприятные условия для своего развития.[8]

Экология.Углеводородокисляющие микроорганизмы распространены повсеместно в почве, воде, разлагающихся веществах и т. д.[9]

Микроорганизмы, потребляющие углеводороды нефти, являются обычными сочленами биоценозов почв.

Во всех почвах в большом количестве содержатся микроорганизмы, способные окислять жидкие парафины и значительно реже – использующие летучие углеводороды. В почвах, содержащих нефть микроорганизмов, использующих н-алканы и ароматические углеводороды, находится значительно больше, чем в почвах без этих соединений.

Почва – весьма благоприятный субстрат для выделения микроорганизмов, использующих углеводороды нефти. В ней обитают бактерии, относящиеся к родам: Mycobacterium, Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Pseudomonas.

Для почв, содержащих нефтепродукты, характерно присутствие узкоспециализированных форм микроорганизмов: окисляющих газообразные углеводороды, термофилов, усваивающих твердые парафины, бактерий, использующих ароматические углеводороды.

Из почв, пропитанных нефтью впервые были выделены аэробные спорообразующие бактерии с оптимальной температурой роста 45 – 65°С, усваивающих углеводороды. Они принадлежат видам Bacillus subtilis, Bac.brevis, Bac. coagulans. Большая группа штаммов описана как новая разновидность – Bac. circulans ssp. thermophilus nov. ssp.

Из почв нефтяных месторождений (Западная Украина) выделены нафталинусваивающие бактерии, представлены в основном видами рода Pseudomonas: Pseud. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. boreopolis. По ряду свойств изолированные штаммы отличаются от типовых и обладают строгой специфичностью по отношению к нафталину как единственному источнику углеродного питания.

Из нефтеносных почв выделено свыше 20 видов аспорогенных дрожжей ( роды Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Torulopsis, Sporobolomyces, Trichosporon, Cryptococcus и др.)[5]

Тауссон сообщает о существовании микроорганизмов, окисляющих углеводороды в почвах пустыни. Там, где почва беспрестанно загрязняется нефтью, эти организмы находят благоприятные условия для своего развития, и большой процент общего количества почвенных микробов является активным.[7]

Бактерии и дрожжи, обладающие способностью усваивать парафины, обитают в ризосфере и филосфере растений, желудочно-кишечном тракте животных. Они выделяются из растительных материалов, подвергнутых биологическому консервированию.

Среди бактерий и дрожжей Квасников и др. обнаружили виды, обладающие способностью фиксировать азот атмосферы при использовании углеводородов в качестве единственного источника углеродного питания и энергии.

Микроорганизмы, окисляющие водороды широко распространены в воде и на дне морей. Скопление углеводородов при наличии благоприятных условий вызывает усиленное размножение микроорганизмов.

Наибольшее количество углеводородокисляющих микроорганизмов обнаруживается в теплое время года и может в 10 – 100 раз превышать количество сапрофитов, высеваемых на МПА. В холодный период года углеводород усваивающие бактерии обнаруживаются значительно реже.

Имеется тесная связь между видовым разнообразием, количеством нефтеокисляющих микроорганизмов и наличием нефтяного загрязнения в водоеме. В прибрежных водах морей, где нефтяное загрязнение постоянно, от 5 до 50% микроорганизмов способны окислять отдельные углеводороды и их смесь. Характер вертикального распределения углеводородокисляющих микроорганизмов также указывает на положительную корреляцию их численности с количеством нефтяных загрязнении, которое более значительное в портах и поверхностном слое воды. Углеводородокисляющие бактерии обнаружены в приатмосферном микрогоризонте Черного моря; зимой их 10² — 10³ клеток в 1 мл. В сильно загрязненных районах Черного моря содержание этих организмов достигает 10³ — 10 в 7 степени клеток в 1 мл.

Большое количество углеводородокисляющих бактерий было обнаружено в грязи различных морских заливов и бухт.[7]

Численность микроорганизмов – деструкторов нефти не может служить количественным, а только качественным. В то же время численность углеводородокисляющих бактерий является фактором, ограничивающим скорость биодеградации. Чем больше численность углеводород усваивающих микроорганизмов, тем меньше требуется времени для их размножения  и тем шире спектр углеводородов, подвергающихся окислению. Так, дополнительная инокуляция почвы микроорганизмами повышает биодеградацию дизельного топлива на 10 – 17 %[6]

Большое количество углеводородокисляющих бактерий было обнаружено в грязи различных морских заливов и бухт.

4

Мюлкин — Филлипс и Стюарт изучали распределение углеводородокисляющих микроорганизмов в 35 – сантиметровом слое грунта и установили, что наибольшее количество этих организмов обнаруживается в самом глубоком слое; в верхней части 35 – сантиметровой колонки грунта их содержание составляло 10     клеток на 1 грамм. Авторы объяснили это тем, что углеводороды концентрируются в нижнем слое, а поверхностный перемешивается с водой.[5]

Из всего вышеизложенного можно сделать выводы, что углеводородокисляющие бактерии наиболее часто встречаются в местах непосредственного загрязнения нефтью: в почве и воде. Микроорганизмы – деструкторы нефти также можно встретить в донных осадках морей и различных водоемов, в грязи морских заливов и бухт. Углеводородокисляющая микрофлора в основном представлена бактериями, но довольно часто встречаются дрожжи и грибы.

Наибольшая численность микроорганизмов, окисляющих нефть обнаруживается в теплое время года, в холодное время они попадаются значительно реже.

Видовой состав микроорганизмов – нефтедеструкторов. Углеводородокисляющие микроорганизмы относятся ко многим таксономическим группам. В настоящее время известно около 100 видов бактерий и мицеллярных грибов, обладающих способностью усваивать углеводороды.[7]

Наиболее распространенным родом является р. Pseudomonas:род Pseudomonas является очень обширным; виды его обнаруживаются повсеместно: в воздухе, почве, пресной и соленой воде. Известно почти 200 видов, многие из которых подвижны, передвигаясь с помощью жгутиков. Некоторые вырабатывают зеленоватый флуоресцирующий пигмент, растворимый в воде. Образование пигментов характерно для видов: Ps. aeruginosa, Ps. boreopdis, Ps. oleovorans, Ps. fluorescens и другие. Присутствие пигмента нехарактерно для морских бактерий.

          Большинство видов р. Pseudomonas вызывают брожение глюкозы, но не лактозы. Обычно они способны к восстановлению нитратов до нитритов, аммиака или азота.

          Бактерии имеют вид палочек, единичных или парных, или даже коротких цепочек, размером в среднем от 0.5 до 2 мкм.          Морфология колоний может быть различной.[7]

          Представителями данного рода являются виды: Ps. sinuosa, Ps. boreopolis, Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. desmolyticum, Ps. radiobacter, Ps. liquefaciens и другие. [7,9]  

          Порядок Actinomycetales.       Данный порядок характеризуется нитевидным строением клеток, хотя у микобактерий цепочки клеток или мицелий чаще всего либо являются рудиментарными, либо отсутствуют.[7]

          Порядок Actinomycetales включает в себя такие семейства как сем. Mycobacteriaceae и сем. Actinomycetaceae.

          р. Mycobacterium. Давно известно, что микобактерии способны усваивать углеводороды.[10]

          Микобактерии содержат 30% липидов, неизменным компонентом которых являются миколовые кислоты, сосредоточенные в клеточной стенке. У сапрофитных микобактерий поглощение углеводородов происходит путем пассивной диффузии.[6]

          Микобактерии часто бывают окрашенными – красно – оранжевые (группа rhodochrous) – выделены из вод Арктики. Они преобладают, в частности, в углеводородоокисляющей микрофлоре южного нефтеносного района.[11]

          В молодом возрасте они имеют вид мелких, неподвижных палочек 2 – 3 мкм длиной и 0.4 – 0.6 мкм в поперечнике, часто соединенных попарно под углом. При старении клетки превращаются в очень короткие одиночные палочки.[10] Помимо палочек встречаются кокки, но реже.[12]

          В основном микобактерии обладают слабой биохимической активностью: медленно разжижают желатин, либо вообще не разжижают, молоко не изменяют, практически не активны к сахарам, редко обладают инвертазной активностью  и не восстанавливают нитраты.[10,11,12]

          Типичные виды:  M. album, M. luteum, M. rubrum, M. mucosum, M. convolum, M. lactiscola, M. paraffinicum, M. brevicale, M. phlei и другие.[7,10,11,12]

          р. Nocardia (сем. Actinomycetaceae  ) р. Proactinomycetes, p. Actinomyces и р. Micromonospora характеризуются разветвленным мицелием. Actinomyces и Nocardia являются потенциально патогенными для животных, тогда как Micromonospora редко бывают патогенными.

          Наиболее характерными представителями р. Nocardia являются виды: N. actinomorphus, N. opacus, N. paraffinae, N. rubber, N. polychronogenes, N. agrestris и др.[7]

          Род Bacillus: наиболее активные деструкторы. Рода Bacillus объединяет широкий ряд палочковидных аэробных и факультативно анаэробных эндоспорообразующих бактерий. Он включает термофильные и психрофильные, пресноводные и галофильные, ацидофильные и алкалофильные бактерии, способные гетеротрофно потреблять широкий ряд органических соединений или расти автотрофно.

          Анализ последовательностей 16S РНК показал, что внутри рода содержится несколько филогенетически различных групп, часть которых уже выделена в новые роды: Alicyclobacillus, Paenibacillus, Halobacillus, Brevibacillus, Aneuribacillus, Virgibacillus. [13] Крахмал не гидролизуют, желатин не разжижают.[9]

          Представители: Bac. hexacarbovorum, Bac. mesentericus, Bac. subtilis, Bac. circulans, Bac. brevis, Bac. palustris, Bac. sphaericus, Bac. mucoides, Bac. idosus и др.[5,7]

1. Desulfovibrio состоит из небольшой группы облигатных анаэробов, которые восстанавливают сульфаты до сульфидов. Они обнаруживаются в почве, соленой и пресной воде и морских илах. Обычно имеют вид изогнутых палочек или коротких цепочек, и в этом случае похожи на штопор.

          В некоторых культурах наблюдаются необычно разбухшие клетки D. desulfuricans. Они передвигаются с помощью единичного полярного жгутика, хорошо развиваются в пресной воде и на начальной стадии выделения культуры не развиваются в морской воде, тогда как D. aestuarii предпочитает морскую воду или 3% минеральный раствор, обогащенный сульфатами и пептоном.

1. P. rubenshickii близок к обоим видам микроорганизмов, но он способен использовать масляную, пропановую, валерьяновую, пальмитиновую и стеариновую кислоты, галактозу, сахарозу, лактозу и мальтозу.[7]

род. Methanomonas: считается состоящим из вида: Meth. methanica, широко распространенного в природе, вернее – в почве. Молодые клетки обычно представляют короткие палочки размером 0.5 – 0.8 мкм на 2.0 – 3.0 мкм и подвижны благодаря жгутику. Старые культуры могут иметь клетки почти крупные. Зонген выделил микроорганизм, который он очевидно считал принадлежащим к роду Pseudomonas, хотя относил их к Bac.methanicus. Орла – Джексон дал этому виду современное название  Methanomonas methanica.

Метанобразующие бактерии являются облигатными аэробами, и поэтому неактивны в морских осадках и всюду, где глубина превышает несколько сантиметров.[7]

Помимо вышеуказанного вида, в природе встречается вид Methyiomonas sp., который осуществляет биодеградацию хлорированных углеводородов. Установлено, что смешанная культура метанокисляющих бактерий деградирует хлорированные углеводороды ( 3 – хлорэтилен, хлоралканы) в течение 2 – 4 суток.[14].

Род Rhodococcus. Постоянный компонент микрофлоры нефтяных залежей. Они используют газообразные н – алканы, включая их углерод в клеточную биомассу.[6]

В основном это аэробы, часто неподвижные, некислотоустойчивы.[15] Палочковидные (Rhodococcus erythropolis, пропаноокисляющие родококки); характерными свойствами представителей рода Rhodococcus является их плеоморфизм и 3х-стадийный жизненный цикл развития, включающий образование рудиментарного или хорошо развитого первичного мицелия, который фрагментируется на палочки и кокковидные клетки (микроцисты). Жизненный цикл кокки – палочки – кокки осуществляется обычно за 24 – 28 часов, реже за несколько суток [15].

Наиболее известные виды: Rhod. rhodochrous, Rhod. ruber, Rh. erythropolis, Rhod. luteus,   Rhod. opacus, Rhod. maris, Rhod. terrae, Rhod. rubropertinctus, Rhod. equa, Rhod. chlorophenolicus.

Род Аrthrobacter: можно встретить в  морях, в почве, пресных водохранилищах. Способны образовывать гликолипиды на н – алканах, усваивать антрацен, фенол. Не образуют миколовых кислот. В клетку углеводород поступает не через всю клеточную стенку, а через отдельные её участки. Выделяющееся из клетки   вещество эмульгирует углеводород, а места его выхода служат каналами для поступления углеводородного субстрата в клетку[16].

Артробактерии являются одними из наиболее распространённых в почвах микроорганизмов, которые обеспечивают удивительную устойчивость к неблагоприятным факторам среды[16].

Типичными представителями – деструкторами данного рода являютяся: Arthrobaster sp., A. calcoaceticus, A. paraffineus, A. globiformis и др.

Род Aspergillus  . Представителями этого рода являются наиболее изученными из углеводородусваивающих грибов. Аспергиллы характеризуются большой скоростью роста в самых разнообразных экологических условиях. Они обладают жизнеспособностью под действием ряда экстремальных факторов [7].

Образующиеся гифы проникают в среду с углеводородами, обильно ветвясь в ней. В гифах обнаруживаются жировые включения. Эти включения играют важную роль при усвоении углеводородов, эмульгируя их сложные фракции [17]. Аспергиллы были выделены из лесных почв, нефтяного ила, дизельного топлива [6].

Углеводородусваивающие аспергиллы: Aspergillus niger, A. fumigatus, A.sp, A. flavus, A. ochraceus, A. alliaceus, A.   luchaensis и др. [7,18].

Род Candida: Для выращивания на парафинах в промышленных условиях рекомендованы штаммы C. guilliermondii и C. tropicalis.

Известно, что дрожжи C. guilliermondii  Kangeron et Guerra являются гетероталличными гаплоидами, имеющими два типа спаривания, и при соответствующих условиях могут скрещиваться и давать диплоидное потомство. В связи с этим данный вид перенесён в род Pichia  и классифицируется как   Pichia guilliermondii Wickerham [19].

Таким образом, углеводородокисляющие микроорганизмы представлены вышеуказанными  родами и видами, но следует заметить, что это далеко не все представители и роды данной группы организмов: кроме названных представителей в природе встречаются следующие роды бактерий: Rhodococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Achromobacter; дрожжей: Rhodotorula, Trichosporon и др. ; грибов Penicillum, Aspergillus [6].

Довольно перспективным в отношении очистки различных экосистем является род Rhodopsuedomonas, который встречается в основном в северных регионах. Типичные представители: Rh.capsulata, Rh. sphaeroides, Rh. palustris, Rh. rubrum  и др. [20]

 

 

 

 

 

Таблица1. Таксономический перечень микроорганизмов, усваивающих углеводороды и микроорганизмов, родственных с ними

 

Виды микроорганизмов	Используемые углеводороды	Примечания
Род Tiobacillus Вид Т. denitrificans	природн. асфальт	—
Род Pseudomonas Ps. аeroginosa     Ps. boreopodis Ps. fluorescens         Ps. оleolorans   Ps. putida	Керосин Нефть, газолин, гексан, гептан, нафталин, парафиновый воск. нафталин метан  каучук, n-гептан, n- додекан, метилциклогексан, керосин нефть   различные	многочисленные виды       выделен из почвы активен в болотной почве выделена из почвы и канав     выделена из нефтяной эмульсии                 —
Род Methanomonas M. methanica   M. sp. Methtlomonas sp.	метан, этан, пропан             -//-//- хлорирован. углев.	Выделена из почвы нефт. промышлен. не метановая                —
Род Desulfovibrio b. D. desulfuricans     D. aestuarii	фенол и высшие углеводороды   нефть	Облигатные анаэробы выделены из нефтяных вод                 —
Сем. Micrococcaceae   Род Micrococcus M. paraffinae   Род Sarcina S. sp.	парафиновый воск нефть   нефть	выделена из садовой почвы                 —
Сем. Achromobacteriaceae Род Achromobacter   A. agile	циклогексан   керосин, парафин, асфальты	Усваивает фенол, но не бензол или толуол
Сем. Enterobacteriaceae Род Serratia   S. marcescens	парафиновый воск, каучук	выделена из каучука, почвы
Сем. Bacteriaceae Род Bacterium B. аliphaticum       B. aliphaticum liquefaciens       B. benzoli     B. fluorescens B. hidium   B. lypoliticum B. naphtalinicus   B. phenanthrenicus   B. stutzeri	алифатические углеводороды С6 – С24 гептан, октан, нонан, декан и т.д. алифатические и нафтеновые циклогексаны, метилциклогексан бензол, толуол, ксилол природная нефть парафин этан, керосин петролейный эфир парафин, воск нафталин фенантрен   парафиновый воск	не могут усваивать арены       не могут усваивать арены обесцвечив. метилен. синь   усваивает до 0.01% в среде   выделен из почвы выделена из грязи   выделена из почвы выделена из пропитанной нефтью почвы выделена из садовой почвы
Сем. Bacillaceae Род Bacillus B. hexacarbovorum   B. mesentericus   B. toluolicum   B. sp	бензол, толуол, ксилол каучук   бензол, толуол, ксилол парафин	выделена из почвы и воды развивается в 0.01%    выделена из почвы, навоза
Пор. Аctinomycetales Сем.Micobacteriaceaе Род Micobacterium   M. album M. hyalinicum M. lactiscola   M. luteum M. phlei M. rubrum	большинство углеводородов нефть, парафин парафин ацетилен, парафин, каучук парафин  -//-//-//- нефть, каучук	Известны многочисленные виды выделены из почвы          -//-//-//-          -//-//-//-          -//-//-//-          -//-//-//-          -//-//-//-          -//-//-//-
Сем. Actinomycetaceae Род Nocardia N. actinomorphus N. agrestis N. carallinus N. minimus N. opacus         N. paraffinae N. polychromogenes N. ruber N. salmonicolor N. sp.(14 разновидностей)	парафин -//-//-//- -//-//-//- -//-//-//- жидкий парафин, додекан, тетрадекан, гексадекан, октадекан парафин -//-//-//- -//-//-//- -//-//-//- -//-//-//-	выделена из почвы           -//-//-//-           -//-//-//-           -//-//-//-           выделенa из почвы            -//-//-//-            -//-//-//-            -//-//-//-            -//-//-//-
Род Actinomyces A.   аlbus   A.    bovis chromogenes        A.chr. аlbus A.    elastica A.    eppinger A.    fuscus A.    madurae A.    oligocarbophilus   A.    trautwein A.    vidacens ruber A.    «15» A.    «218» A. sp.	парафиновый воск каучук парафиновый воск каучук   парафиновый воск каучук парафиновый воск каучук парафиновый воск алифатические углеводороды парафиновый воск -//-//-//- -//-//-//- -//-//-//- нефть, парафиновый воск	выделяют из почвы то же и из сточных вод выделяют из почвы выделяют из почвы и воды из почвы то же и из сточных вод         -//-//-//-          -//-//-//- выделяют из почвы не могут исп.бензол, ксилол выделяют из почв           -//-//-//-           -//-//-//-           -//-//-//- виды не установ., выделяют из почвы
Сем. Streptomycetaceae Род  Micromonospora Различные виды	парафиновый воск, нефть различные углеводороды, толуол, нафталин	Выделяют со дна озера Висконсина
Кл. Phycomycetes, Ascomycetes и Deuteromycetes ( дрожжи и плесени)
Aspergillus flavus       A. fumigatus A. niger A. sp.	парафиновый воск этилен     этилен -//-//-//- парафиновый воск	— высокие концентрации тормозят развитие бактерий                        —                        — выделенa из почвы
Botritis cinera		1 указание использование углеводородов бактериями
Debaryomyces sp. Endomyces sp. Hansenia sp. Manilia sp. Penicillium notatum P. sp. Torulopsis sp.	нефть -//-//-//- -//-//-//- -//-//-//- парафиновый воск -//-//-//- нефть	выделяют из почв            -//-//-//-            -//-//-//-            -//-//-//-            -//-//-//-            -//-//-//-            -//-//-//-
Сем.Rhodopseudomonadaceae Род. Rhodopseudomonas Rh .palustris Rh.rubrum Rh. capsulata Род. Rhodococcus   R. erythropdis	нафталин,                             фенантрен н – алканы С10 – С30	галотолерантные   выд. из нефтяных месторождений
Р. Arthrobacter A. globiformis A. nicotianae A. sp.	полициклические арены мазут	выд. из почвы и донных отложений                  —
Р.Acinetobacter A. calcoaceticus Р. Fusarium Fusarium sp.	н – алканы минеральное масло   нефть	выдел. из почвы     выделена из почвы

 

 

  1.2. Микробная деструкция углеводородов нефти и

    нефтепродуктов

 

Нефть – сложная смесь алканов (парафинов или ациклических насыщенных углеводородов), цикланов (нафтенов) и аренов (ароматических углеводородов) различного молекулярного веса, а также кислородных сернистых и азотистых производных углеводородов [7].

Наиболее широкое применение находят такие нефтепродукты, как бензин, дизельное топливо, моторное масло, нигрол и др.

Бензин содержит предельные и непредельные углеводороды, асфальтеновые смолы, серу, тетраэтилсвинец. Дизельное топливо – более вязкая смесь, чем бензин, содержит большое количество парафинов [21].

Моторное масло и нигрол – остаточные продукты прямой перегонки нефти, содержащие значительное количество смол и асфальтенов[21].

Некоторые закономерности окисления углеводородов нефти.        Все углеводороды,  входящие в состав нефти, могут быть использованы микроорганизмами – деструкторами нефти, но окисляются они неодинаково легко [22].

          Углеводороды  с боковыми цепочками легче окисляются микроорганизмами, чем углеводороды с прямой цепочкой, возможно, благодаря присущей им большой химической реактивности.

В основном справедливо мнение о том, что способность различных видов бактерий окисляются углеводороды увеличивается с увеличением длины цепочки последних [7].

За некоторыми исключениями, парафины легче окисляются микроорганизмами, чем родственные с ними парафины. Этот параллелизм между микробами и химическим воздействием подтверждается также данными о важности положения двойных связей.

Углеводороды с более чем одной двойной связью (бутадиен, изопрен, стирен) также очень легко окисляются.

На нафтеновые углеводороды очень легко воздействуют многие бактерии, и какой – либо алифатический заместитель в кольце ещё более усиливает лабильность молекулы. Например, Тауш и Петер нашли, что Bacterium aliphaticum liquefaciens воздействует на 1,3 – ди- и 1,3,4 – триметилциклогексан легче, чем на сам циклогексан. Но ароматизация молекулы затрудняет микробное окисление, возможно, благодаря присущей молекуле устойчивости, которая является как бы синонимом ароматичности. Также Тауш и Петер выяснили, что Bacterium aliphaticum воздействует на алифатические, но не на ароматические  или нафтеновые углеводороды, тогда как  Bacterium aliphaticum liquefaciens окисляет как алифатические, так и нафтеновые углеводороды, но не ароматические.

Углеводороды с наиболее высокой молекулярной массой обычно легче окисляются бактериями, чем бензол.[7] Наиболее трудно утилизированными субстратами являются тяжелые фракции нефти, такие как мазут и его компоненты: бензольные смолы, нефтяные масла[4,21].

Нефтяные масла используются в качестве смазочного материала и поэтому являются основными загрязнителями почвы вблизи предприятий, связанных с использованием нефтепродуктов.[4]

Окисление углеводородов нефти.    Дэвис (Davis 1967) указывает на три возможных пути окисления н– алканов:

1)монотерминальное окисление метильной группы с образованием спирта, альдегида и монокарбоновой кислоты;

2)окисление как вариант монотерминального окисления с образованием соответствующего метилкетона через вторичный спирт;

3)детерминальное окисление, при котором терминальные группы н- алкана окисляются одновременно  или последовательно с образованием жирных кислот.

Фостер полагает, что для большинства микроорганизмов наиболее типично окисление концевого атома углеродной цепи н–алкана. В результате образуется первичный спирт, альдегид, монокарбоновая кислота, причем последняя, соответствующая н-алкану, может подвергаться дальнейшему окислению.

Другие исследователи (Крючкова, Воробьева,Лопатин) также считают наиболее вероятным путем окисления н-парафинов монотерминальное. Сенез приводит результаты опытов, свидетельствующие о том, что клетки Pseudomonas, выращенные на среде с гептаном, адаптированы к углеводороду, первичному спирту, альдегиду и жирной кислоте, но не к соответствующей дикарбоновой кислоте.[5]

По мнению Кьюла (Quyale, 1972) существуют 2 основных пути биохимического окисления углеводородов:

1) превращение их в обычные промежуточные продукты, которые используются для построения клеточного вещества (при этом усваиваются углеводороды как основной источник углерода);

2) превращение в промежуточные продукты которые не усваиваются микробной клеткой или используются ими как ростовой субстрат не полностью.[7]

          Наилучшее развитие нефтеокисляющих микроорганизмов в интервале рН 6.5 – 7

          По скорости разложения в нестерильной почве углеводороды можно расположить в следующей последовательности: н-парафины        циклогексан 

       ароматические углеводороды.[23] 

          В процессе деградации нефти в воде происходит потеря н-алканов и низкомолекулярных углеводородов при соответствующем возрастании доли ароматических соединений. Высокомолекулярные компоненты наиболее устойчивы.[5]

          Факторы, от которых зависит окисление различных углеводородов, достаточно многочисленны. Это и химическая устойчивость, и наличие соответствующей системы энзимов у бактерий; способность углеводорода проникать через оболочку клетки микроба в содержимое клетки; способность углеводородов растворять липидные клеточные компоненты; возможная токсичность продуктов метаболизма, способность организма освобождаться от продуктов метаболизма, ненужных для активности клетки; различные пути усвоения различных углеводородов; действие осмотического давления и поверхностного натяжения  и др. факторы.[7]

          Также микробиологическая деградация углеводородов зависит  от природы загрязнителя,  от наличия других источников углерода и энергии, факторов роста, концентрации азота и фосфора, солености, величины рН среды, температуры, сезонности. Одним из ведущих факторов, определяющих концентрацию микроорганизмов в незагрязненных морских водах, является выживаемость клеток при отсутствии источников питания.[6]

          Углеводороды с длиной углеродной цепи от С5 до С10 с большим трудом используются микроорганизмами, легкие н-алканы угнетают рост некоторых бактерий и дрожжей.[8]

          В 1980 году Коронелли выделила несколько путей поступления углеводородов в клетки микроорганизмов:

1) углеводороды поступают в клетки при прямом контакте с ними; 

2) поглощение углеводородов клетками микроорганизмов носит пассивно – диффузный характер;

3) концентрация углеводородов в среде должна быть около 1%;

4) решающая роль в поглощении углеводородов принадлежит клеточной липофильной стенке, содержащей специфические липиды;

5) гидрофобность клетки при использовании углеводородов возрастает вследствие повышенного синтеза «стеночных» липидов.[5]

          Процесс разрушения углеводородов протекает по окислительному пути и зависит от содержания кислорода в среде. Присутствие свободного кислорода является необходимым условием деструкции углеводородов любой химической структуры. Насыщенность вод кислородом определяет интенсивность и глубину данного процесса. Так, для окисления одного литра нефти в море расходуется 3300гр кислорода.

          На процесс биодеградации нефти влияет наличие в среде ионов некоторых металлов и микроэлементов.

          Существенное значение имеет присутствие в водоемах высших водных растений. При наличии в водоемах их зарослей процесс трансформации нефтяных загрязнений может ускоряться в несколько раз, при этом сроки очистки бассейна, соответственно, сокращаются.[5]

 

 

 

          Таким образом, углеводородусваивающие микроорганизмы способны окислять нефть и нефтепродукты, но усваивают они их неодинаково легко.

          Окисление углеводородов зависит от самых различных факторов.

          Большинство исследователей полагают, что деградация углеводородов нефти идет по монотерминальному пути окисления, с образованием спирта, альдегида и монокарбоновой кислоты. Углеводороды в клетку микробов поступают самыми различными путями.

          Проблема загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами достаточно актуальна.[24]

          Загрязнение окружающей среды (почвы, воды) нефтепродуктами является экологической проблемой мирового масштаба.[4]

          Нефть и нефтепродукты – один из распространенных загрязнителей окружающей среды.[25]

          Использование биологических (микробиологических) методов представляется одним из эффективных и, главное, безопасных способов деградации нефти и нефтепродуктов в загрязненных экосистемах.

          Биологические методы основаны на использовании ферментативной активности микроорганизмов – деструкторов, использующих углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии или в качестве косубстрата.[24]

          Все вышеперечисленные углеводородокисляющие микроорганизмы можно эффективно использовать в качестве биопрепаратов для очистки различных экосистем.

          В последнее время все чаще используют биопрепараты, состоящие из двух или более штаммов, поскольку интродукция монокультуры углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязненную среду не может полностью решить проблему очистки. Нефть – сложный субстрат, и один штамм не способен к ее полной утилизации, поскольку не может обладать всем спектром ферментов, необходимых для этого. Использование же нескольких штаммов, отличающихся по спектру потребляемых субстратов, сопровождается более полной деструкцией нефти.[2]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Материалы и методы

 

 

          2.1. Объект исследования

 

          Изучено 15 активных культур микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почв Тенгизского месторождения. (Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д., Артемова Г.Т., Сыдыкбекова Р.К.)/

 

          2.2. Питательные среды

 

Для изучения деструктивной активности использовали синтетическую среду Ворошиловой-Диановой (г/л) : NH4NO3-1,0; K2HPO4-1,0; KH2PO4-1,0; MgSO4-0,2; FeSO4-0,002; CaCl2-0,02; дрожжевой экстракт –1,0; агар-агар-20; Среду кипятили, фильтровали, pH доводили до 7,0-7,2 и стерилизовали при 1атм. 30мин.

МПА (мясо – пептонный агар) готовится на кислотном гидролизате мяса, содержащем легко усваиваемые пептиды. Одну часть (по объему) гидролизата смешивали с пятью частями водопроводной воды, нейтрализовали 30% щелочью до рН 7.0, затем добавляли 1% пептона, 0.5% поваренной соли и 2% агар – агара. Полученный МПА разливали в колбы, стерилизовали при 1атм. 30 мин.

          Для изучения роста бактерий в жидких питательных средах использовали МПБ (мясо – пептонный бульон): 250мл МПГ (мясо – пептонного гидролизата) смешивали с 750 мл водопроводной воды, добавляли 10гр пептона, 5гр NaCl, рН доводили до 6.8 – 7.0, разливали в колбы и стерилизовали при 1атм.30мин. Синтетическая среда, г/л водопроводной воды: глюкоза – 3.0; NH4NO3 – 0.3; KH2PO4 – 0.1; K2HPO4 – 0.1; MgSO4 – 0.05; NaCl – 0.05; CaCO3 – 0.5; FeSO4 – следы; агар – агар – 15. Среду разливали в пробирки, стерилизовали при 1атм. 30 мин.

          МПЖ — (мясо – пептонная желатина) – к МПБ добавляли 10 – 15% желатины, оставляли на 20 – 30 минут, затем смесь нагревали до полного растворения желатины, разливали полученную МПЖ в пробирки и стерилизовали при 0.5 атм. 15 мин.

 

          2.3. Методы исследования                                                                                    

          Для изучения нефтеокисляющей способности штаммов культуры высевали в колбы с жидкой синтетической средой Ворошиловой – Диановой с добавлением различных концентраций сырой нефти. Культивировали на качалке (220 об/мин) при температуре  +20  +22 ºC. Через 7 сут  Проводили описание  характера роста культур.

У выделенных культур изучали ряд признаков: морфологические, культуральные и физиолого-биохимические.

          Морфологические признаки изучали на молодых (1 – 2-суточных) культурах, выросших на МПА. Прижизненно окрашенные метиленовым синим препараты микроскопировали при увеличении 90х

          Размер клеток определяли с помощью окулярного винтового микрометра.

          Для выявления спор пастеризовали 7 –суточные культуры (10 мин при 80º С), выросшие на МПБ. После этого высевали на поверхность скошенной агаризованой среды (МПА). Пробирки с засеянной средой помещали в термостат (28º С) на 2 суток.

          Для выявления кислотоустойчивости на высушенный фиксированный мазок помещали фильтровальную бумагу и заливали препарат карболовым фуксином Циля, 2 – 3 раза подогревали до появления паров. После того, как препарат остывал, снимали фильтровальную бумагу, промывали водой. Для обесцвечивания препарат обрабатывали раствором 5% H2SO4, погружая стекло 2 – 3 раза в стакан с кислотой и докрашивали 5 минут метиленовым синим, подсушивали и исследовали с иммерсионной системой. Кислотоустойчивые клетки приобретали красный цвет, а некислотоустойчивые  синий цвет.

          Все бактерии по способности окрашиваться красителями трифенилметанового ряда с йодом делятся на две группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый генициановым фиолетовым и йодом удерживается при обработке их спиртом – грамположительные. Грамотрицательные не обладают таким свойством и обесцвечиваются при обработке спиртом. Для окраски по Граму фиксированные мазки окрашиваются в течение 1 –2 мин. Карболовым генциановым фиолетовым, затем краситель сливали, и не промывая водой, препарат обрабатывали 1 – 2 мин. раствором Люголя до почернения. Сливали раствор Люголя и обрабатывали препарат 0.5 – 1.0 мин 96% этиловым спиртом. Затем промывали препарат водой, высушивали и микроскопировали. Грамположительные бактерии окрашивались в сине – фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в красный цвет фуксина.         

          Культуральные признаки изучали на плотных и жидких питательных средах

          Микроорганизмы, развиваясь на поверхности плотных сред, образуют характерные для данного вида колонии. У колоний отмечали следующие признаки: форма, размер, оптические свойства, цвет, поверхность, структура, профиль, консистенция.

          Описание колоний дополняли описанием роста микроорганизмов по штриху, его особенности, оптические свойства, его цвет, поверхность и консистенцию.

          Многие микроорганизмы растут на ломтиках картофеля и образуют налеты, характерные для представителей данного вида. Кусочки картофеля погружали на 1 час в 1% раствор NaHCO3 для нейтрализации клеточного сока и помещали в пробирки, на дно которых предварительно была положена вата, смоченная водой. Стерилизовали при 1.5атм. Посев проводили петлей, втирая посевной материал в скошенную поверхность картофеля. Культуры инкубировали при 37º С семь суток.

          Для роста микроорганизмов в жидких средах использовали МПБ. Инкубировали в термостате при 37º С семь суток. Обращали внимание на такие признаки, как помутнение среды, образовали пленки или осадки.

          Физиолого – биохимические признаки.

          Для описания и идентификации микроорганизмов широко используют некоторые особенности их обмена веществ, выявляемые по способности изучаемого организма расти на принятых в настоящее время диагностических средах и вызывать те или иные превращения веществ, входящих в состав этих сред.  

Для изучение использование углеводов и сахаро-спиртов использовали следующие углеводы: арабинозу, ксилозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу и спирты-глицерин и маннит. Образование кислот регистрировали по изменению активной кислотности (рН) среды образование газа – по появлению на поверхности среды пены и вытеснению среды из поплавка. Углеводы или спирты добавляли к основному фону среды в количестве 1%. Основной фон среды готовили на водопроводной воде; он включает 0.5% пептона и 0.1% K2HPO4. Для обнаружения и изменения рН, к среде добавляли индикатор – бромкрезолпурпур – из расчета 2 мл 1.6%-ного спиртового раствора на 1л. среды. При рН 6.8 индикатор имеет пурпурный, а при рН 3.5 желтый цвет.

          Визуально по помутнению среды, образованию пленки или осадка отмечали рост или его отсутствие на всех использованных средах.

          Образование ацетилметилкарбинола

          Этой способностью обладают микроорганизмы, сбраживающие глюкозы с образованием кислот, которые в дальнейшем участвуют в биосинтезе нейтральных продуктов: ацетилметилкарбинола (ацетона), диацетила и 2.3 бутиленгликоля.

          Использовали среду состава (%): глюкоза – 1.0, пептон – 0.5; K2HPO4 – 0.1, вода водопроводная. Среду разливали в пробирки по 8 – 10мл., стерилизуют при 0.5атм. и засеивают. Продолжительность культивирования 7 суток. После инкубации к 2мл. культуры добавляли 1мл. 10%-ного раствора КОН.   

          Для выявления гидролиза крахмала использовали среду следующего состава (%): пептон – 1.0, КН2РО4 – 0.5; растворимый крахмал – 0.2 ; агар – агар – 1.5; рН = 6.8 – 7.0. Среду стерилизовали при 1атм. И разливали в чашки Петри. После того как среда застынет, засевали штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования 7 – 10 суток. По зонам просветления судили о способности бактерий использовать продукты гидролиза крахмала.

          Разжижать желатину способны микроорганизмы, выделяющие протеолитические ферменты. Для выявления этой способности культуры высеивали на МПЖ уколом и инкубировали 10 суток при комнатной температуре.

 

 

          Восстановление нитратов

          Способность к выявлению нитратов выявляли на среде, состоящей из МПБ и 0.2% KNO3. Среду разливали в пробирки, спускали в среду поплавки и стерилизовали при 1атм. Среду засеивали клетками исследуемого организма, после чего регистрировали результаты.

          На синтетической среде растут микроорганизмы, которые в качестве источника азота используют азот минеральных солей и не требуют внесения в среду готовых витаминов или других факторов роста. Среду разливали в пробирки и стерилизовали при 0.5атм. Посев проводили штрихом, культивировали 10 суток. Рост и его особенности отмечали визуально.

          Отношение к кислороду проводили на среде МПА. Среду разливали в пробирку высоким столбиком и посев проводили уколом. Рост и его интенсивность отмечали по уколу. В соответствии с этим характеризовали отношение исследуемого организма к кислороду.

          Для выявление оксидазная активность, несколько капель 1%-ного водного раствора тетраметил – р – фенилендиамина наносили на колонию в чашку Петри. Колонии микроорганизмов, обладающих оксидазной активностью приобретали красную окраску, которая через 10 – 30 мин. переходила в черную.  

          Для выявления каталазная активность микроорганизмов. В небольшом объеме 10%-ного раствора Н2О2 суспензировали клетки исследуемого организма. О каталазной активности судили по образованию пузырьков газа.

          Для определения температуры, обеспечивающей оптимальный рост.  Культуры выращивали при температурах: +1º С,+25º С, +37º С, 45º С, +55º С и на основании полученных результатов делали вывод об оптимальной температуре.

          Большую или меньшую чувствительность бактерий к концентрации соли в среде оценивали по их способности расти в МПБ с 2.5 и 6.7% NaCl. Среду разливали в пробирки и стерилизовали при 1атм. Через 10 суток регистрировали рост микроорганизмов и делали вывод об их чувствительности и концентрации NaCl.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

 

 

3.1. Отбор активных нефтеокисляющих микроорганизмов

Выделение и отбор микробных культур с высокой метаболитической активностью, способных трансформировать и утилизировать нефтяные углеводороды, а также оценка их деградационных возможностей имеет важное значение при проведении биоремедиационных мероприятий /27/. В связи с этим из нефтезагрязненной Тенгизской почвы ранее были выделены 15 активных культур микроорганизмов. Все эти культуры интенсивно растут на среде Ворошиловой-Диановой с нефтью и нефтепродуктами.

Для дальнейшего скрининга 15 культур были испытаны на способность расти на средах с высокими концентрациями Тенгизской и Кумкольской нефтью.

Как известно, состав нефти довольно сложен. Основными классами углеводородов, входящих в ее состав являются парафиновые, циклопарафиновые и ароматические углеводороды. Количественное и качественное соотношения этих классов различны в зависимости от условий образования нефти /28/. Тенгизская нефть отличается низким содержанием парафиновых и высоким содержанием ароматических углеводородов.

Таблица 1

Рост бактериальных культур на синтетической среде с различными концентрациями Тенгизской нефти

 

Культуры		Концентрация нефти, %
№	Штаммы	3%	5%	7%	10%
1	107	+ + +	+ +	+ +	+
2	104	+ + +	+ +	+ +	+ +
3	51КС	+ + +	+ + +	+ + +	+ +
4	125АГ	+ + +	+ +	+	+
5	36Е	+ + +	+ +	+ +	+ +
6	35А	+ + +	+ +	+ +	+ +
7	110	+ + +	+ +	+ +	+
8	108	+ + +	+ + +	+ +	+ +
9	109КС	+ + + +	+ + +	+ + +	+ + +
10	22А	+ + +	+ +	+ +	+
11	127КС	+ + +	+ +	+ +	+
12	122АС	+ + +	+ + +	+ + +	+ +  +
13	113АС	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +
14	105	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +
15	121	+ +	+ +	+	+

 

Примечание: (+ + +) — интенсивный рост, (+ +) — хороший рост,

                       (+) — слабый рост,  (-) — роста нет.

 

       Результаты исследования показали, что исследуемые культуры микроорганизмов различаются между собой по росту  на разных концентрациях нефти. Все культуры  на средах  с 3% Тенгизской нефти показали очень хороший рост, а на более высокой 5% концентрации сырой нефти 5 культур 51КС, 109КС, 122АС, 113АС и 105 показали более высокую активность. Результаты экспериментального отбора показали, что среди исследуемых культур 51КС, 109КС, 122АС, 113АС и 105 оказались наиболее устойчивыми к 7%-10% нефти и очень хорошо растут на высоких концентрациях.

Для дальнейшего изучения были проведены сравнительные исследования углеводородокисляющей активности штаммов, их способность к росту на нефти, более сложной по химическому составу. Для этого исследования мы использовали Кумкольскую нефть.

 

Таблица 2

 

Рост бактериальных культур на среде с высокими концентрациями Кумкольской нефти

 

Культуры		Концентрация нефти, %
№	Штаммы	3%	5%	7%	10%
1	107	+ +	+	+	+
2	104	+ +	+	+	+
3	51КС	+ + +	+ + +	+ + +	+ + +
4	125АГ	+ +	+	+	+
5	36Е	+ +	+ +	+ +	+
6	35А	+ +	+	+	+
7	110	+ +	+	+	—
8	108	+ +	+ +	+	+
9	109КС	+ + +	+ + +	+ + +	+
10	22А	+ +	+	+	+
11	127КС	+ +	+ +	+	+
12	122АС	+ + +	+ + +	+ + +	+ +  +
13	113АС	+ + +	+ +	+ +	+ +
14	105	+ +	+ +	+ +	+ +
15	121	+ +	+ +	+	+

 

Примечание: (+ + +) — интенсивный рост, (+ +) — хороший рост, (+) — слабый рост, (-)- роста нет.

 

По результатам исследований видно, что на среде с 3% Кумкольской нефти в основном все культуры дают хороший рост, но по сравнению с ростом на Тенгизской нефти только 51КС, 109КС, 122АС, 113АС показывают очень хороший рост. На средах с 7-10% нефти все культуры показывают слабую способность к росту на Кумкольской нефти. Культуры 51КС, 109КС, 122АС дают очень хороший рост на всех концентрациях нефти.
      Результаты исследований показывают, что на среде с     Кумкольской нефтью культуры растут слабее, чем на Тенгизской нефти. Это можно объяснить ее химическим составом. Кумкольская нефть отличается высоким содержанием парафинов и смолистых веществ.

Таким образом, среди исследованных бактериальных культур только 5 культур наиболее устойчивы к высоким концентрациям нефти. Эти культуры показали очень хорошую способность к росту на среде с Тенгизской и Кумкольской нефтью. Они оказались наиболее активными деструкторами нефти.

 

3.2 Идентификация активных нефтеокисляющих мироорганизмов 

 

Для подробного исследования с целью определения их родовой принадлежности были изучены морфологические, культуральные и физиолого-биохимические признаки.

Из исследуемых штаммов – деструкторов  2 культуры (109КС и 113АС) оказались грамположительными подвижными палочками, размером 0,5-2,5х1,0-1,2 мкм, способные образовывать споры.

 109КС: Аэробы, активны к оксидазе и к каталазе. Колонии кремового цвета, плоские, матовые, легко снимаются с агара. Из углеводов потребляют глюкозу, нитраты не восстанавливают, фенилаланин не дезаминируют, в дополнительных факторах роста не нуждаются. Бактерии хорошо разжижают желатин, гидролизуют крахмал, растут на синтетической среде. На МПБ растут с обильным образованием хлопьевидного осадка. На картофеле выделяют пигмент кремового цвета.

113АС – факультативные аэробы, обладают оксидазной и каталазной активностью. Колонии прозрачно – белые, блестящие, выпуклые. Сбраживают глюкозу, нитраты не восстанавливают, реакция на фенилаланин отрицательная. Желатин разжижают, крахмал не гидролизуют, растут на синтетической среде. На МПБ растут с образованием кольцоа и осадка, на картофеле выделяют желто – коричневый пигмент.

Используя критерии идентификации определителя Берги /29/ выделенные культуры были идентифицированы как  Bacillus sp.

При изучении штамма 51КС оказалось, что это подвижные короткие палочки переходящие в удлиненные формы клеток, размерами 0,6-1,0х0,3-0,5 мкм. Культура образует мелкозернистые округлые, каплевидные колонии тестообразной консистенции. Оптические свойства матовые, с ровными краями. Оптимальная температура 20-32⁰ С, оптимальные значения рН 6,0-7,4. Клетки по Граму окрашивались положительно. Пигменты в среду не выделяют. Кислотоустойчивые. Нитраты не восстанавливают, фенилаланин не дезаминируют. Желатин разжижают, крахмал не гидролизуют, хорошо растут на синтетической среде. В жидкой среде дают хороший рост, образуя пленку на поверхности среды и плотный осадок. На картофеле выделяют бежевый пигмент. Согласно определителю Берги /29/ культура отнесена к роду Rhodococcus.

При исследовании штаммов 105 и 122АС выяснилось, что это грамотрицательные подвижные палочки, неспорообразующие, имеющие размеры 0,5-1,0х1,5-5,0 мкм.

            105 – колонии круглые, матовые, белого цвета, с гладкой поверхностью, ровным краем и крупнозернистой структурой. Активны к оксидазе и к каталазе, потребляют глюкозу. Нитраты не восстанавливают, денитрификация отсутствует, фенилаланин не дезаминируют. Разжижают желатину, хорошо растут на синтетической среде, крахмал не гидролизуют. На МПБ растут с помутнением среды и образованием хлопьевидного осадка. На картофеле выделяют желто – оранжевый пигмент.

               122АС – факультативный аэроб, каталазо- и оксидазоположительный. Колонии матовые, светло – желтого цвета, с ровным профилем и крупнозернистой структурой. Нитраты не восстанавливают, фенилаланин  не дезаминируют, в дополнительных факторах роста не нуждаются. Желатину не разжижают, гидролизуют крахмал, на синтетической среде не растут. На картофеле выделяют светло – оранжевый пигмент. Идентифицированные  105 и 122 АС культуры отнесены к роду Pseudomonas.   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВЫВОДЫ

 

 

1. Изучена способность 15 активных культур к росту на средах, содержащих высокие концентрации нефти. Отобраны 5 штаммов – деструкторов, наиболее хорошо растущих при высоких  концентрациях  (3,5,7 и 10 %)  сырой нефти.
2. У исследованных 5 бактериальных культур 51КС, 122АС, 109КС, 113АС и      105 были изучены морфологические, культуральные и физиолого – биохимические признаки  . Штаммы отнесены: 51КС — к роду Rhodococcus, 122АС и 105 — к роду Pseudomonas, 113АС и 109КС — к роду Bacillus.

 

 

 

 

 

…

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

 

1 Капотина Л. Н, Морщакова Г. Н. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов// Биотехнология.1998.Т. 1.       С. 82 – 85

2 Кобзев Е. Н., Петрикевич С. Б., Шкидченко А. Н. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов – нефтедеструкторов в открытой системе// Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37.  Вып. 4. С. 413 – 417

3 Шкидченко А. Н., Аршебасаров М. У. Изучение нефтедеструктивной активности микрофлоры прибрежной зоны Каспийского моря// Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38.Вып. 5. С. 509 – 512

4 Звягинцева И. С., Суворовцева Э. Г., Поглазова М. Н. Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями.// Микробиология. 2001.Т.70. Вып. 3.  С.321 — 328

5 Квасников Е. И., Клюшникова Т. М. Микроорганизмы – деструкторы нефти в водных бассейнах. – Киев: Наукова Думка, 1983. 230с.

6 Дермичева С. Г. , Шигаева М. Х. Углеводородокисляющие микроорганизмы. Алматы, 1994.

7 Бирштехер Э. Нефтяная микробиология.  Ленинград, 1957.

8 Розанова Е. П. Использование углеводородов микроорганизмами.// Успехи микробиологии. 1967. Вып. 4.  С. 61 – 64

9 Миронов О. Г. Нефтеокисляющие микроорганизмы в море. – Киев: Наукова Думка, 1971. 233с.

10 Красильников Н. А., Коронелли Т. В. и Калюжная Т. В. Окрашенные парафиноокисляющие микобактерии.// Микробиология. 1972. Т.51.С.513 – 515.

11 Коронелли Т. В. и Калюжная Т. В. и Розынов Б. В. Арктические окрашенные микобактерии и их роль в окислении углеводородов нефти.// Микробиология. 1981. Т.50. Вып.1.  С. 167 – 170.

12 Красильников Н. А., Коронелли Т. В. и Дуда В. И. Поверхностные структуры клеток парафинокисляющей микобактерии  Mycobacterium paraffinicum.// Микробиология. 1972. Т.51. Вып. 2 .  С. 313 – 316.

13 Назина Т. Н., Турова Т. П., Полтараус А. Б. Физиология и биохимия разнообразных термофильных спорообразующих углеводородокисляющих бактерий из нефтяных пластов.// Микробиология. 1998. Т.69. Вып. 3. С. 383 – 388.

14 Акентоева Н. П., Додонов М. В. Биодеградация хлорированных углеводородов метанокисляющими бактериями  Metylomonas sp. GYJ-3 // Прикладная биохимия и микробиология . 1998. т. 34. №2. с. 153-156.

15 Ившина Т. Н., Пшеничнов Р. А., Оборин А. А. Пропанокисляющие родококки.  Свердловск: 1987 с. 124

16 Демкина Е. В., Соина В. С., Эль – Регистан Г. И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях.// Микробиология. 2000. Т.69.  Вып. 3. С. 383 – 388.

17 Билай В. И., Коваль Э. З. Рост грибов на углеводородах нефти. – Киев: Наукова Думка, 1980.  520с.

18 Доценко Г. Н., Феофилова Е. П., Терешина В. М. Использование микроорганизмов для удаления загрязнений с деталей авиационной техники. // Прикладная биохимия и микробиология.  2001. Т. 37. Вып.1. С. 73 – 76.

19 Квасников Е. И., Щелокова И. Ф. Дрожжи. Биология. Пути использования. Киев: 1991.

20 Белоусов Н. И., Барышникова Л. М. Отбор микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах. // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38.Вып. 5. С. 513 – 518.

21 Квасникова Е. И., Щелокова И. Ф., Масумян В. Я. Дрожжевая микрофлора почв, загрязненных углеводородами нефти.// Микробиология. 1967.Т.36. Вып. 6. С. 1076– 1081.

22 Миронов А. Г. Биологические аспекты нефтезагрязнений морской воды.  Киев: Наукова Думка, 1988.  148с.

23 Исмаилов Н.М. Биодеградация нефтяных углеводородов.// Микробиология. 1985.Т.54. Вып. 5. С. 758– 765.

24 Мукашева Т. Д., Шигаева М. Х. Современные технологии биоремедиации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами//Вестник КазНУ, серия биологическая.- Вып. 1(16).  — 2002.

25 Ягафарова Г. Г., Гатауллина Э. М. Новый нефтеокисляющий микромицет Fusarium sp. // Прикладная биохимия и микробиология.2001. Т. 37. Вып. 1. С. 77 – 79.

26. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. Москва, 1976. С.125-150.
27. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв// Прикладная биохимия и микробиология. 1995. Т. 31 Вып. 5. С. 534-539.
28. Клар Е. Полициклические углеводороды. Пер. с англ. М. 1971. Т. 2. С. 43-46

29.Bergeys Minual of determinative bacteriology. Edition J.Z.Noet., N.R.Krieg.et al.М.: Мир. 1997. Т.1-2.С. 97-123. С. 567-568.