Дипломная работа: Тестирование ряда злаковых на устойчивость к ржавчине

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АЛЬ – ФАРАБИ

Биологический факультет

Кафедра генетики и молекулярной биологии

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Тестирование ряда злаковых на устойчивость к ржавчине

АЛМАТЫ — 2012

СОКРАЩЕНИЯ СЛОВ:

АМК — β-аминомасляная кислота;

АФК – активна форма кислорода;

СВЧ-реакция – сверхчувствительная реакция;

СИУ – системная индуцированная устойчивость;

СК – салициловая кислота;

СОД – супероксиддисмутаза;

СПУ – системная приобретенная устойчивость;

ПОЛ – пероксидное окисление липидов;

ABI1 – ген, придающий нечувствительность к АБК (от Abscisic Acid Insensitive 1);

ABRE – АБК-чувствительный элемент (от ABA-Responsive Element);

EIN1 – ген, придающий нечувствительность к этилену;

ERA3 – Enhanced Response to ABA3;

GCR — связанный с G-белком рецептор;

МАР-киназа – митоген-активируемая протеинкиназа;

SNARE – Soluble N-ethylmaleimidesensitive factor Attachment Protein Receptor;

WAPK – активирующаяся при поранении протеинкиназа;

ФК МДГ-ГОАТ — ферментный комплекс малатдегидрогеназа-глютаматоксалоацетатаминотрансфераза.

СОДЕРЖАНИЕ

титульный лист	1
реферат	2
содержание	3
сокращение слов	5
введение	6
основная часть	7
2.1 особенности селекции пшеницы на устойчивость к болезням	7
2.2 возбудитель заболевания	9
2.2.1 бурая ржавчина	9
2.2.2 стеблевая ржавчина	10
2.2.3 желтая ржавчина	12
2.3 генетика устойчивости	13
2.3.1 вертикальная устойчивость	13
2.3.2 горизонтальная устойчивость	14
2.4 исходный материал для селекции	14
2.5 методы селекции	15
2.5.1 внутривидовая гибридизация	15
2.5.2 отдаленная гибридизация	16
2.5.3 мутагенез	17
2.5.4 хромосомная инженерия	17
2.5.5 аллоцитоплазматические гибриды	18
3.1 генетические основы устойчивости пшеницы к фитопатогенам	18
3.1.1 гипотеза Флор «ген на ген»	18
3.1.2 генетические концепции взаимоотношений растений хозяев и паразитов	19
3.1.3 Lr-гены устойчивости к возбудителю бурой листовой ржавчины	22
3.1.4 эффективное сочетание генов устойчивости для защиты пшеницы от бурой ржавчины	24
3.2 механизмы устойчивости растений	25
3.2.1 классификация белков	30
3.2.2 дефензины	31
3.2.3 новые пептиды отвечающие за устойчивость	33
3.2.4 тауматины	34
3.2.4.1 тауматин I	34
3.2.4.2 тауматин II	35
3.2.4.3 тауматин-подобные белки	36
3.2.5 лектины в защитных реакциях при инфицировании растений	36
3.2.6 роль PR-белков в развитии индуцированной салициловой кислотой системной приобретенной устойчивости	38
3.3 вещества – регуляторы устойчивости	38
3.3.1 содержание этилена и жирных кислот у различных сортов озимой пшеницы	39
3.3.2 активность ФК у генотипов пшеницы различающихся по устойчивости к ржавчинным болезням	41
3.3.3 салициловая кислота	44
3.3.3.1 влияние салициловой кислоты на устойчивость пшеницы	49
3.3.4 абсцизовая кислота	50
3.4 химические вещества повышающие устойчивость злаков	54
3.4.1 влияние препаратов, обладающих свойствами цитокининов, на баланс ИУК и АБК в растениях пшеницы при инфицировании	54
3.4.2 влияние бензилмедазола на ювенильную устойчивость эгилопсов к листовым болезням	55
выводы	57
список использованных источников	59
приложение	62

РЕФЕРАТ

Выпускная работа написана на 68 страницах машинописи, включая 2 рисунков, 10 таблиц, 12 диаграмм и списка литературы из 32 названий.

Ключевые слова: виды ржавчины, циклы развития, эпифитные годы, пшеница, вертикальная устойчивость, горизонтальная устойчивость, селекция, гибриды, инженерия.

В работе рассмотрены особенности циклов развития основных видов ржавчины, пути их контаминации растений, ответ растений на действия возбудителя заболевания с целью выявления видоспецифичных особенностей растений для борьбы с заболеваниями, связанными с расами ржавчины. Установлены сортовые отличия в скорости реакции ответа на контаминацию возбудителя и что ответственно за проявление иммунной реакции пшеницы.
6

ВВЕДЕНИЕ

Пшеница является важнейшей продовольственной и кормовой культурой. В мире она занимает лидирующее место по посевным площадям среди возделываемых культур. Такое широкое распространение объясняется высокой питательностью и возможностью разностороннего использования и переработки пшеницы. Дальнейшее увеличение зерна пшеницы возможно, главным образом, за счет роста урожайности и снижения потерь, в первую очередь связанных с заболеваниями.

В настоящее время потери урожая неустойчивых к опасным патогенам сортов пшеницы достигают в эпифитотийные годы до 60%. При внедрении интенсивных технологий возделывания, как пшеницы, так и зерновых культур в целом, из-за микроклимата в посевах резко возрастает вредоносность листостебельных патогенов. Применение химических средств защиты растений, которые предусматриваются в этой технологии, связано не только с высокими затратами средств, но и, самое главное, с отрицательным воздействием на окружающую среду. Помимо этого химический метод не всегда гарантирует ожидаемый результат, и это, прежде всего, относится к ржавчинным болезням зерновых культур [5, 7].

Во всем мире устойчивый сорт является важнейшим элементом в системе интегрированной защиты растений от болезней и вредителей. Селекция пшеницы на устойчивость к ржавчине проводится более 40 лет. Несомненно, что выведение и распространение устойчивых сортов — экологически перспективный путь развития сельского хозяйства. Однако этот процесс должен идти непрерывно, поскольку абсолютной устойчивости создать невозможно и устойчивость к любому агенту рано или поздно может быть преодолена возбудителем. Тем не менее, экономическая эффективность этого метода защиты может быть весьма велика и превышать эффект от использования пестицидов в десятки раз.

2.1 ОСОБЕННОСТИ СЕЛЕКЦИИ ПШЕНИЦЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К БОЛЕЗНЯМ

Создание устойчивых к болезням и вредителям сортов – весьма сложное и трудное направление в селекции, особенно у пшеницы. Трудности в селекции пшеницы связаны, прежде всего, с тем, что каждый патоген имеет физиологические расы. Так, число рас листовой ржавчины превышает 180. Далее, патоген довольно быстро эволюционирует, нередко опережая селекционный процесс выведения нового сорта. Это создает необходимость вести постоянный контроль изменчивости, как самой культуры хозяина, так и паразита, и с учетом изменений, происходящих в популяции патогена, вести поиск новых генов устойчивости. Однако главное затруднение в селекции на устойчивость к болезням, связано со сложным характером взаимодействия между двумя биологическими системами ( двумя организмами ) – пшеницей и патогенном. Нужно учитывать генетические системы того и другого, а также тщательно контролировать внешние условия с учетом их влияния, как на растение, так и на болезнь. Основа современных представлений о взаимодействии хозяин – паразит была сформулирована Н. И. Вавиловым в 1935 году. Взаимодействия хозяин – паразит, приводящие к снижению вредоносности последнего, могут быть следующими:

Устойчивость, обусловленная наличием немногих расоспецифических генов ( вертикальная устойчивость, или специфическая устойчивость ), большого числа малых аддитивно взаимодействующих генов, дающих неспецифических по отношению к отдельным расам эффект или универсально – устойчивыми моногенами ( горизонтальная устойчивость ).
Толерантность к паразиту – низкая вредоносность на фоне высокого заражения посева. Обеспечивается высокой скоростью регенерации нанесенных повреждений или является следствием невысокой роли в формировании урожая пораженных паразитом органов, частей растения.
Несовпадение во времени или пространстве пика развития паразита и чувствительной к нему фазы роста растения [5].

В условиях искусственного заражения растение обнаруживает высокую восприимчивость, но в полевых условиях посев может быть чист от паразитов. Установлено, что эволюция паразитов сопряжена с эволюцией поражаемого ими растения и появления у сортов зоны новых генетических факторов устойчивости приводит к обогащению популяции патогена новыми агрессивными расами. Это создает необходимость непрерывной селекции новых устойчивых сортов, постоянного поиска все более эффективных генов устойчивости. Скорость эволюции паразита определяется частотой возникновения новых мутаций и скоростью смены поколений. В отношении болезней с высокой скоростью расообразовательного процесса эффект достигается использованием тех генов устойчивости, в отношении которых мутация вирулентности губительна для паразита или значительно понижает жизнеспособность

последнего. Вертикальная устойчивость может обеспечить весьма эффективную, но кратковременную защиту сорта. Особенно опасным оказывается введение одного и того же гена устойчивости во многие широко распространенные сорта, что ускоряет эволюцию паразита. Гораздо более эффективна селекция с использованием универсальных моногенов устойчивости. Для замедления образования новых агрессивных рас предложена система горизонтальной устойчивости, основанная на введении в один сорт нескольких так называемых малых генов устойчивости, не предотвращающих полностью, но резко ослабляющих развитие болезни. Замедление развития паразита приводит к уменьшению числа его поколений за вегетацию и количество образования спор. В этом случае слабо агрессивные расы продолжают существовать в посеве пшеницы ( не нанося заметного урона урожаю ) и своим присутствием препятствуют размножению новых агрессивных рас [1, 7]. Недостатком горизонтальной устойчивости для селекции является трудность тестирования многочисленных слабых генов, которые, как правило, не могут быть установлены заражением отдельных проростков в лабораторных условиях, а требуют оценки в поле и только на достаточно крупных делянках. Селекцию на полигенную устойчивость ведут традиционным методом отбора из гибридных популяций, который и длителен, и сопряжен с риском потери части генов. Хорошую защиту представляет совмещение части генов горизонтальной и вертикальной устойчивости. Вертикальная устойчивость используется также при создании многолинейных ( мультилинейных ) сортов, представляющих собой смесь генетически близких аналогов с различными генами вертикальной устойчивости. При наличии в посеве четырех или большего числа линий с различными генами устойчивости возникают расы паразита, вирулентные по отношению к одному из этих генов, но их споры погибают, попадая на соседние растения с другими генами устойчивости. В ряде случаев повышение устойчивости к болезням достигается введением генов, обуславливающих морфологические признаки, непосредственно затрудняющие развитие паразита. Например, сильный восковый налет на листьях препятствует удержанию на них капель росы, необходимых для прорастания спор ржавчины. Повышение устойчивости во многих случаях может быть достигнуто изменением сроков прохождения фаз развития сортами, в результате чего период наибольшей чувствительности растения к повреждению перестает совпадать с сезонным пиком развития паразита. У скороспелых сортов вегетация успевает завершиться до массового распространения ржавчины на посевах. Там, где не удается защитить растение от повреждений, большое значение приобретает толерантность. Толерантность к паразиту, снижение его вредоносности в большинстве случаев можно достигать за счет усиления регенерационной способности растения [2, 3, 4, 8].

Ржавчина резко снижает урожайность, зимостойкость и засухоустойчивость. Поражая вегетативные органы, ржавчина снижает налив зерна, оно становится щуплым, легковесным [6].

Грибные болезни распространяются очень быстро. Ржавчинные заболевания, которые легко переносятся воздушными потоками, преодалевают сотни километров, их называют болезнями без границ. Поэтому аграриям крайне важно вовремя выявить заболевание [7].

2.2 ВОЗБУДИТЕЛЬ ЗАБОЛЕВАНИЯ

2.2.1 БУРАЯ РЖАВЧИНА

Листовая ржавчина пшеницы наносит существенный урон производству зерна в Казахстане. Эпифитотии возникают с частотой 2 – 3 раза в 10 лет. Возбудителем листовой ( бурой ) ржавчины является Puccinia recondita Rob. Ex Desm f. sp. tritici. Класс Basidiomycetes, порядок Uredinales, семейство Pucciniaceae, род Puccinia. Облигатный паразит пшеницы и ряда дикорастущих злаков. Распространен, повсеместно в мире в местах возделывания злаков. Листовая ржавчина встречается во всех зонах выращивания озимой и яровой пшеницы. Puccinia recondita Rob. Ex Desm f. sp. tritici является двухозяйным паразитом с полным жизненным циклом, имеет пять типов спороношения. В вегетативной фазе жизненного цикла существует в виде дикариотического мицелия, эциоспор, телиоспор и урединиоспор. В уредиостадии, протекающей на растениях пшеницы и ряда дикорастущих злаков, чередуются несколько генераций, количество их зависит от климатических условий года и длительности вегетационного периода растений. Урединии одноклеточны, имеют по два гаплоидных ядра, составляющих синкарион. К концу вегетации растения образуются прикрытые эпидермисом черного цвета телии с телиоспорами. Последние двуклеточны, в каждой клетке содержится по два гаплоидных ядра. Уредо- и телейтоспоры приспособлены к перезимовке. Возбудитель зимует, главным образом, в виде мицелия в листьях озимой пшеницы и дикорастущих злаков. Весной телиоспоры прорастают, при этом наблюдается слияние гаплоидных ядер в диплоидные, мейоз и образование ростковых трубок – базидий с четырьмя одноядерными гаплоидными, различающиеся по типу спаривания базидиоспоры (см. рис. 1 и рис. 2). Для прорастания спор требуется наличие капельной влаги, поэтому развитию инфекции способствуют обильные росы. При благоприятных температурных условиях ( 15 — 25°С ), инфекция осуществляется в течение 6 – 8 часов, очередная генерация урединиоспор образуется через 7 – 10 дней. Базидиоспоры заражают промежуточного хозяина василистника ( Thalictrum minus, Thalictrum speciosissium, Thalictrum flavum ), в результате чего на верхней стороне листа образуются желто – оранжевые спермогонии со спермациями ( пикниоспорами ) двух типов спаривания. При перенесении спермаций из одного спермогония в другой образуется смешанный мицелий, а в результате возникновения анастомозов

образуются дикариотические клетки – эциоспоры, заражающие пшеницу. Гриб преимущественно имеет неполный жизненный цикл, размножается в основном вегетативно, хотя в некоторых районах ( Украина, Кавказ и др.) виды Thalictrum имеют широкое распространение и, таким образом, половой процесс может играть некоторую роль в возобнавлении и изменчивости популяции. В Восточной Сибири промежуточным хозяином может являтся лещица ( Isopyrum fumaroides ). В сентябре часть телиоспор прорастает , базидиоспоры заражают лещицу и дают зимующий мицелий. На Дальнем Востоке промежуточным хозяином может служить ломонос ( Clematis manchurica ). Наибольшее развитие болезни наблюдается в фазе цветения пшеницы. Урединиоспоры распространяются ветром. Показано, что на территории Европы существует единая популяция патогена, а популяция Западной Сибири в большей мере не зависима от европейской. Это подтверждается данными изучения структуры популяций по вирулентности и наблюдениями переноса спор воздушными массами [6, 15, 17].

2.2.2 СТЕБЛЕВАЯ, ИЛИ ЛИНЕЙНАЯ РЖАВЧИНА

Встречается повсеместно, но более вредоносна на Дальнем Востоке, Северном Казахстане, Северном Кавказе и некоторых западных районах Украины, Белоруссии и в Прибалтике. Вначале на стеблях, листовых влагалищах, колосовых чешуйках и иногда на остях появляются ржаво – бурые продолговатые, линейные, часто слитые между собой пылящие подушечки – уредопустулы. Позже, в конце вегетации пшеницы, в местах образования уредопустул и рядом с ними формируются черные выпуклые, продолговатые, часто в виде сплошных линий подушечки – телиопустулы. Они разрывают эпидермис и выступают из трещин стеблей, листьев и листовых влагалищ.

Возбудитель болезни – двудомный гриб Puccinia graminis Pers. f.sp. tritici Erikset Henn., который, кроме пшеницы, в спермогониальной и эцидиальной стадиях поражает барбарис ( Berberis L. ) и магонию ( Mahonia Nutt ). На листьях этих растений обычно в мае образуются одиночно или небольшими группами шаровидные до 130 мм в диаметре темно – желтые спермогонии, в которых формируется большое количество мелких светлых одноклеточных спор – спермаций. При помощи последних происходит оплодотворение других спермогониев, что иногда приводит к образованию новых физиологических рас и биотипов гриба. Через несколько суток после появления спермогониев с нижней стороны листьев барбариса и магонии, а иногда на черешках и молодых побегах появляются цилиндрические с отогнутыми краями беловато – желтые, 2 – 5 мм в диаметре подушечки – эцидии, расположенные округлыми или продольными группами. В них в виде цепочек формируются шаровидные или округло – тупомногогранные, размером 14 – 22х12 – 18 мкм эцидиоспоры ( весенние споры ), содержимое которых желтой окраски, а оболочка бесцветная, в верхней части

утолщенная, покрытая мелкими бородавочками. Разлетаясь, эцидиоспоры попадают на растения пшеницы, где прорастают при наличии капельной влаги и температуры от 5 — 24°С ( оптимум 17 – 19°С ). В местах прорастания эцидиоспор и внедрения их ростков в ткани растения развивается грибница, из которой формируются уредопустулы с уредоспорами. Уредоспоры, гриба одноклеточные эллипсоиднве или продолговато – яйцевидные, желтые, размером 20 – 42х14 – 22 мкм, их оболочка покрыта шипиками. Прорастают уредоспоры в капельной влаге при температуре от 1 до 30°С ( оптимум 18 – 20°С ).

В период вегетации растений гриб может дать несколько поколений уредоспор ( развитие одной уредогенерации при 20°С длится около 7 дней), чем и объясняется быстрое нарастание заболевания на посевах пшеницы. К концу вегетации пшеницы на стеблях, листьях и листовых влагалищах образуются телиопустулы с телиоспорами. Последние двухклеточные, гладкие, коричневые, удлиненно – булавовидные, размером 35 – 60х12 – 24 мкм, с темно – бурой оболочкой, утолщенной у вршины, расположенные на удлиненных желтоватых ножках. Телиоспоры зимуют на остатках пораженных растений и прорастают только весной при температуре 9 – 25°С ( оптимум 18 – 22°С ) и влажности воздуха 95 – 100%. Из телиоспор образуются базидии с базидиоспорами. Базидии бесцветные, четырехклеточные, по бокам их вырастают коротенькие ножки ( стеригмы ) с одной бесцветной шарообразной базидиоспорой. Базидиоспоры легко отделяются и разносятся ветром на большие расстояния. Попав на листья барбариса или магонии, они прорастают и дают начало новой грибнице, на которой формируются спермогонии и эцидии.

В настоящее время идентифицировано более 300 рас возбудителя стеблевой ржавчины. Чаще встречаются 21 – я и 34 – я расы.

Стеблевая ржавчина сильнее проявляется на ранних посевах озимых и поздних посевах яровых пшениц. Внесение калийных удобрений, особенно в смеси с фосфорными, повышает устойчивость растений против заболевания. Чрезмерное внесение удобрений, наоборот, способствует его развитию. Стеблевая ржавчина очень вредоносна. Она нарушает водный баланс растений и усиливает транспирацию, ослабляет фотосинтез, снижает интенсивность образования и оттока углеводов, уменьшает рост и задерживает развитие растений.

При сильном развитии заболевания возможно полегание посевов пшеницы. Поражение стебля под колосом вызывает истекание зерна, вследствие чего оно образуется щуплым, с очень низкими хлебопекарными качествами. Болезнь может быть причиной недобора 60 – 70% урожая [15, 17].

2.2.3 ЖЕЛТАЯ РЖАВЧИНА

Поражает пшеницу, рожь, ячмень, костер, пырей, житняк, ежу сборную и другие злаки, но наибольший вред причиняет пшенице в нечерноземной зоне. Часто болезнь развивается на посевах пшеницы в высокогорных районах Северного Кавказа, Закавказье, Средней Азии, Алтайском крае, а в отдельные годы в полесье и лесостепи Украины, в Белоруссии и республиках Прибалтики. Появляется на листьях, влагалищах, иногда на стеблях, колосковых чешуйках и даже на верхних частях зерен, выступающих из колосковых чешуек.

Типичным признаком заболевания является появление лимонно – желтых продолговатых полос в виде пунктирных линий, состоящих из уредопустул. Иногда уредопустулы размещаются группами, образуя на листьях пятна с хлоротичной каймой. Позже в местах поражения появляются темно – бурые или почти черные, не прорывающие эпидермис телиопустулы, расположенные в виде тонких черно – коричневых полос.

Возбудитель болезни – гриб Puccinia striiformis West. (син. Puccinia glumarum Eriks. ), имеющий только уредо – и телиостадию. Спермогониальная и эцидиальная стадии у него не выявлены. Уредопустулы состоят из одноклеточных уредоспор. Они ярко – желтые, шаровидные или слегка удлиненные, размером 14 – 36х13 – 23 мкм, с бесцветной шиповатой оболочкой. Телиопустулы двухклеточные, продолговато – булавовидные, бурые, размером 30 – 57х15 – 24 мкм, с короткой бесцветной ножкой. Хотя телиостадия гриба образуется ежегодно, в распространении болезни она не имеет значения. Возбудитель желтой ржавчины развивается и зимует на пшенице и диких злаков в виде уредогрибницы, на которой осенью и весной образуются уредопустулы с уредоспорами. Последние легко разносятся ветром на большие расстояния.

Прорастают уредоспоры при высокой относительной влажности ( около 100% ) и температуре воздуха от 1 до 25°С ( оптимум 11 – 13°С ). Во время прорастания из них появляется нитевидный росток, который проникает в ткани растений и развивается в уредогрибницу. Инкубационный период от заражения до появления новых уредопустул при температуре 10 – 15°С длится 10 – 11 дней. Известно более 60 рас возбудителя желтой ржавчины, из них на пшенице в России обнаружено 11, среди которых наиболее распространены расы 20, 25 и 31.

Весной желтая ржавчина сначала развивается на нижних, а позже и верхних листьях. При интенсивном развитии болезни во время цветения или молочной спелости значительная часть листьев желтеет, усыхает и опадает. Особенно опасно поражение колоса, вследствие чего зерно наливается плохо, подсыхает, образуется щуплым и легковесным. Наиболее интенсивное развитие болезни наблюдается в чрезмерно ранних посевах озимых, которые, кроме того, являются резерваторами инфекции на следующий год. Источниками заражения могут быть также пораженные всходы падалицы

озимой пшеницы, ржи и злаковых трав, растущих по обочинам дорог и лесополос [15, 17].

2.3 ГЕНЕТИКА УСТОЙЧИВОСТИ

Рассматривая механизмы активных защитных реакций растений, вовлекающихся в формирование устойчивости к заражению, скорее всего, можно говорить о развитии устойчивости к фитопатогенам как к частному случаю из разнообразных стрессовых факторов.

Чаще всего активация механизмов устойчивости связана с индукцией или усилением экспрессии генов белков, задействованных в системе ответа растений на патоген. Инфицирование возбудителями разных болезней является распространенным стрессовым воздействием, вызывающим обычно каскад метаболических изменений, которые можно суммировать как мультикомпонентные ответы. Они включают накопление полисахаров, фенолов, лигнина, суберина, фитоалексинов, фитонцидов и ферментов, участвующих в их синтезе, гидроксипролинбогатых белков, индукцию синтеза и увеличения уровня так называемых «pathogenesis – related» ( PR) – белков, в частности хитиназ, глюканаз, ингибиторов протеиназ, других стрессовых белков, например, пероксидаз и так далее.

Ингибиторы протеиназ обладают высокой специфичностью к связыванию протеиназ патогена, в силу чего последние теряют свою активность. В этом и заключается их важное значение в защите растений от фитопатогенов. Как правило, в здоровых растениях уровень синтеза многих РR – белков крайне низкий, обнаруживаются следовые количества этих белков. Хотя некоторые их изоформы могут накапливаться конститутивно, но при заражении фитопатогенами уровень экспрессии генов PR – белков возрастает в десятки и сотни раз, причем экспрессия, например генов хитиназ и глюканаз, обычно индуцируется координировано, что составляет важную часть защитной стратегии растений, направленной на лимитирование роста клеток многих грибов [15].

2.3.1 ВЕРТИКАЛЬНАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ

Факторы вертикальной устойчивости к листовой ( бурой ) ржавчине обозначают как Lr. Среди них выделяют гены ювенильной ( устойчивость проростков ) и возрастной устойчивости. Наиболее длительную устойчивость пшеницы к болезни обеспечивают гены возрастной устойчивости. Кроме того, этот тип устойчивости можно относительно легко комбинировать с ювенильной устойчивостью и тем самым достигать более длительной устойчивости пшеницы к листовой ржавчине. Линии с генами возрастной устойчивости обладают и расоспецифической устойчивостью.

В настоящее время идентифицировано 35 генов устойчивости к бурой ржавчине и их аллелей, известна хромосомная локализация многих из них. В исследованиях по определению генетической обусловленности устойчивости

пшеницы к листовой ржавчине наиболее часто встречаются случаи контроля данного признака одним или несколькими генами ( монофакторное и дифакторное наследование устойчивости, вертикальная устойчивость ). Аллели устойчивости, как правило, доминируют над аллелями восприимчивости, и устойчивость наследуется по простым менделевским правилам. В ряде случаев установлено, что устойчивость находится под контролем более шести генетических факторов. В небольшом числе исследований были обнаружены различные виды взаимодействия генов, что приводит к изменению менделевских отношений, характерных для двух факторов. При этом наследование устойчивости осуществляется по типу эпистатических и комплиментарных взаимодействий [4, 11].

2.3.2 ГОРИЗОНТАЛЬНАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ

Горизонтальная устойчивость, обусловленная совместным действием большого количества генов, формирующих общую защитно — восстановительную систему организма, обычно наследуется промежуточно. В ряде работ отмечается наличие сцепления генов. Большие исследования по генетике устойчивости были проведены в СибНИИСХ. Были изучены стабильно устойчивые изогенные линии пшеницы, содержащие гены устойчивости Lr9 и Lr19, сложный гибрид из Австралии ( К- 54049) и Гибрид 21, а также хромосомы контролирующие устойчивость этих образцов. Исследования по выявлению эффективных генов устойчивости проводились также во Всероссийском НИИ Фитопатологии. Были изучены наборы изогенных линий пшеницы сорта Thatcher с генами ювенильной (Lr1, Lr2а, Lr2с, Lr3, Lr3ка, Lr9, Lr11, Lr16, Lr17, Lr24, Lr26, Lr30 ) и возрастной устойчивости ( Lr12, Lr13, Lr22a, Lr22b, Lr33, Lr34, Lr37, Lr34+Lr13 ). В результате были выявлены наиболее эффективные гены устойчивости для различных регионов страны. В частности, было показано, что наиболее устойчивыми линиями для условий Центрального региона являются линии несущие гены Lr22a, Lr34, Lr37 [4, 11].

2.4 ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ

Значительная роль в селекции на устойчивость принадлежит исходному материалу. В качестве источников устойчивости используются устойчивые сорта или изогенные линии сортов с генами устойчивости. Все источники устойчивости значительно различаются как по степени устойчивости, так и по изученности генетики устойчивости. Для селекции на устойчивость к листовой ржавчине могут быть использованы такие сорта как Ранняя 12, Олимпия, Зирка, Обрий, Донская безостая, Белорусская 80, Харьковская 93. Кроме того, возможно использование сортов и линий зарубежной селекции. Наиболее перспективны следующие: Sabre, TB/55 SP 6628 ( Австралия ), Голубая А, ISWR N 309 – 6, Kenhi ( Канада ), Gustin x ND

264 – 13, Gustin x D 142 N 12-14, Sunnan ( Швеция ), РПГ 48/49 ( Германия ), Н – 1444 ( Норвегия ), NS – 476, GK – B10 ( Югославия ).

Большинство перечисленных сортов универсально устойчивы, а устойчивость их определяется генами – Lr9 или Lr19.

Среди образцов, устойчивых к отдельным расам патогена, есть формы с известными генами устойчивости. Например, сорт Sonora 64 ( Мексика ) содержит ген Lr1, Lee ( США ) – два гена Lr10 и Lr24. Более чем у одной трети устойчивых сортов устойчивость контролируется геном Lr23/3: Kenya Fanner ( +Lr10 ), Kenya 337, Lee ( +Lr10 ), Timstein ( +Lr10 ), NS4R, Rocta ( +Lr10 ), Grym. Практическое применение нашли также сорта источники устойчивости – Дмитриевка 5 – 14 ( +Lr10 ), Gabo ( +Lr10 ), Норех, Гибрид – 21 ( +Lr10 ). Ряд сортов, длительное время сохранявших устойчивость к листовой ржавчине, в последние годы потеряли ее.в частности это такие сорта как Кальян Сона, Pv – 18, Sonora 64, Penjamo 62, содержащие ген Lr23. Кроме перечисленных существуют линии, в настоящее время слабо изученные, несущие гены LrTt1, LrTt2 ( полученные от Tr. timopheevii ) и ген LrM2 ( от гибридной комбинации Саратовской 29 х И410407 ) [4, 11].

2.5 МЕТОДЫ СЕЛЕКЦИИ

2.5.1 ВНУТРИВИДОВАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ

Основным методом создания популяций для отбора является гибридизация. Внутривидовая гибридизация может осуществляться по простой межлинейной схеме, сложной ступенчатой и беккросной. Схемы гибридизации, применяемые в селекции на устойчивость, зависят от генетического контроля данного признака. При моногенном наследовании признака устойчивости весьма эффективной становится беккросная селекция. При этом рецепиентом признака устойчивости выступает сорт с высокими показателями по ряду хозяйственно – ценных признаков. После пяти – шести возвратных скрещиваний сорт – рецепиент становится изогенной устойчивой линией. Так, в широко известный засухоустойчивый сорт сильной мягкой пшеницы Саратовская 29 были введены отсутствующие у него гены устойчивости к агрессивным расам листовой ( Lr ), стеблевой ржавчины ( St ), мучнистой росы ( Pm ). Донором иммунитета послужила синтетическая гексаплоидная пшеница ( AAGGDD ). Она включает виды T/timofeevii – геном AAGG ( Швеция ) и T.tauschii DD ( Болгария ). В результате 8 -9 возвратных беккроссов были созданы аналоги сорта пшеницы Саратовской 29, различающиеся по скороспелости и устойчивости к болезням при посеве в поле и искусственном заражении. Созданные иммунные аналоги сорта Саратовская 29 являются уникальными, вследствие одновременной устойчивости к трем видам грибных болезней и сохранению свойств сильной пшеницы. Эти аналоги используются в селекции как доноры при выведении новых устойчивых конкурентоспособных на мировом рынке сортов. Также они могут быть использованы непосредственно в сельскохозяйственном

производстве в зоне районирования сорта Саратовской 29 после необходимого размножения семян.

Селекцию на горизонтальную селекцию ведут обычно традиционным методом отбора из простых гибридных популяций, который и длителен, и сопряжен с риском потери части генов. В большинстве случаев техника гибридизации не зависит от схемы скрещиваний и включает всебя следующие операции:

Посев родительских форм в питомнике гибридизации в сроки, обеспечивающие их одновременное цветение. Этого можно достичь, высевая родителей в три срока.
Предотвращение самоопыления материнской формы. Это условие соблюдается путем кастрации материнских растений и установки изоляторов предотвращающих переопыление. Техника кастрации состоит в подрезе колосковых чешуй и удаления незрелых пыльников у молодого колоса ( на 1/3 показавшийся из влагалища листа ).
Опыление пыльцой отцовского сорта. Производят через несколько дней после начала цветения материнского сорта [14].

2.5.2 ОТДАЛЕННАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ

В селекции пшеницы широко используется межвидовая гибридизация. В гибридизацию вовлекают полбу, тургидум, пшеницу Тимофеева, используют скрещивания твердой и мягкой пшениц. Многие гены устойчивости к листовой ржавчине получены от диких видов рода T. triticum. Также в селекции пшеницы используют межродовую гибридизацию. Биологическое разнообразие видов семейства Poaceae, обладающих полезными генами для мягкой пшеницы, охватывает виды рода Triticum L., Aegilops L., Agropyron Gaertn, Secale L., Hordeum L. Однако наличие барьера нескрещиваемости для некоторых видов, стерильность гибридов в результате отсутствия конъюгации между пшеничными и чужеродными хромосомами затрудняют интрогрессию. Стратегия, которую необходимо применять в каждом конкретном случае скрещивания, зависит от наличия или отсутствия гомологичных геномов скрещиваемых видов и числа хромосом у них. К настоящему времени разработаны стандартные методы, облегчающие перенос генов от видов, не имеющих родственных геномов с мягкой пшеницей. Одни из них основаны на методах хромосомной инженерии, другие – на методах генетического контроля мейотической рекомбинации, третьи – на методах генной инженерии. Результатом этого является тот факт, что из более чем 40 известных на сегодняшний день генов устойчивости пшеницы к листовой ржавчине – 30 интрогрессированы из родственных видов. Более 300 сортов мягкой пшеницы несут 1B/1R хромосомную транслокацию, определяющую устойчивость к фитопатогенам и продуктивность. В селекции мягкой пшеницы на устойчивость к листовой ржавчине используют скрещивания гексаплоидных и октоплоидных

тритикале с целью получить 1BL/1RS транслокацию, которая детерминирует устойчивость к болезням. При скрещивании тритикале с пшеницей спонтанно происходит процесс, получивший название misdivision, заключающийся в одновременном присутствии унивалентных хромосом 1B и 1R, разрыва их по центромерам и слияния в новую 1B/1R хромосому. Однако в результате подобных скрещиваний случаются и другие транслокации, которые могут приводить к появлению нежелательных признаков [14].

2.5.3 МУТАГЕНЕЗ

Для успешного развития селекции желательно повышение разнообразия источников хозяйственно – ценных признаков. Поэтому индуцированный мутагенез, и в первую очередь химический как наиболее эффективный, играет важную роль при создании исходных популяций для отбора. В исследованиях института биохимической физики имени Н. М. Эмануэля РАНН под действием этиленимина были получены на мягкой озимой пшенице некоторые селекционно – ценные признаки, не характерные для этой культуры. В работах института при оптимальном сочетании мутагена, его доз и исходного сорта мягкой озимой пшеницы, было выделено значительное количество мутантов, устойчивых к листовой ржавчине до12% по отношению ко всем выделенным мутантам. В результате возникновения множественных мутаций, обнаружены формы, сочетающие в одном мутанте устойчивость к двум или нескольким фитопатогенам на фоне других ценных мутантных признаков: высоких адаптивных свойств, высокой урожайности, высоких хлебопекарных качеств, устойчивости к полеганию. Особую ценность представляют мутанты, обладающие комплексной устойчивостью к трем или пяти фитопатогенам и устойчивостью к сапрофитам (расонеспецифическая устойчивость). Данные мутанты также служат непосредственным исходным материалом при создании новых сортов. В ряде случаев данный материал не нуждается в селекционной доработки и является готовым сортом, требующим только размножение.

Применение химического мутагенеза для создания доноров новых и редких признаков у озимой мягкой пшеницы, а также для непосредственного использования мутантов с комплексами ценных признаков в виде хозяйственно – ценного материала при создании новых сортов без существенной доработки этого материала сокращает селекционный процесс на 3 – 4 года [13].

2.5.4 ХРОМОСОМНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Хромосомная инженерия – это замещение хромосом на внутривидовом, межвидовом и межродовом уровнях. Эта технология открывает новые возможности в селекции, когда нужно подправить отдельные признаки, а не реконструировать весь организм, комбинируя в процессе гибридизации тысячи генов. В мире уже известно около 30 полных замещенных серий у

пшеницы. В ряде случаев, когда исчерпана внутривидовая изменчивость, уже не удается усилить до необходимого уровня селекционируемые признаки, прежде всего устойчивость к заболеваниям. Тогда приходится взаимствовать необходимые гены у других видов, родов растений, в том числе и у их диких сородичей. Придание мягкой гексаплоидной пшенице Triticum aestivum устойчивости к различным видам ржавчины, мучнистой росе и другим видам заболеваний оказалось возможным при замещении двух пар ее хромосом 5В и 6В на хромосомы от тетраплоидной пшеницы Triticum timopheevi [11].

2.5.5 АЛЛОЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ ГИБРИДЫ

Расширение адаптационных возможностей у пшеницы достигается путем создания новы генетических систем в форме гибридов аллоцитоплазматической пшеницы, у которых эффект ядерно – цитоплазматических взаимодействий детерминирует ряд свойств, обеспечивающих более высокий уровень адаптации растений к стрессовым факторам среды. Аллоцитоплазматические гибриды пшеницы (АЦПГ) получают методом возвратных скрещиваний (не менее шести беккроссов) и отбором. Они представляют собой новый синтетический тип растений, у которых ядро Triticum aestivum L. нормально функционирует в чужой цитоплазме. Перемещение ядра пшеницы в инородную цитоплазму может вызвать в ряде случаев изменение количественных признаков и биологических свойств растений. Дифференцированное проявление этих изменений дает основание считать, что генам, детерминирующим тот или иной признак, соответствуют определенные плазмагены или другие микроструктуры цитоплазмы, обеспечивающие контроль и передачу определенных генопродуктов. Нарушение этого ядерно – цитоплазматического соответствия приводит к изменению величины признака или его непроявлению, например, под влиянием митохондриального генома изменяется устойчивость к патогенам [9, 10].

3.1 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К ФИТОПАТОГЕНАМ

3.1.1 ГИПОТЕЗА ФЛОР «ГЕН НА ГЕН»

Растения и возбудители болезней в природе эволюционно тесно связаны друг с другом. Взаимодействие генов растений и паразитов экспериментально подтвердила американский фитопатолог Флор, выдвинувшая гипотезу «ген на ген». На основе своих исследований Флор сделала вывод о том, что каждому гену устойчивости или восприимчивости растения-хозяина соответствует определенный комплементарный ген вирулентности или авирулентности паразита. Если аллели генов устойчивости и вирулентности доминантны, то растение устойчиво к болезни. Если одна из взаимодействующих аллелей или обе из них находятся в гомозиготном рецессивном состоянии, то наблюдается восприимчивость к

заболеваниям. Исходя из этого, Флор установила, что гены устойчивости доминантны, а вирулентности рецессивны.

Считаю, что в ряде случаев гену устойчивости растения могут соответствовать несколько генов патогенности паразита. Возможна обратная ситуация, когда один ген патогенности соответствует нескольким генам устойчивости.

Отношения «ген на ген» являются результатом сопряженной эволюции паразита и растения-хозяина. Длительная совместная эволюция приводит к развитию взаимной толерантности. Сильно страдающие от поражения растения не выдерживают конкуренцию с теми, которые страдают меньше. В результате естественного отбора ви способен повышать свою выносливость. Генотипы, лучше адаптированные к экологическим условиям среды оказываются более выносливыми и к поражению болезнями. С одной стороны естественный отбор благоприятствует тем мутациям хозяина, которые ставят паразита в невыгодное положение. С другой стороны он благоприятствует тем мутациям паразита, которые усиливают способность паразита к воспроизводству по сравнению со способностями растения-хозяина. В этом взаимодействии сначала происходит увеличение частот генов устойчивости, затем частот генов вирулентности. Последние преодолевают устойчивость хозяина.

На основе гипотезы Флор Х. Пирсоном был разработан метод идентификации генов устойчивости с помощью «тестирующих» рас патогенов с известной вирулентностью для различных схем хозяин-паразит. Некоторые авторы высказали целый ряд ограничений применения этого метода. Рядом исследователей было показано, что гены устойчивости могут быть тесно сцеплены, в том числе в сложных локусах (полигенный локус) или близко располагаться в хромосоме с другими генами. При этом в блоки могут входить гены , контролирующие устойчивость к разным болезням. В результате мутации гена в блоке устойчивость к одним болезням может сцеплено наследоваться с восприимчивостью к другим.

В одинаковых локусах гомологичных хромосом может наблюдаться локализация как одних и тех же генов, так и аллельных, определяющих их различное состояние.

Предполагают, что эволюция генов устойчивости растений к болезням происходит постепенно или неожиданно в результате эффекта транслокации.

3.1.2 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КОНЦЕПЦИИ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ РАСТЕНИЙ ХОЗЯЕВ И ПАРАЗИТОВ

Выдвинуто много различных гипотез и теорий, но они приложены к определенному кругу явлений иммунитета, не охватывая его в целом.

Все известные в настоящее время концепции взаимоотношений растений-хозяев и паразитов основываются на известных механизмах устойчивости к болезням: отсутствие в растениях необходимых для паразита питательных веществ, сверхчувствительность, выделение растениями

токсичных ядовитых для паразитов антибиотических веществ, взаимодействие белков паразитов и растений-хозяев.

В 1956 году Гарбер, на основе проведенных многочисленных опытов, выдвинул «питательно-тормозящую» гипотезу иммунитета, Льюис в 1957 – гипотезу сбалансированного паразитизма и Эфромсон в 1961 году – гипотезу «неполной среды».

Эфромсон предложил генетическую модель (схему) иммунитета, согласно которой ген восприимчивости растения контролирует синтез фермента, ответственного за образование необходимых паразиту веществ:

ГЕН ХОЗЯИНА ГЕН ПАРАЗИТА

БЕЛОК-ФЕРМЕНТ БЕЛОК-ФЕРМЕНТ

НЕОБХОДИМЫЙ ПАРАЗИТУ СУБСТРАТ

Эта модель хорошо укладывается в систему Флор «ген на ген», то есть ген, определяющий вирулентность паразита комплементарен гену устойчивости хозяина.

Вторая модель основывается на теории регуляции белкового синтеза Жакоба и Моно. Она предполагает, что устойчивость контролируется функциональной системой, состоящей из генов регулятора, оператора, репрессора и индуктора. Устойчивость обусловлена действием регуляторных генов растения, которые репрессируют синтез необходимых паразиту веществ. Ген вирулентности паразита, в свою очередь, контролирует синтез веществ, блокирующих репрессор. Некоторые исследователи считают, что эту репрессию можно также снять средовыми воздействиями на растение, например, повышенными температурами.

Как считает Метлицкий, подход к питательно-тормозящей гипотезе Гарбера с позиции индуцированной устойчивости позволил бы значительно расширить представления о защитном механизме растений, который может состоять не только в отсутствии необходимых паразиту соединений питательной ткани, но и исключением из обмена присутствующих в растении веществ, в ответ на инфицирование авирулентным штаммом или расой. Питательно-тормозящая гипотеза или гипотеза неполной среды может быть применена для объяснения иммунитета к высокоспециализированным паразитам.

Среди индуцированных гипотез иммунитета, основанных на регуляции белкового синтеза, следует выделить гипотезу выдвинутую Хайтерфуссом. Он считает, что взаимоотношения растения-хозяина и паразита обусловлены действием оператора, репрессора, регулятора растений и эффектора паразита. Регуляторный ген контролирует синтез репрессора, который, соединяясь с геном оператором, ингибирует образование защитных веществ. При введении несовместимого патогенна, репрессор, соединяясь с метаболитом патогена (эффектором), снимает репрессию с гена-оператора, что приводит к образованию защитных веществ.

При реакции сверхчувствительности цепь биохимических превращений в клетке, приводящая к образованию фитоалексина,

индуцируется специфическим метаболитом гриба. В незараженной клетке растения репрессор блокирует ген-оператор. При заражении авирулентной расой смпецифический метаболит гриба связывает рецептор и дает возможность оператору включить процесс синтеза специфических ферментов, участвующих в реакции сверхчувствительности.

По Фавре, гены устойчивости часто сцепленые в изофенные блоки, контролируют синтез репрессоров. Наряду с генами, контролирующими синтез репрессоров, у растений имеется структурный ген, который контролирует синтез требующихся для паразита питательных веществ. В незараженной клетке репрессор подавляет транскрипцию структурного гена и питательные вещества не синтезируются. Паразит может развиваться в том случае, если его метаболиты снимают репрессию со структурного гена и растение синтезирует для паразита питательные вещества. Гипотеза Фавре предполагает, что растение устойчиво ввиду отсутствия в клетках необходимых для паразита веществ, а вирулентность в результате снятия репрессии со структурного гена, приводит к восприимчивости. Однако заражение авирулентной расой может индуцировать устойчивость к вирулентной расе. Таким образом, гипотеза Фавре может рассматриваться как частная, соответствующая некоторым случаям взаимоотношения растений и их паразитов.

Метлицким, Дьяковым и Озерцовской в 1973 году предложена гипотеза «взаимной индукции» как новая гипотеза иммунитета. Согласно этой гипотезе гены устойчивости растений контролируют синтез специфических веществ (индукторов), которые, соединяясь с соответствующими веществами (рецепторами) на мембранах паразита, освобождают выход метаболитов паразита. Последние в зараженных клетках растения индуцируют синтез фитоалексинов. Синтез рецептора контролируется генами вирулентности, гены устойчивости растений непосредственно не участвуют ни в синтезе, ни в регуляции синтеза фитоалексинов, поскольку при наличии внешнего индуктора любой генотип обладает способностью к синтезу фитоалексинов. Гены вирулентности непосредственно не участвуют в синтезе индуктора, поскольку они имеются как у вирулентных, так и у авирулентных рас. Устойчивость к паразиту определяется скоростью накопления фитоалексинов в зараженных клетках до летальной для паразита концентрации. При заражении вирулентной расой растение не синтезирует веществ, повреждающих мембрану паразита, или паразит не имеет на мембранах рецептора связывающего индуктор растения. В этом случае индуктор паразита не будет вызывать образование фитоалексинов.

Ван дер Планком в 1981 году выдвинута гипотеза иммунитета «белок на белок». Сущность этой гипотезы состоит в том, что белковые продукты генов «восприимчивости» растений и «вирулентности» паразита в прцессе патогенеза способны полимеризоваться. Это обеспечивает паразиту биотрофный тип питания. Мутация одного из генов «восприимчивости»

изменяет структуру соответствующего белка. Вследствии чего он теряет способность полимеризоваться с белком паразита. Это вызывает защитные реакции у растения и обуславливает несовместимость растения и паразита. Изменение гена «авирулентности» в ген «вирулентности» приводит к тому, что кодирующий белок паразита полимеризуется с белком растения и устанавливается совместимость. Эта гипотеза согласуется с концепцией Ван дер Планка о вертикальной и горизонтальной устойчивости и объясняет ее с позиции молекулярной биологии. Концепция Ван дер Планка выдвинула понятия о больших и малых, майор и минор генах, моно-, олиго- и полигенах, генах расоспецифической и расонеспецифической устойчивости.

3.1.3 Lr-ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ К ВОЗБУДИТЕЛЮ БУРОЙ ЛИСТОВОЙ РЖАВЧИНЫ

В настоящее время идентифицировано 44 гена устойчивости к бурой ржавчине, 45- к стеблевой, 28-к желтой ржавчине. Они внесены Макинтошем в каталог генов устойчивости пшеницы к возбудителям инфекционных заболеваний и вредителям.

Обширная информация об Lr-генах представлена в работе Макинтоша, Веллинга и Парка (1995). В ней указано, что Lr1, Lr2, Lr3 впервые идентифицировал Ауземус в 1946 году. Гены локализованы: Lr1в хромосоме 5D, Lr2-в 2DS, Lr3-в 6B. Lr2 имеет три аллели – a, b, c. Носителями Lr1 являются сорта Малакоф, Сонора 64, Тобари 66, а Lr2а – Медитераниан, Демократ; Lr2b – Карина; Lr2c – Бревит и Лорос. Ген Lr3 имеет три аллели: a, bg, ka. Lr3a – Демократ, Медитераниан, Кук, Хана, Безостая 1, Мироновская 808; Lr3bg – Баге; Lr3ka – Клейн Аниверсарио.

Гены Lr4, Lr5, Lr6, Lr7, Lr8 идентифицированы Пирсом в 1961 году.

Lr9 интрогрессирован в пшеницу из Aegilops umbellulatum. Макинтошем установлено, что этот ген локализован в хромосоме 6B. Носителями этого гена являются сорта Трансфер, Абе, Артур 71, Оазис, Кокер.

Lr10 впервые идентифицировал Андерсон в 1961 году. Он локализован в хромосоме 1А. носителями этого гена являются сорта Ли, Габо, Селкирк.

Lr11впервые идентифицировал Солиман в 1958 году. Он локализован в хромосоме 2А. носители этого гена сорта Болгария 88, Оазис и другие.

Lr12 впервые идентифицировал Дик в 1966 году. Он локализован в хромосоме 4В и имеется у сортов Опал, Чайниз Спринг и других.

Lr13 также идентифицирован Диком в 1966 году. Он локализован в хромосоме 2BS и имеется у сортов Маниту, Ред Бобс, Атлас 66, Фронтана.

Lr14 идентифицирован Макинтошем в 1967 году. Локализован в хромосоме 7В и имеет две аллели: a, b. Этот ген имеется у сортов Хоуп, Селкирк, Мария Эскобар, Бовие.

Lr15 также идентифицировал Макинтош в 1968 году. Локализован в хромосоме 2D. Этот ген имеет сорт Кения w1483.

Lr16 идентифицировал Самборский в 1968 году. Локализован в хромосоме 4В, этот ген имеют сорта Эксчендж, Циано 79, Этуаль де Шуази.

Lr17 идентифицировали Дик и Самборский в 1968 году. Локализован в хромосоме 2AS, имеется у сортов Клейн Люцеро, Торим 73, Инуа 76.

Lr18 также идентифицировали Дик и Самборский в 1968 году. Локализован в хромосоме 5BL. Носителями этого гена являются сорта Южная Африка 43, PI. 159106.

Lr19 впервые интрогрессировал в пшеницу Броудер от Agropyron elongatum в 1972 году. Локализован в хромосоме 7DL и имеется у сортов Агата, Агрус.

Lr20 впервые идентифицирован Броудером в 1972 году. Локализован в хромосоме 7AS, имеется у сортов Аксминстер, Тью, Кения w744, Нормандия, Тиммо.

Lr21 интрогрессирован в пшеницу из Aegilops taushii в 1974и году. Локализован в хромосоме 1D, имеется у сортов Тетра Кантач, РЛ 5406. Впервые идентифицирован Роуландом и Кербером в 1974 году.

Lr22 впервые идентифицирован Роуландом и Кербером в 1974 году. Существует две аллели этого гена: a, b. Локализован в хромосоме 2DS и имеется у сортов Маниту, RL 6044.

Lr23 впервые идентифицирован Макинтошем и Диком в 1975 году. Локализован в хромосоме 2BS и имеется у сортов Мадлен, Канна.

Lr24 впервые идентифицирован Макинтошем в 1976 году. Локализован в хромосоме 3D и имеется у сортов Торрес, Васко, Кокер.

Lr25 впервые идентифицирован Макинтошем в 1988 году. Локализован в хромосоме 4BS и имеется у сортов Трансфер и других.

Lr26 впервые идентифицирован Макинтошем в 1988 году. Локализован в хромосоме 1В и имеется у сортов Аврора, Кавказ, Селекта, Скороспелка 35.

Lr27 впервые идентифицирован Макинтошем и Сингом в 1984 году. Локализован в хромосоме 4BS и имеется у сортов Сарагоса, Юпатеко. Этот ген комплиментарно взаимодействует с Lr31.

Lr28 впервые идентифицирован Макинтошем в 1982 году. Локализован в хромосоме 4AL и имеется у сортов Санленд и других.

Lr29 впервые идентифицирован Макинтошем в 1988 году. Локализован в хромосоме 7DS и имеется у сортов Тетчер, RL 6080.

Lr30 впервые идентифицирован Диком и Кербером в 1981 году. Локализован в хромосоме 4AL и имеется у сортов Тэтчер, Терензиро.

Lr31 впервые идентифицирован Сингом и Макинтошем. Локализован в хромосоме 4BS и имеется в тех же сортах где и Lr27.

Lr32 впервые идентифицирован Кербером в 1987 году. Локализован в хромосоме 3D и имеется у сортов Тетра Кантач и других.

Lr33 впервые идентифицирован Диком в 1987 году. Локализован в хромосоме 1В и имеется у сортов PI 125387 и других.

Lr34 впервые идентифицирован Диком в 1987 году. Локализован в хромосоме 7D и имеется у сортов Пеньямо, Эсмеральда 86, Виктория 81.

Lr35 впервые идентифицирован Кербером и Диком в 1990 году. Локализован в хромосоме 2В и имеется у сортов RL 5711 и других.

Lr36 впервые идентифицирован Двораком и Кноттом в 1990 году. Локализован в хромосоме 6BS и имеется у сортов Ниипауа^*5Т, Маниту.

Lr37 впервые идентифицирован Барианной в 1991 году. Локализован в хромосоме 2AS и имеется у сортов Трайдент, Санбрай.

Lr38 впервые идентифицирован Фрибе в 1992 году. Хромосомная локализация еще не установлена. Он происходит от Agropyron intermedium. Обнаружен в сортах Тетчер^*6/Т7, RL 6090.

Lr39, Lr40, Lr41, Lr42, Lr43 происходят от Triticum taushii. Впервые идентифицированы Коксом в 1994 году.

Lr44 впервые идентифицирован Диком в1993 году. Источником этого гена является Triticum taushii. Ген локализован в хомосоме 1В.

По данным отдела фитопатологии и энтомологии СГИ в Украине эффективными генами являются Lr9, Lr19, Lr43,частично эффективными — Lr24, Lr37. Все остальные гены являются слабыми или неэффективными.

3.1.4 ЭФФЕКТИВНЫЕ СОЧЕТАНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ПШЕНИЦЫ ОТ БУРОЙ РЖАВЧИНЫ

Общепризнанной стратегией защиты посевов является создание максимально разнообразных по генам устойчивости сортов и размещение их в виде мозаик в агроценозах. В последние десятилетия усилия селекционеров привели к расширению ассортимента генов устойчивости, используемых в селекционных программах. В районированных сортах установлено присутствие 11 генов рассоспецифической устойчивости Lr12, Lr13, Lr22a, Lr34. Среди генов устойчивости, высокую эффективность сохраняет лишь LrTr (иммунитет), гены Lr19, Lr23, Lr26 постепенно теряют эффективность; большинство остальных генов уже преодолены популяциями патогена в разных регионах.

В связи с этим представляет интерес выявления комбинации генов устойчивости, обеспечивающих дополнительную защиту растений от болезни, которые могут быть использованы в селекционных программах.

Эффективность комбинации генов оценивается по типу реакции и степени поражения гибридных растений F1. Исследования проводятся в полевых и лабораторных условиях. Тип реакции определяется по шкале Майнса и Джексона (1926), степень поражения по шкале – Петерсона (1948). Исследования проводили в зоне лесостепи Западной Сибири (город Омск) 2005-2006 гг. особенностью западносибирской популяции Puccinia triticina является высокая агрессивность, основную ее часть (более 98%) составляют клоны 77 расы, поражающие большинство известных генов устойчивости.

В условиях интенсивной эпифитопии 2005 года сорта стандарты Саратовская 29, Тэтчер поразились в высокой степени (4 балла/100%). Среди набора изогенных линий сорта Тэтчер иммунитет проявили только линии с

генами Lr19, Lr28, Lr38, высокую устойчивость – линии с генами устойчивости Lr19, Lr24, Lr36 (4 балла/ 5-15%). Гены возрастной устойчивости Lr13, Lr34, Lr37 были мало эффективны (пораженность 4 балла/ 60-80%), что объяснялось высокими температурами во второй половине вегетации, не способствующими проявлению температурно зависимых генов.

На фоне интенсивной эпифитотии в полевых условиях были изучены реакции гибридов F1линии сорта Тэтчер с сочетаниями генов рассоспецифической и возрастной устойчивости. При поражении исходных линий Lr23, Lr26, Lr13, Lr34, Lr37 на 3-4 балла/ 60-80% у гибридов F1проявлялись следующие реакции:

гибриды F1 комбинации Lr23xLr26 с генами рассоспецифической устойчивости поражались в умеренной степени (3 балла/50%), что свидетельствует о невысокой эффективности сочетания генов;
в растениях F1 с комбинацией генов рассоспецифической и возрастной устойчивости происходило снижение балла иммунности и степени поражения: Lr23xLr13 (2 балла/20%), Lr23xLr34 (3 балла/30%), Lr26xLr13 (2 балла/60%), Lr26xLr34 (3 балла/30%);
в растениях гибридов с генами возрастной устойчивости наименьшее поражение наблюдалось в комбинации Lr13xLr34 (2 балла/20%), более высокое в комбинации – Lr13xLr37 (3 балла/50%);
в растениях гибридной комбинации Lr19xLr26 проявлялся иммунитет, в комбинациях Lr19xLr24, Lr19xLr37 гетерогенная реакция с преобладанием устойчивой реакции и проявлением реакции сверхчувствительности (2 балла). В комбинациях Lr19xLr13, Lr19x23 реакция снизилась до 3 баллов, а в комбинации Lr19xLr34 при отсутствии внешних симптомов несовместимости (4 балла), размеры и плотность пустул на листе были существенно снижены. Во все комбинациях отмечалось удлинение латентного периода.

При сочетании генов расоспецифической устойчивости, проявляющих остаточный эффект, происходит снижение типа реакции (балла), в полевых условиях отмечается снижение степени поражения растений. Во всех гибридных комбинациях (за исключением иммунной Lr19xLr26) наблюдалось повышение количественной устойчивости, что выражалось в снижении балла иммунности и степени поражения растений.

3.2 МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ

Любой стрессовый фактор оказывает на растительный организм двойной эффект: повреждающий и раздражающий. Повреждение проявляется как в нарушении целостности мембранных структур клеток, изменении их свойств, разобщении дыхания и фосфорилирования и других процессов, тогда как стрессор-раздражитель вызывает формирование целой

цепи ответных защитных реакций, направленных на репарацию повреждений. Первичная реакция на воздействие стрессора направлена на предотвращение повреждений клеток организма, а потому является универсальной, что проявляется мобилизацией неспецифических защитных реакций, стоящих на «страже жизни» и участвующих в формировании адаптивных реакций растений, способствующих повышению их устойчивости.

Согласно концепции о стрессе, сформированной Г. Селье (1972), в ответ на сильное неблагоприятное воздействие в организме индуцируются неспецифические реакции, сопровождающиеся перестройкой защитных систем во времени – генерализованный адаптационный синдром, в котором выделяют три стадии:

Реакция тревоги – первоначальная реакция, сопровождающаяся процессами катаболизма различных полимеров, призывающая к активации защитных механизмов, затем при действии любого альтернирующего агента наступает стадия адаптации;
Стадия адаптации – характеризуется активацией синтетических процессов, приводящих часто к усилению выше нормы степени сопротивляемости клеток организма, однако при продолжающемся повреждающем действии стрессора наступает стадия истощения;
Стадия истощения – характеризуется исчерпыванием компенсаторных механизмов организма, теряется достигнутая адаптация и сопротивляемость падает ниже нормы, что связано с существованием порога приспособительной силы.

Такое поэтапное проявление всех трех стадий адаптационного синдрома возможно при рассмотрении длительных воздействий сильных (патологических) стрессоров. Физиологически слабые стрессоры способны индуцировать усиление восстановительных процессов, приводящих к формированию длительной неспецифической устойчивости.

Физиологический стресс, индуцируя избыточную активацию метаболизма, может повышать общие адаптивные механизмы растительного организма и способствовать его предадаптации к другим возможным стрессовым воздействиям, увеличению его неспецифической устойчивости.

К первым неспецифическим ответам клеток растений на воздействие разнообразных стрессоров, характерных для начальной фазы стресса, соответствующей катаболической фазе тревоги, которую называют по-разному – фазой торможения, реакцией защитного торможения метаболизма,

первичной стрессовой реакцией, фазой физиологической депрессии относится целый комплекс в той или иной степени однотипных реакций: снижение тотальной активности синтетических процессов, деградация белоксинтезирующего аппарата, катаболизм биополимеров, синтез стрессовых белков, повышение синтеза и активации гидролитических ферментов, образование необходимых для срочной защиты клеток соединений.

Первичные основные нарушения являются результатом непосредственного действия стрессора на клетки, их метаболических функций, а именно нарушение структурной целостности мембран и изменение их проницаемости, изменение свойств и состояния цитоплазмы, изменения ее рН, структурного состояния и активности ядерной ДНК, а также процессов связанных с биоэнергизацией клеток.

Вторичные нарушения являются следствием первичных нарушений; к ним можно отнести индукцию синтеза стрессовых белков и отдельных присущих норме белков на фоне подавления тотального синтеза белка, повышение концентрации стрессовых фитогормонов АБК (ей отводят ключевую роль в индукции синтеза стрессовых белков) и этилена (называемого часто гормоном тревоги), а также других эндогенных регуляторов роста, например салицилата и жасмоната, задействованных в индукции стресс-реакций, и снижением уровня ИУК, цитокининов и гиббериллинов, торможение ростовых процессов и результирующее изменение ряда интегральных показателей организма, к которым относят поглощение и утилизацию элементов минерального питания, прирост биомассы, урожай зерна и так далее.

Согласно гипотезе Е. И. Мелехова (1985), торможение метаболизма в клетках растений в начальную фазу в ответ на стрессор, имеющее ярко выраженный неспецифический характер, можно называть защитным, поскольку оно приводит к снижению скорости повреждающих целостность клеток процессов в условиях стресса, являющихся «продуктом» обмена веществ и находящихся на «балансе» энергии, получаемой опять же в результате активного метаболизма. Соответственно снижение активности метаболических процессов при стрессе носит защитно-приспособительный характер и препятствует развитию самоповреждения, сохраняя тем самым жизненный потенциал клеток для последующей репарации.

В пользу справедливости этой гипотезы свидетельствуют данные об усилении повреждающего действия стресс-фактора и снижение устойчивости растений на фоне обработки ауксинами, цитокининами и гиббереллинами и ,

наоборот, повышением ее под влиянием АБК. Правда такое заключение справедливо при воздействии жесткого повреждающего агента, тогда как наоборот обработка растений фитогормонами активаторами метаболизма при действии физиологических доз стресс-фактора, напротив, способна повышать их устойчивость.

Первую фазу стрессовой реакции в формировании адаптации растений к повреждающим воздействиям можно рассматривать в качестве срочной, но не совершенной адаптации, тогда как в период второй фазы постепенно возникают долговременные механизмы адаптации при действии на организм стрессовых факторов. Первая фаза стрессового ответа предшествует адаптации и играет в ней активную роль.

Устойчивость растений к стрессовым факторам зависит от фазы онтогенеза. Если в покоящемся состоянии растения наиболее устойчивы, то в периоды, например, прорастания и формирования семян – наиболее уязвимы.

Защитные механизмы растений к фитопатогенам можно условно подразделить на конститутивные (пассивные) и индуцированные (активные). К пассивным можно отнести свойства растений, присущие растительным организмам вне зависимости от контакта с болезнетворными агентами: анатомо-морфологические особенности, химический состав тканей, скорость прохождения фаз онтогенеза, характерные для растений физиологические и биохимические системы, находящиеся в состоянии готовности препятствовать внедрению и развитию патогенна. Активные реакции на внедрение патогенна или таких повреждающих агентов, как поранение, элиситоры биотической и абиотической природы (правда, к их числу можно отнести и активацию пассивных механизмов, например, форсированное образования физических и химических барьеров на пути патогена). Активные механизмы устойчивости чаще всего связаны с изменениями в спектре экспрессируемых генов, кодирующих белки, обеспечивающие защиту от патогенов.

Инфицирование возбудителями является распространенным стрессовым воздействием, вызывающим обычно каскад метаболических изменений, которые можно суммировать как мультикомпонентные ответы. Они включают накопление полисахаридов, фенолов, лигнина, суберина, фитоалексинов, фитонцидов, ферментов, участвующих в их синтезе, гидроксипролинбогатых белков, индукцию синтеза и увеличению уровня PR-белков, в частности, хитиназ, глюканаз, ингибиторов протеиназ, других стрессовых белков, например, пероксидаз.

Центральным звеном в регуляции формирования ответных реакций растительных организмов на инфицирование является гормональная система, причем в этом случае имеет место сложная картина активного взаимовлияния гормональных систем двух партнеров, определяющего характер развития защитных механизмов растений к фитопатогенам и развития механизмов фитопатогенов для обеспечения их успешного паразитирования. Об этом свидетельствуют исследования по анализу баланса эндогенных гормонов больного растения и влиянию экзогенных фитогормонов на различные процессы метаболизма растительных клеток, вовлекающихся в защиту от патогенов, работы по оценки способности грибных патогенов синтезировать вещества фитогормональной природы и динамики их содержания в процессе жизненного цикла.

Чаще всего активация механизмов устойчивости связана с индукцией или усилением экспрессии генов белков, задействованных в системе ответа растений на патоген. Одной из наиболее изученных систем защиты растений является синтез и накопление фитоалексинов, образующихся в ответ на заражение фитопатогенами, механическое поранение и действия элиситоров. Это производные метаболизма фенилпропаноидов. К этой группе соединений относятся сесквитерпеноиды, изофлавоноиды, дигидрофенантрены и другие. Основным механизмом контроля синтеза и содержания фитоалексинов является регуляция их биогенеза за счет индукции или подавления активности ферментов, участвующих в нем, например фенилаланинаммонийлиазы (ФАЛ). Фитоалексины ингибируют рост грибных клеток за счет нарушения целостности их цитоплазматических мембран.

Инфицирование, обработка этиленом и элиситорами также вызывают усиление активности ферментов, участвующих в модификации клеточных стенок растений – ФАЛ, пероксидаз, полифенол-оксидаз. Они участвуют в образовании фенолов и полифенолов, которые связываются со структурными белками клеточных стенок растений, укрепляют их. Важную роль в укреплении барьерных свойств клеточных стенок принадлежит ассоциированным с растительными клеточными стенками анионным пероксидазам, которые задействованы в синтезе лигнина и суберина.

До 10% клеточно-стеночных структурных белков приходится на долю оксипролинбогатых белков. В укреплении клеточных стенок важную роль отводят и глицинбогатым белкам благодаря наличию тирозиновых остатков внутри глицинбогатых повторяющихся мотивов в полипептидах, синтез которых индуцируется при грибном инфицировании.

3.2.1 КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

Защитные белки синтезируются в растениях под воздействием стрессовых ситуаций. Они обеспечивают первую фазу защиты растений от инфекций и других раздражителей. Согласно классификации защитных белков, в основу которой положены их аминокислотная последовательность или ферментная и биологическая активность.

Защитные белки второго типа – 1,3-β-глюканазы. Это гидролитические ферменты с молекулярной массой 25 – 35 кД, действие которых направлено на разрушение клеточной стенки грибов.

Защитные белки третьего типа – преимущественно хитиназы первого класса, обладающие способностью расщеплять хитин. Обычно хитиназы существуют в виде мономеров с молекулярной массой от 25 до 35 кД.

Защитные белки четвертого типа – также хитиназы.

Хитиназы и 1,3-β-глюканазы составляют важную часть в семействах PR-белков. Помимо участия в гидролизе клеточных стенок грибов, они могут способствовать индукции других защитных реакций. Так, олигосахаридные фрагменты грибных клеточных стенок и продукты их гидролиза выступают в качестве элиситоров, индуцирующих защитные реакции в неинфицированных тканях: синтез фитоалексинов, экспрессию генов других PR-белков, например ингибиторов протеаз.

Ингибиторы протеаз обладают высокой специфичностью к связыванию протеиназ патогенов, в силу чего последние теряют свою активность. В этом и заключается их важное значение в защите растений от фитопатогенов.

Защитные белки пятого типа – тауматин-подобные протеины. Тауматин-подобные белки обладают антифунгальной активностью.

PR1-белки – ингибируют рост грибов in vitro;

PR2-белки – β-1,3-глюканазы;

PR3-белки – эндохитиназы;

PR4-белки – хитиназы;

PR5-белки – защищают растения от засухи и грибковых заболеваний;

РИ9-белки – лигнинобразующие пероксидазы;

PR14-белк – обеспечивают межмембранный перенос фосфолипидов из липосом к митохондриям, обладают антибактериальной и антигрибковой активностью.

Гены, кодирующие антимикробные пептиды (АМП) – древние и наиболее общие для многоклеточных организмов компоненты конститутивных защитных систем для борьбы с патогенами. В настоящее

время известно более 800 АМП, обладающих различной структурой, аминокислотным составом, и механизмом действия. Большинство из них обладают широким спектром антимикробной активности. Все АМП являются положительно заряженными, цистеин-богатыми молекулами. Липид-переносящие белки (LTR) представляют собой гомогенное семейство основных пептидов длиной 90-93 аминокислотных остатка, содержащих 8 цистеиновых остатков. LTR ингибируют рост грибов в диапазоне концентраций 8-200 мкг/мл.

Синтез PR-белков и повышение их активности индуцируется не только при обработки растений элиситорами, но и салициловой и жасмоновой кислотами, этиленом, а также при раневом стрессе, причем последний вызывает синтез гормоноподобного пептида системина, играющего центральную роль в сигнальной регуляции в экспрессии защитных генов. В здоровых растениях уровень синтеза PR-белков крайне никий, обнаруживаются следовые количества этих белков. Хотя некоторые их изоформы могут накапливаться конститутивно, но при заражении фитопатогенами уровень экспрессии генов PR-белков возрастает в десятки и сотни раз, причем экспрессия, например генов хитиназ и глюканаз, обычно индуцируется координировано, что составляет важную часть защитной стратегии растений, направленной на лимитирование роста клеток грибов. Экспрессия генов PR-белков может происходить и в ходе нормального онтогенеза – прорастании семян, при цветении и старении тканей, а также повреждений, вызванных поранением, воздействием солей бария, магния, ртути, ультрафиолетового облучения, в условиях осмотического шока, переувлажнения, обработки химическими препаратами.

3.2.2 ДЕФЕНЗИНЫ

Формы взаимоотношений растений с фитопатогенами могут быть представлены двумя положениями. Эта устойчивость подразделяется на специфическую и неспецифическую. И восприимчивость, которая подразделена на толерантность и чуствительность. Гены устойчивости изучены уже давно, механизм их действия практически не ясен. Для защиты от патогенов растения синтезируют целый набор белков, который обладает антимикробным действием. На основании гомологии аминокислотных последовательностей и трехмерной структуры эти антимикробные белки (АМР) подразделяются на 18 семейств. К наиболее изученным семействам относятся PR-белки: PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5, PR-8, PR-11 и рибосомоинактивирующие белки (RIPs). Они образуются в растениях при

заражении различными индукторами как биогенной, так и абиогенной природы: вирусами, грибами, бактериями, вироидами, гормонами, химическими соединениями различной природы, осмотическим шоком. Установлено, что PR-белки в растениях индуцируются как под действием вирусной инфекции, так и при механическом повреждении листа, причем наибольшее количество PR-белков наблюдается вблизи некроза, по мере удаления от них содержание PR-белков в листьях падает. Дефензины состоят из 45-54 аминокислотных остатков, имеют положительный заряд и синтезируются тканеспецифично. Некоторые дефензины способны эффективно ингибировать рост гиф фитопатогенных грибов при концентрациях 2-15 мкг/мл. Гены устойчивости к бурой ржавчине локализованы в хромосомах 2A, 2G, 5G, 6G, 5D, 2D. Дефензины являются цистеин- богатыми антимикробными пептидами, обнаружены как в животном, так и в растительном царстве. Они обладают антифунгальной, антибактериальной и инсектицидной активностями, что было продемонстрировано в экспериментах in vitro и при исследовании трансгенных растений. Дефензины обладают видовой специфичностью, то есть отличаются по аминокислотной последовательности у разных видов растений. Сравнение аминокислотной последовательности у разных представителей семейства дефензинов показало, что гомология первичной структуры в различных группах растений крайне низка и ограничивается лишь консервативным расположением остатков цистеина. Вариабельность первичной структуры определяет разнообразие биологических активностей дефензинов. Несмотря на низкий консерватизм аминокислотных последовательностей, пространственная структура растительных дефензинов в целом одинакова и включает 3 тяжа бета-структуры и одну параллельно расположенную альфа-спираль, удерживаемые в компактной структуре 4 внутрицепочечными дисульфидными связями. Пространственная организация дефензинов во много напоминает структуру нейротоксинов, блокаторов ионных каналов. Для выделения дефензинов разработан метод, включающий:

Кислотную экстракцию семян;
Аффинную, гель-проникающую, обращено-фазовую хроматографию;
Масс-спектрометрию.

Выделенные дефензины секвенировали путем автоматической деградации по Эдману на секвенаторе Procise модели 492 (Applied

Biosystems). Молекулярные массы пептидов определяли путем MALDI-TOF масс-спектрометрии. В результате из семян пшеницы Triticum kiharae (высокоустойчивый сорт) было впервые выделено и секвенировано 13 дефензинов, которые по гомологии N-концевых последовательностей были подразделены на 3 группы (приложение. Таблица №1). Группа I включала 8 новых дефензинов, названных D-дефензинами. Группа II состояла из 3 пептидов, 2 из которых были ранее обнаружены в зерновых твердой пшеницы. В группе III оказались 2 новых пептида, гомологичные омега-гордотионинам (дефензинам ячменя). Размер D-дефензинов варьирует от 45 до 49 аминокислотных остатков. Они также различаются по заряду. D-дефензины положительно заряжены, кроме D1.1. сравнительный анализ аминокислотных последовательностей также выявил определенную гомологию с дефензинами Sorghum bicolor (L.)

Moench и Zea mays L. в тоже время сходства с дефензинами других семейств значительно меньше. Аминокислотные последовательности дефензинов семян T. kiharae и T. monococcum D-дефензинов 12 других аминокислотных остатков также совпадают, что свидетельствует о высокой гомологии структуры и о происхождении от общего предка. Более вариабельными как по длине, так и по аминокислотной последовательности, оказались С-концевые фрагменты молекул, в частности петля, соединяющая бета2 и бета3 тяжи вторичной структуры. Этому участку молекулы принадлежит решающая роль в определении биологической активности дефензинов, что свидетельствует о различных функциях D-дефензинов.

D1, D4, D5 кодируются А геномом, D3и D6- D геномом, D6.1 и D3.1 В геномом. Анализ восприимчивых сортов Хакасская и Родина показал, что по составу дефензинов они не отличаются от T. kiharae несмотря на различие геномного состава (ABD у T. aestivum и AGD у T. kiharae). Эти результаты свидетельствуют о сходстве B и G геномов, и во вторых, об отсутствии прямой связи между составом дефензинов, по крайней мере D-дефензинов, и устойчивостью при так называемой совместимой комбинации растение патоген (Приложение. Таблица №2). Различный уровень устойчивости сравниваемых видов связан с различным уровнем экспрессии генов, кодирующих дефензины, в ответ на действие патогенов.

3.2.3 НОВЫЕ ПЕПТИДЫ, ОТВЕЧАЮЩИЕ ЗА УСТОЙЧИВОСТЬ

Из семян T. kiharae выделено 2 новых антимикробных пептида, названных Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-Х2. С помощью масс-спектрометрии установлены их молекулярные массы: 3517 и 3857 дальтон. Эти пептиды содержат по 4 остатка цистеина, образующих 2 дисульфидные связи, причем остатки цистеина Cys1и Cys2 также как, Cys3и Cys4 разделены 3 аминокислотными остатками. Путем автоматической деградации по Эдману были установлены полные аминокислотные последовательности выделенных пептидов:

Tk-AMP-X1

TDDRCERMCQHYHDRREKK

QCMKGCRYGESD

Tk-AMP-X2

ADDRCERMCQRYHDRREKK

QCMWRCRY

Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов Tk-AMP-X1 и Tk-AMP-Х2 может свидетельствовать о том, что оба пептида произоши от общего предкового гена. Помимо единичных точечных замен они различаются между собой по длине С-концевой области молекулы. Дисульфидные связи в молекулах исследованных пептидов образованы остатками цистеина Cys1 и Cys4, а также Cys2 и Cys3. Оба пептида являются альфа-спиралями и не содержат элементов бета-структуры. Два участка альфа-спирали расположены параллельно друг другу, причем структура стабилизирована двумя дисульфидными связями, скрепляющими между собой альфа-спиральные участки.

Они способны ингибировать прорастание спор некоторых фитопатогенных грибов (Fusarium graminearum, Fusarium graminicola, Colletotrichum graminicola и Diplodia maydis) in vitro.

3.2.4 ТАУМАТИНЫ

3.2.4.1 ТАУМАТИН 1

Молекулярная масса 21 000 (в а.е.м.).

Белок. Первичная аминокислотная последовательность:

1 Ala Thr Phe Glu Ile Val Asn Arg Cys Ser

11 Tyr Thr Val Trp Ala Ala Ala Ser Lys Gly

21 Asp Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gly Arg Gln

31 Leu Asn Ser Gly Glu Ser Trp Thr Ile Asn

41 Val Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gly Lys Ile

51 Trp Ala Arg Thr Asp Cys Tyr Phe Asp Asp

61 Ser Gly Arg Ser Ile Cys Lys Thr Gly Asp

71 Cys Gly Gly Leu Leu Arg Cys Lys Arg Phe

81 Gly Arg Pro Pro Thr Thr Leu Ala Glu Phe

91 Ser Leu Asn Gln Tyr Gly Lys Asp Tyr Ile

101 Asp Ile Ser Asn Ile Lys Gly Phe Asn Val

111 Pro Met Asn Phe Ser Pro Thr Thr Arg Gly

121 Cys Arg Gly Val Arg Cys Ala Ala Asp Ile

131 Val Gly Gln Cys Pro Ala Lys Leu Lys Ala

141 Pro Gly Gly Gly Cys Asn Asp Ala Cys Thr

151 Val Phe Gln Thr Ser Glu Tyr Cys Cys Thr

161 Thr Gly Lys Cys Gly Pro Thr Glu Tyr Ser

171 Arg Phe Phe Lys Arg Leu Cys Pro Asp Ala

181 Phe Ser Tyr Val Leu Asp Lys Pro Thr Thr

191 Val Thr Cys Pro Gly Ser Ser Asn Tyr Arg

201 Val Thr Phe Cys Pro Thr Ala

Имеет S-S связи между цистеинами 9-204, 56-66, 71-77, 121-193, 126-177, 134-149, 145-158, 159-164. Изоэлектрическая точка 12. Денатурирует при 75 градусах цельсия и рН 5 или 55 градусов цельсия и рН 3. Сладкий вкус утрачивается при разрушении дисульфидных мостиков, а также при ацетилировании 4 из 10 лизиновых групп. Алкилирование метионинов не влияет на сладкий вкус.

3.2.4.2 ТАУМАТИН II (PR5 белок)

Молекулярная масса 22 килодальтон, третичная структура стабилизирована 8 дисульфидными связями. Выделение белка: экстракты тотального белка подвергали SDS электрофорезу в 15% ПААГ по Laemmly. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham). Для иммуноблотинга в качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела к белку тауматину II в разведении 1: 4000. В качестве вторичных антител использовали антикроличий IgG в разведении 1: 5000, коньюгированный с флюоресцентной меткой CY3. Визуализацию проводили на установке Variable Mode Imager Typhoon 9200 (Molecular Dynamics, USA). Для этих анализов использовались листья однонедельного возраста. Анализ повторяли три раза.

3.2.4.3 ТАУМАТИН-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ

OATPERML BARPERM1 и BARPERM2

3.2.5 ЛЕКТИНЫ В ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЯХ ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ РАСТЕНИЙ (АЗП – агглютинин зародыша пшеницы)

В формировании реакций между растением-хозяином и патогеном важная роль отводится фитолектинам.

Лектины – это особый класс белков или гликопротеидов, разнообразных по своей структуре и биохимическим особенностям, обладающих замечательной способностью специфически и обратимо связывать углеводы, не вызывая их химического превращения. Общим свойством лектинов является их способность агглютинировать эритроциты крови, из-за чего их называют агглютининами, причем агглютинация подавляется специфическими углеводными гаптенами. Лектины имеют углевод связывающие домены, благодаря которым лектины могут взаимодействовать как со свободными моно- и олигосахаридами, так и с остатками углеводов в составе полисахаридов, гликолипидов и гликопротеидов.

Поскольку в состав клеточных стенок фитопатогенов входят углеводные компоненты, то это свойство лектинов может обеспечивать растениям способность распознавать целый ряд фитопатогенов даже по слабым различиям в углеводной структуре поверхностей микроорганизмов. . Молекулярная масса АЗП в нативном состоянии составляет 36 кД, и этот белок состоит из двух нековалентно связанных идентичных субьединиц, которые диссоциируют под действием SDS, экстремальных значениях рН (ниже 3,0 выше 10,5) или высокой ионной силы среды на мономеры с молекулярной массой 18 кД. Характеризуется высоким содержанием глицина и цистеина, что обуславливает его высокую стабильность при широких диапазонах температур и рН.

Мягкая пшеница является гексаплоидом, образованным слиянием 3-х диплоидных генов A, B, D, а поскольку лектин пшеницы состоит из 2-х гомологичных субьединиц, эти растения могут содержать 6 изолектинов, характеризующихся 93-95 %-й идентичностью по нуклеотидной и аминокислотной последовательностям.

Лектины бывают в форме свободных цитоплазматических белков, локализованных в цитоплазматических компартментах, вакуолях, или связанных с цитоплазматическими мембранами и клеточной плазмалеммой (это так называемые «классические» лектины). Имеются также прочносвязанные с клеточными стенками лектины, или β-лектины, которые, хотя и обладают доменами углеводной специфичности, но не способны агглютинировать эритроциты или агглютинируют их очень слабо.

Значительные количества АЗП обнаружены в зародыше зрелых семян, при этом он локализован в клетках поверхностных слоев зародышевого

корешка, первичных корешков, колеоптиля. Массированный синтез и накопление АЗП наблюдается в период эмбриогенеза в ходе формирования семян в развивающемся зародыше. В тот же период онтогенеза происходит существенный синтез и накопление лектинов в других злаках – эгилопсах, ячмене, ржи, рисе, причем сравнительное изучение этих лектинов показало их высокую степень родства по иммунологическим и биохимическим свойствам и сахароспецифичности АЗП, поэтому эти лектины, иммунологически неотличимые от АЗП, были даже обьединены в одну группу, так называемых «злаковых лектинов», а АЗП был отнесен к их типичному представителю. АЗП-подобные, иммунохимически сходные с ним лектиныобнаружены более чем в 90 видах злаковых растений, что указывает на высокую консервативность генов лектинов злаков в эволюции.

Подробный анализ распределения лектина в различных органах и тканях в ходе онтогенеза растений ячменя выявил его наличие в корнях, листьях, развивающихся колосьях, причем лектины в корнях и листьях также неотличимы от лектина зародыша, а суммарное содержание лектина в корнях и листьях может превышать его содержание в зародыше.

Исследования по синтезу АЗП в ходе формирования, созревания и прорастания зародышей выявили наличие пула запасных нетранслируемых лектиновых Мрнк. Злаковые лектины синтезируются в качестве пробелков, и требуются обязательные структурные преобразования при их созревании (посттрансляционный процессинг). Предшественник пробелка котрансляционно изменяется путем удаления гидрофобного сигнального пептида и модифицируется связыванием с высокогликозилированным (маннозный глюкан) карбоксилтерминальным пропептидом (КТПП), состоящим из 15 аминокислот. В таком виде полипептид с молекулярной массой 23 кД проходит через комплекс Гольджи перед аккумуляцией в вакуолях. Именно КТПП отвечает за корректное распределение предшественника в клеточную вакуоль, тогда как глюкан может оказывать влияние лишь на скорость посттрансляционного процессинга. По ходу транспорта предшественника или по достижении вакуоли гликозилированный КТПП удаляется с образованием зрелого пептида с молекулярной массой 36 кД.

Хитинсвязывающие лектины благодаря своей специфичности к N-ацетил-D-глюкозамину и олигомерам хитина являются наиболее вероятными кандидатами для выполнения защитной роли в растениях от хитинсодержащих насекомых и грибных патогенов. К таким белкам относится агглютинин зародыша пшеницы (АЗП).

Возможность выполнения антифунгальной роли АЗП впервые показана в работе Mirelman et al. (1975) в опытах in vitro, в которых АЗП ингибировал прорастание спор Trichoderma viride и Fusarium solani, давших основание предположить, что АЗП, обладающий специфическим сродством к N-ацетил-D-глюкозамину, подавляет его синтез и может выполнять защитную роль в растениях при болезнях, вызываемых хитинсодержащими

фитопатогенными грибами. Позднее было показано, что АЗП взаимодействует с клеточными стенками Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum причем микроскопические исследования влияния АЗП на ранние стадии развития выявили различные модификации ростовых трубок, опухолеобразование, вакуоляцию клеток и лизис грибных клеточных стенок. Прямых доказательств вовлечение АЗП в формирование защитных реакций в системе растение – гриб (in vivo) пока не получено, хотя в пользу его участия в ответе на инфицирование могут свидетельствовать данные о 2-3-кратном увеличении уровня этого белка в инфицированных растениях пшеницы, а также при обработки элиситорами и препаратами, повышающими устойчивость пшеницы к возбудителям грибных болезней.

3.2.6 РОЛЬ PR-БЕЛКОВ В РАЗВИТИИ ИНДУЦИРОВАННОЙ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ СИСТЕМНОЙ ПРИОБРЕТЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

PR-белки могут служить маркером развития СПУ. По крайней мере, 9 семейств генов, координировано индуцированных в неинфицированных тканях инокулированных растений, которые были названы СПУ-генами. Причем СК, а также 2,6-дихлороизоникотиновая кислота (ИНК) – синтетический индуктор устойчивости, в отсутствии инфекции индуцируют аналогичный СПУ-генам спектр генов у многих видов растений, что свидетельствует о тесной связи экспрессии СПУ-генов с установлением устойчивости растений к патогенам. Среди них есть гены, кодирующие хитиназы и β-1,3-глюканазы, цистеин богатые белки, а также целую группу белков, обьединенных в семейство PR1, ингибирующие рост грибов в системе in vitro.

Детально экспрессия СПУ-генов изучена в растениях табака, огурца, арабидопсиса, кукурузе и ячмене. В пшенице были выявлены координировано экспрессируемые гены-маркеры химически активируемой СПУ, кодирующие липоксигеназу, цистеин протеиназу и другие белки. Характер их экспрессии сходен с индукцией СПУ-генов при обработке СК в двудольных растениях. Пока не все СПУ-гены идентифицированы, но работа в этом направлении ведется.

3.3 ВЕЩЕСТВА-РЕГУЛЯТОРЫ УСТОЙЧИВОСТИ

Одной из важнейших составляющих ответа растений на действие стрессоров является накопление в клетках и тканях стрессовых метаболитов. К ним относят активные формы кислорода (АФК), ионы кальция, оксид азота (NO), этилен, жасмоновую кислоту и ее производные, АБК и салициловую кислоту, пролин и полиамины. Некоторые из перечисленных соединений (например, пролин и полиамины) выполняют протекторные функции, защищая белки и мембранные структуры от повреждений, вызываемых действием стрессоров. Этим же соединениям в какой-то мере присущи регуляторные функции. АБК и этилен считаются классическими

стрессовыми фитогормонами. Особое место среди стрессовых метаболитов занимают вещества, выполняющие сигнальную роль. Многие из них являются ключевыми интермедиатами соответствующих сигнальных систем – кальциевой, NO-синтазной и других.

3.3.1 СОДЕРЖАНИЕ ЭТИЛЕНА И ЖИРНЫХ КИСЛОТ У РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ

В исследованиях механизмов устойчивости растений к фитопатогенам применяются как визуальные, так и биохимические методы. Среди визуальных методов непрямой оценки устойчивости растений используется in vitro селекционная техника на срезанных листьях для определения частичной устойчивости по данным инкубационного и летального периодов, времени лизиса тканей, картирование локусов ответственных за устойчивость.

Биохимические исследования направлены на поиски соединений – маркеров устойчивости. Наиболее выраженными биохимическими проявлениями действия стрессоров являются процессы образования химически активных веществ, в частности оксидантов (в том числе свободных радикалов), среди которых важное место отводится активным формам кислорода. Образование свободных радикалов – естественный процесс, наблюдаемый в нормальных условиях и контролируемый веществами противоположного действия – антиоксидантами. В то же время превышение концентрации оксидантов по сравнению с антиоксидантами ведет к нарушению запрограммированных биохимических реакций, что сопровождается ингибированием ростовых процессов или отмиранием клеток и тканей. Развитие патологий и ингибирование роста тесно связаны с метаболизмом липидов и жирных кислот. При этом от степени окисленности последних зависят уровни развития патологии, ингибирование роста, летальные процессы и эффективность функционирования антиокислителей. Активация окислительных процессов тесно связана также с метаболизмом природных регуляторов роста как этилен и абсцизовая кислота.

Полагают, что этилен может активировать защитные реакции, например синтез фитоалексинов, PR-белков (патогензависимых белков), модификацию клеточной оболочки. Этилен активирует окислительные механизмы одновременно и в растениях и в фитопатогене. При этом содержание антиоксиданта у последних ниже, чем у растения хозяина, что и является причиной ингибирования роста фитопатогена или его гибели. Кроме того, этилен активирует процессы отложения лигнина в оболочках эпидермальных клеток и увеличивает жесткость мембран. Это также предотвращает проникновение фитопатогена в клетки и способствует повышению их устойчивости.

Листья различных сортов пшеницы выделяют различное количество этилена (приложение, таблица №4). Из приведенных данных следует, что листья устойчивых сортов Колумбия и Смуглянка выделяют наибольшее

количество этилена, а листья неустойчивых сортов Белоцерковская полукарликовая и Подолянка – наименьшее. Установлено также, что у изученных сортов интенсивность продуцирования этилена зависила от времени года: наибольшее количество этого вещества растения вырабатывали в марте, меньшее в феврале и июне, однако, относительные различия по количеству выделяемого этилена между сортами сохранялось.

Функционирование различных структур клетки поддерживается мембранами, повреждение которых может приводить к развитию патологии. Жирные кислоты являются важным компонентом клеточных мембран. Количественные и качественные (уменьшение доли ненасыщенных и увеличение доли насыщенных жирных кислот) изменения в их составе, происходящие под действием стрессовых факторов, часто влекут за собой существенные изменения текучести мембран и их проницаемости, ферментативной активности в клетках, интенсивности дыхания, фотосинтеза. Одним из деструктивных факторов целостности мембран является активация окислительных процессов. Данные о содержании жирных кислот различных сортов приведены в приложении в таблице №5. Из них следует, что все сорта пшеницы содержат пальмитиновую (С16:0), стеариновую (С18:0), олеиновую (С18:1), линолевую (С18:2), линоленовую (С18:3), арахиновую (С20:0), следовые количества лауриновой (С12:0), миристиновой (С14:0), гексадеценовой (С16:1), докосаноиновой (С22:0), лигноцериновой (С24:0). При этом растения изученных сортов отличались по общему суммарному их содержанию. Наивысшее содержание жирных кислот (516,6 мкг/г сырого вещества) обнаружено у устойчивых сортов Колумбия и Смуглянка. Известно, что в процессе окисления липидов образуются не только антиокислители, в частности простагландины, но и окислители, среди которых этилен является активатором пероксидного окисления липидов. Этилен синтезируется также и неферментативным путем, например при окислительной деструкции фосфатидилхолина. Следовательно, липиды могут быть источником усиленного синтеза как этилена (с функцией окислителя), так и антиокислителей (или перехватчиков свободных радикалов). Возможно более высокое содержание жирных кислот, а поэтому и липидов, в клетках растений пшеницы обеспечивает большую эффективность функционирования антиоксидантных систем.

Методика определения

Семена стерилизуются пероксидом водорода и проращиваются в термостате при 24⁰С. содержание жирных кислот определяют в этиолированных колеоптилях в период, когда первый лист будет на 0,5 см длиннее. Ткани колеоптилей представляют наиболее синхронизированный тип тканей. Они также подвергаются процессам быстрого старения, в которых существенная роль отводится и регулятору роста этилену. Выделение этилена зелеными листьями двухнедельных проростков измеряют газохроматографическим методом.

Содержание жирных кислот определяют методом газожидкостной хроматографии. Метилирование жирных кислот проводят 3,5%-ным раствором H₂SO₄ в метаноле в запаянных ампулах при 100^оС в течение 1 часа. Метиловые эфиры жирных кислот извлекают гексаном. Хромотографирование осуществляют на хроматографе «Цвет-100» с пламенно-ионизационным детектором. Стеклянная колонка длиной 2 метра и диаметром 3 мм, была наполнена 10% PEGA на Chromaton N-AW HDMS; скорость тока азота – 40 мл/мин, температура термостата колонки – 185, испарителя – 220^оС. жирные кислоты идентифицируют, сравнивая пики в образцах с соответствующими стандартами.

3.3.2 АКТИВНОСТЬ ФК У ГЕНОТИПОВ ПШЕНИЦЫ РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К РЖАВЧИННЫМ БОЛЕЗНЯМ

Поражение растения ржавчинным грибком приводит к резкому усилению катаболизма. Особенно опасен катаболизм центральной аминокислоты азотного обмена – глютамата. Расщепление этой аминокислоты с помощью глютаматдегидрогеназы ведет к выделению токсического аммиака, который разрушает мембраны растительных клеток. Учитывая то, что ФК МДГ-ГОАТ осуществляет нетоксический путь катаболизма глютамата можно предположить, что высокая активность ФК определенных генотипов злаковых культур будет содействовать их устойчивости ржавчинным болезням. В таблице 14 приведены результаты многолетних испытаний устойчивости к ржавчинным болезням института биобезопасности.

Устойчивость 20-ти сортов к ржавчинным болезням

Название	Проис-хождение	вид	Образ жизни	Устойчивость, балл/%
Название	Проис-хождение	вид	Образ жизни	Стебле-вая	Листо-вая	Жел-тая
Attila	Мексика	T. aestivum	Яровая	—	4/20	4/20
Aldura	США	T. durum	Яровая	4/30	2/5	4/40
Randur	Франция	T. durum	Яровая	—	—	1/5
Безенчукская-139	Россия	T. durum	Яровая	4/60	—	4/60
Алтын дала	Казахс-тан	T. durum	Яровая	4/10	3/20	3/10
Стекловидная-24	Казахс-тан	T. aestivum	Озимая	4/20	4/70	4/80
Тома	Казахс-тан	T. durum	Яровая	4/30	2/50	4/40
Богарная-56	Казахс-тан	T. aestivum	Озимая	3/50	3/70	4/40
Казахстанская Раннеспелая	Казахс-тан	T. aestivum	Яровая	4/40	4/5	3/5
Эритроспермум-35	Казахс-тан	T. aestivum	Яровая	4/80	4/60	2/10
VZ-187	Италия	T. durum	Яровая	—	—	—
Pastor	Мексика	T. aestivum	Яровая	—	—	—
Красота	Россия	T. aestivum	Озимая	—	2/10	2/5
Шарора	Таджи-кистан	T. aestivum	Озимая	—	—	—
СИД-88	Казахс-тан	T. durum	Яровая	4/50	3/10	4/40
Наурыз-8	Казахс-тан	T. durum	Яровая	4/20	2/10	4/50
Cocorit	Мексика	T. durum	Яровая	—	—	—
Bacanora	Мексика	T. aestivum	Яровая	—	—	—
Улугбек-600	Узбекис-тан	T. aestivum	Озимая	—	—	—
Саратовская-29	Россия	T. aestivum	Яровая	—	—	—

Как видно из таблицы, наиболее устойчивыми к ржавчинным болезням являются сорта Attila, Aldura, наименее устойчивые Саратовская-29 и Улугбек-600.

Активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов пшеницы различающиеся по устойчивости к разным видам ржавчины

Название	Устойчивость, балл/%			Активность ФК МДГ-ГОАТ мкМ НАDН
Название	Стеблевая	Листо-вая	Желтая	На мл белка, 1 мин	На мг белка, 1мин
Attila	—	4/20	4/20	1001,61±21,3	270,70±5,4
Aldura	4/30	2/5	4/40	678,70±13,5	220,36±4,4
Randur	—	—	1/5	708,06±14,3	208,25±4,2
Безенчукская-139	4/60	—	4/60	719,35±14,4	197,08±3,9
Алтын дала	4/10	3/20	3/10	715,32±14,6	185,31±3,7
Стекловидная-24	4/20	4/70	4/80	580,32±17,4	174,79±3,4
Тома	4/90	—	—	687,09±20,6	167,58±3,5
Богарная-56	3/50	3/70	4/40	637,90±19,1	162,31±3,3
Казахстанская Раннеспелая	4/40	4/5	3/5	708,06±21,2	162,02±3,2
Эритроспермум-35	4/80	4/60	2/10	625,16±12,5	161,12±2,3
VZ-187	—	—	—	687,09±13,7	160,90±3,2
Pastor	—	—	—	541,12±10,8	159,15±4,7
Красота	—	2/1	2/5	627,41±12,6	158,84±6,7
Шарора	—	—	—	707,25±14,1	154,76±3,2
СИД-88	4/50	3/10	4/40	730,32±14,6	149,04±3,1
Наурыз-8	4/20	2/10	4/50	691,29±13,8	144,92±2,9
Cocorit-71	—	—	—	617,74±14,3	140,73±2,8
Bacanora	—	—	—	610,96±12,2	138,85±2,7
Улугбек-600	—	—	—	650,16±13,6	134,88±4,2
Саратовская-29	—	—	—	582,25±11,6	130,84±2,6

Как видно из таблицы активность наиболее устойчивых к ржавчинным болезням сортов почти в 2 раза превышала активность ФК, чем у неустойчивых сортов. Чем выше активность ФК, тем более устойчив сорт к ржавчине. Это можно объяснить следующим образом при поражении растения грибком резко усиливаются процессы катаболизма, особенно глютамата. Сорта, имеющие высокую активность ФК, активнее расщепляют глютамат по нетоксическому пути без выделения аммиака, и поэтому они в меньшей степени повреждаются при ржавчинных болезнях по сравнению с неустойчивыми генотипами.

Высокая активность ФК повышает жизнеспособность устойчивых сортов и сопротивляемость к ржавчине. Это позволяет рекомендовать активность ФК МДГ-ГОАТ в качестве маркерного признака к ржавчинным болезням.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФК МДГ-ГОАТ

Реакционная смесь для определения ФК содержит 1,1мМ NAD, 12 мМ малата и 87 мМ глутамата натрия и доводим до обьема 2 мл 0,05 М трис-глициновым буфером, рН 7,7. Процедура определения активности имеет свои особенности. Сначала определяют в течение 1-2 минут базовую активность малатдегидрогеназы. Для этого реакционная смесь содержала все ингридиенты кроме глутамата, и только после определения базовой активности добавляется глутамат. Активность ФК определяется по приросту активности после добавления глутамата. Для определения активности от конечной активности отнимали активность малатдегидрогеназы. Активность обеих реакций рассчитывали по изменениям адсорбции за одну минуту. Также необходимо провести спектрофотометрическое определение

активности ГДГ в реакции восстановительного аминирования. Для определения активности ФК необходимо вычесть активность ГДГ в реакции окислительного дезаминирования глютамата. Для этого полученную активность ГДГ делим на 12, так как для этого фермента характерно постоянное соотношение скоростей прямой и обратной реакции равное 1/12. В результате, чистая активность ФК определяется путем определения полной активности в реакционной смеси с вычетом активности МДГ и ГДГ.

Концентрацию белка определяли микробиуретовым методом по Бэйли (1965) при длине волны 330 нм на спектрофотометре типа Ultraspec-1100, Amersham-Bioscience и по методу Брэдфорда.

3.3.3 САЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА (СК)

Салициловая кислота –стрессовый метаболит, сочетающий свойства сигнального интермедиата и фитогормона. Салициловая кислота (орто-гидроксибензойная) относится к группе растительных фенольных соединений. СК способна индуцировать системную приобретенную устойчивость, индуцирует координированную экспрессию 9 семейств генов, названных СПУ-генами. К СПУ-генам относятся гены, кодирующие хитиназы и β-1,3-глюканазы, цистеинбогатые белки, подобные тауматину, а также группу белков, объединенных в семейство PR1, ингибирующих рост грибов in vitro.

Убедительные доказательства того, что СК играет ведущую роль в передаче сигнала при развитии СПУ были получены в экспериментах с использованием трансгенных растений, экспрессирующих бактериальный фермент салицилат-гидролазу. Данный фермент катализирует превращение СК в катехол, который не проявляет физиологической активности СК. Растения, трансформированные геном салицилат-гидролазы, оказались неспособными накапливать свободную СК и отвечать синтезом PR1-белков в ответ на заражение патогеном.

СК важна для развития устойчивости к патогенам с различным ее конститутивным уровнем.

Реализация эффектов СК при биотических стрессах в значительной степени обусловлена увеличением под ее влиянием содержания АФК в клетках. Один из основных механизмов действия СК связан с ингибированием каталазы, которую рассматривают как рецептор СК. Ингибирование каталазы приводит к увеличению содержания пероксида водорода, который и выполняет сигнальные функции в индуцировании экспрессии защитных генов. Имеются сведения и о влиянии СК на активность других ферментов, причастных к регулированию про/антиоксидантного равновесия, в частности НАДФН-оксидазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы. Защитные реакции в которых принимает участие СК связаны с накоплением АФК. Индукция СК экспрессии PR-генов

супрессируется антиоксидантами. Накопление СК и хитиназной активности происходит только в присутствии ионов кальция.

СК рассматривается как полифункциональная сигнально-регуляторная молекула. СК является естественным индуктором термогенеза, принимает участие в индуцировании цветения у некоторых видов растений, регуляции транспорта органических веществ по флоэме, формировании ризобиального симбиоза.

Пути изменения содержания салициловой кислоты в растениях.

Пути биосинтеза СК до сих пор продолжают уточняться. Основным путем синтеза считается фенилпропаноидный. Прямым предшественником в этом пути является фенилаланин, который с участием фенилаланинаммонийлиазы превращается в транскоричную кислоту. Последняя путем декарбоксилирования превращается в бензойную кислоту, которая, в свою очередь, под действием фермента 2-гидроксилазы бензойной кислоты превращается в СК.

Увеличение содержания СК в тканях растений может быть связано не только с активацией ее синтеза, но и с гидролизом О-β-D-глюкозилсалицилата, локализованного в клеточной стенке растений. Наряду с глюкозилсалицилатом, в растениях присутствует еще одна конъюгированная форма СК – метилсалицилат. Если глюкозилсалицилат физиологически неактивен и рассматривается как запасная форма СК, то метилсалицилат считается транспортной формой СК, в которую он легко превращается в тканях-мишенях.

СК рассматривается как мобильная молекула, участвующая в передаче информации от клетки, атакуемой патогеном, к другим клеткам. Передвигаясь по сосудам растения, СК последовательно превращает его ткани в иммунизированные, формируя дистанционный тип индуцированной устойчивости. В тоже время далеко не все имеющиеся факты позволяют рассматривать СК в качестве мобильного сигнала для СПУ. Так, решающим аргументом в пользу существования альтернативных СК путей индуцирования устойчивости к фитопатогенам служат результаты, полученные с использованием NahG-трансгенных растений с высокой активностью салицилатгидроксилазы, которая превращает СК в неактивный катехол. При заражении некоторыми патогенами или обработки элиситорами такие растения развивали не только локальную, но и системную устойчивость. Это свидетельствует о том, что передача сигнала о заражении патогеном не только путем транспорта СК. В качестве других мобильных

сигналов рассматриваются изменения содержания жасмоновой кислоты, ее метилового эфира, этилена.

Увеличение содержания СК происходит за счет свободной ее формы, что позволяет предполагать именно активацию синтеза СК, а не распад ее коньюгантов. Увеличение содержания свободной СК сопровождалось возрастанием активности фенилаланинаммонийлиазы, которая является ферментом, лимитирующим скорость синтеза СК на первом его этапе. Повышение активности фенилаланинаммонийлиазы рассматривается как один из механизмов обеспечения устойчивости. Предполагается, что путь накопления СК в растениях при действии патогенов может быть идентичным-биосинтетическим, связанным с образованием транс-коричной кислоты, являющейся предшественником салициловой кислоты.

Снижение СК, которое происходит после «салицилатного взрыва», наблюдающегося в ответ на инфицирование патогенами, либо после подъема, связанного с действием абиотических стрессоров, может быть обусловлено несколькими причинами: ее выходом из клеток в апопласт и проводящие пути растений, превращение в летучий метилсалицилат и его диффузией в окружающее растение воздушное пространство, образованием глюкозильного эфира салицилата и его отложением в клеточных стенках, деградацией СК.

Участие СК в индуцировании устойчивости растений к патогенам в значительной степени связывают с ее способностью усиливать генерацию растительными тканями АФК. Последние принимают участие не только в разрушении вирусов и патогенных микроорганизмов, но и могут выполнять сигнальную функцию, необходимую для формирования СПУ. Также установлена способность СК индуцировать пероксидное окисление липидов (ПОЛ). Этот механизм связан не только с увеличением содержания пероксида водорода и других АФК в тканях под воздействием СК, но и с появлением СК-радикала. СК формирует одновременно два сигнала: один связан с образованием АФК, другой – с появлением физиологически активных продуктов окисления липидов.

Механизм влияния СК на про-/антиоксидантное равновесие могут быть достаточно сложными. Имеют сведения о неоднозначном, как активирующем, так и ингибирующем влиянии СК на разные ферменты, продуцирующие и элиминирующие АФК-каталазу, фенолпероксидазы, супероксиддисмутазу – СОД. Так, относительно каталазы, с одной стороны, есть данные, которые свидетельствуют об ингибировании ее активности под действием СК путем прямого взаимодействия с ферментом, что может

проявляться в условиях in vitro, а с другой – о способности СК индуцировать экспрессию генов каталазы и повышать активность фермента in vivo. СК как in vitro, так и in vivo уменьшала активность каталазы, однако при действии физиологических концентраций СК это угнетение было сравнительно небольшим (до 20%). Одновременно СК увеличивала активность гваяколпероксидазы, в том числе ее апопластной формы, которая рассматривается как один из продуцентов АФК, в частности, супероксидного радикала. Причастность внеклеточной пероксидазы к генерации супероксидного анион-радикала показана и на клетках корней пшеницы.

Под действием СК происходит значительное увеличение активности СОД, превращающей супероксидный радикал в более стабильную АФК – пероксид водорода. Такие изменения активности ферментов под влиянием СК сопровождалось как усилением генерации колеоптилями супероксидного анион-радикала, так и накоплением пероксидов. Изменения активности пероксидазы и СОД нивелировались антогонистами кальция и ингибитором биосинтеза белка циклогексимидом. Усиление генерации АФК также угнетается блокатором кальциевых каналов и антагонистом кальмодулина хлорпромазином. В усилении генерации супероксидного радикала может принимать участие НАДФН-оксидаза, которая, как и пероксидаза относится к кальцийзависимым ферментам и может повышать активность при действии на растительные ткани экзогенной СК.

СК тесно взаимодействует как сигнальный интермедиат с оксидом азота и они совместно принимают участие в реализации информационного потенциала АФК при запуске защитных реакций (например, реакции сверхчувствительности) в случае распознавания растениями патогенна. Такое взаимодействие АФК, СК, NO является синергическим и осуществляется по механизму усиления сигнала. АФК и NO стимулируют синтез СК, которая в свою очередь усиливает АФК-, NO-зависимые ответные реакции. СК и оксид азота усиливают действия друг друга для трансдукции защитных сигналов через общие эффекторные белки. Более того, действую синергично с оксидом азота при активации защитных реакций, СК может быть и его антагонистом.

Существует тесная связь действия СК с накоплением АБК – ключевым «стрессовым» фитогормоном. Так, показано, что обработка растений пшеницы СК приводило к пятикратному увеличению содержания АБК и ИУК в листьях. Они индуцируют образование новых полипептидов с молекулярной массой 19 и 29 кД, усиление синтеза полипептида 25 кД и торможение синтеза полипептида 45 кД. Тарчевский обьясняет данный

эффект возможностью активации под влиянием салициловой кислоты и АБК НАДФН-оксидазной, липоксигеназной и МАР-киназной сигнальных систем.

Известны антагонистические отношения между СК и жасмоновой кислотой. Важными участниками защитных ответных реакций растений являются транскрипт-факторы семейства WRKY, некоторые из них вовлечены во взаимодействие между СК и жасмоновой кислотой как сигнальными молекулами. Транскрипционные факторы, находящиеся под контролем генов семейства wrky, выявлены у многих растений. Они причастны к формированию реакций, обеспечивающих устойчивость к биотическим и абиотическим стрессорам.

В работе Miao, Zentgraf (2007) охарактеризованы транскрипционный фактор WRKY53 и белок ESR. Установлено, что СК и жасмоновая кислота действуют противоположным образом: экспрессия ESR снижается под влиянием СК и активизируется жасмоновой кислотой; экспрессия WRKY53 активируется СК и подавляется жасмоновой кислотой. Соотношение между содержанием СК и жасмоновой кислоты в растениях влияет на старение и устойчивость растений к патогенам; это определяется уровнем экспрессии генов, кодирующих WRKY53 и ESR. Оба соединения индуцируют синтез полипептида с молекулярной массой 29 кД и усиливают образование полипептида 25 кД. Как СК, так и жасмоновая кислота могут активировать липоксигеназную и НАДФН-оксидазную сигнальные системы, что обуславливает их сходство в отдельных реакциях, вызываемых этими фитогормонами.

Сложные взаимодействия между СК и жасмоновой кислотой могут проявляться не только в различном их влиянии на определенные факторы регуляции транскрипции. Не исключена возможность индуцирования синтеза СК под действием жасмоновой кислоты. Показано, что в листьях через некоторое время после обработки экзогенной жасмоновой кислотой происходило увеличение активеости фенилаланинаммонийлиазы – ключевого фермента синтеза СК. С использованием ингибиторного анализа было показано, что индуцирование фенилаланинаммонийлиазы связано с увеличением под действием жасмоновой кислоты активности НАДФН-оксидазы и с накоплением пероксида водорода. Пероксид водорода может выступать в качестве индуктора синтеза экзогенной СК. Ацетилированная форма СК в высокой концентрации ингибирует алленоксидсинтазу – ключевой фермент синтеза жасмоновой кислоты у растений. Кроме того, причастный к пути синтеза жасмоновой кислоты стартовый фермент

липоксигеназной сигнальной системы и контролируемое им пероксидазное окисление липидов ингибируется экзогенной СК.

Сведений о взаимодействии СК с компонентами сигнальных систем пока недостаточно и большинство из них получено на примере формирования взаимоотношений растений и патогенов.

3.3.3.1 ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ ПШЕНИЦЫ

Исследование влияния СК на устойчивость пшеницы в естественных условиях произрастания к возбудителям ряда грибных болезней и ее продуктивность показало, что предпосевная обработка семян СК в оптимальной в стимуляции роста проростков концентрации – 0,05 мМ несколько снижает степень поражения мучнистой росой (в контроле 15-20%, в опыте 10-15%) и балл поражения бурой ржавчиной (4 – в контроле, в опыте между 3 и 4) листьев пшеницы и более заметно понижает индекс развития корневой гнили (в контроле — 1,3 в опыте – 0,8) в основании стебля.

Несмотря на то, что обработка СК не приводит к значительному повышению устойчивости пшеницы к грибному патогенезу в полевых условиях при отсутствии инфекционного фона, она тем не менее оказывает существенный эффект на ее продуктивность.

Структура урожая пшеницы сорта Башкирская 24 при предпосевной обработке СК

Вариант

Длина стебля, см

Длина колоса, см

Количество семян с главного колоса

Масса 1000 семян, г

Масса семян с колоса, г

Урожай зерна, ц/га

Контроль

0,05 мМ СК

70,7

74,6

(106%)

7,3

8,4

(116%)

18,7

23,7

(127%)

35,5

38,2

(115%)

0,67

0,93

(139%)

19,9

27,2

(137%)

Примечание: размер делянок 2м². Ошибка опыта не превышала 4%.

Наиболее часто в практике применения регуляторов роста используют два способа обработки: предпосевное замачивание семян и опрыскивание вегетирующих растений. СК независимо от способа обработки способствует увеличению высоты растений пшеницы, длины колоса, а также количество

семян с колоса и массы 1000 семян. Все эти параметры, особенно два последних определяют продуктивность растений.

Влияние обработки СК на структуру урожая пшеницы сорта Жница

Вариант	Длина стебля, см	Длина колоса, см	Масса 1000 семян, г	Урожай зерна, ц/га
Контроль	63,4	7,8	31,9	27,3
0,05 мМ СК (замачивание семян)	68,3 (108%)	8,7 (112%)	33,9 (109%)	31,5 (115%)
0,05 мМ СК (опрыскивание растений)	65,9 (104%)	8,0 (103%)	33,4 (107%)	30,6 (112%)

Примечание: размер делянок 100 м². Ошибка опыта не превышала 4%.

3.3.4 АБСЦИЗОВАЯ КИСЛОТА

Этот фитогормон необходим для защиты растений. В становлении устойчивости растений важны кратковременные подъемы в уровне АБК на начальных этапах взаимодействия с патогенами, запускающие в растениях антистрессовые программы, связанные с синтезом каллозы. В тоже время, высокие, долговременно поддерживаемые повышенные концентрации АБК снижают эффективность защитных систем, регулируемых салициловой и жасмоновой кислотами и этиленом. Показано, что АБК подавляет экспрессию ряда защитных белков, в том числе, участвующих в синтезе и метаболизме фенольных соединений и лигнина. АБК вовлечена в защитные механизмы растений против патогенов в качестве регулирующего элемента.

АБК важна для многих аспектов роста и развития растений, в том числе, для регуляции газообмена, созревания и прорастания семян, инициации адаптивных изменений, происходящих под влиянием абиотических стрессовых факторов. В связи с резким повышением уровня АБК в этих условиях, ее часто называют гормоном, регулирующим ответ растений на стресс.

Патогенез, будь то грибной, бактериальный или вирусный, также является сильным стрессовым фактором и сопровождается локальными повреждениями, что может способствовать накоплению эндогенной растительной АБК. Кроме того, АБК синтезируется и микроорганизмами, что создает трудности в определении ее роли во взаимоотношениях между растением его патогенами. Подобно высшим растениям в грибах синтез АБК

стимулируется абиотическими стрессами. Схожими являются и пути биосинтеза. В высоких концентрациях АБК стимулирует прорастание спор, сокращает латентный период их роста и усиливает споруляцию. Продукцию АБК грибами многократно индуцируют экстракты, выделенные из растений различных видов, в особенности являющихся потенциальными их хозяевами.

Изначально высокий уровень АБК и последующее его кратковременное накопление придают растениям устойчивость. Долговременный абиотический стресс может помогать активному развитию патогенов. В этом случае АБК, дополнительно вырабатываемая патогенном, представляет супрессор защитных реакций.

Восприимчивость растений к одним патогенам, формирующаяся под влиянием АБК, не противоречит ее участию в запуске защитных механизмов к другим патогенам.

Хотя АБК была открыта более 40 лет тому назад, только в 1984 году было получено первое сообщение об обнаружении в устьицах листьев бобов белков, связывающих АБК. И только в 2002 году был идентифицирован трансмембранный 42 кД белок ABAR, по структуре близкий к Mg-хелатазам. В 2004 году появилось сообщение о выделении из комплекса белков алейронового слоя ячменя 56 кД белка ABAP1, идентифицированного как ядерный белок FCA (Flowering Time Control Protein A), регулирующий цветение. Роль этих рецепторов во взаимоотношениях между растениями и патогенами практически не обсуждается. В качестве рецептора эндогенного сигнала АБК, с большой вероятностью функционирующего при взаимодействиях хозяина и патогенна, следует рассматривать локализованные на плазмалемме белки, которые однако до сих пор не идентифицированы. Наиболее вероятными кандидатами можно было бы считать трансмембранные GCR белки (G-protein-Coupled Receptor), среди которых есть белки участвующие в рецепции патогенов. К этой же группе белков относятся находящиеся под контролем АБК белки GCR1, не связывающиеся с самим гормоном, но регулирующие интенсивность сигнала АБК.

Опосредованный АБК запуск экспрессии защитных белков сопровождается генерацией инозитолтрифосфата, стимулирующего работу кальциевых каналов и последующее накопление и связывание ионов кальция в цитоплазме. Долговременная генерация инозитолтрифосфата тесно связана со снижением в растениях уровня фитоалексинов. АБК, активируя фосфолипазу D, участвует в окислении липидов и синтезе жасмоновой кислоты и в регуляции работы СИУ. Быстрое накопление в растениях диацилглицерол-пирофосфата и фосфатидной кислоты предполагает вовлечение АБК в липидный обмен в растениях и в работу липоксигеназной сигнальной системы. Фосфатидная кислота, участвуя в поляризации плазмалеммы и регуляции К+-ионных каналов, активации G-белков, Са2+-зависимых и Са2+-независимых протеинкиназ, МАР-киназы, НАДФ*Н-оксидазы и, являясь непосредственным кальциевым ионофором, может

оказывать влияние на функционирование кальциевой сигнальной системы. Диацилглицерол-пирофосфат может мимикрировать действие АБК в растениях, что предполагает его важность как вторичного посредника передачи сигнала АБК.

Исследователи связывают снижение устойчивости растений к патогенам под влиянием АБК с ее способностью подавлять СВЧ клеток на инфицирование, снижать экспрессию генов катион-стимулированной АТФазы, белка, инактивирующего рибосомы, анионные пероксидазы клеточных стенок, ФАЛ, β-1,3-глюканазы и синтез фитоалексинов, белков с «цинковыми пальцами» ZFAR1 (Zinc-Finger Contained Ankyrin Repeats), SAZ (SA- and ABA-downregulated zinc finger gene).

Резкие повышения в уровне эндогенной АБК в растениях в ранние фазы патогенеза могут как запускать, так и подавлять работу сотен генов, кодирующих защитные белки. Это связано с наличием в их промоторах специфических цис-элементов, чувствительных к АБК. Среди генов, активирующихся под влиянием АБК, наиболее изучены тауматин-подобные белки, ингибиторы протеиназ, митоген-активируемые киназы (МАР-киназы), фосфатазы, белки богатые пролином, аминоацетилтрансферазы. АБК активирует экспрессию генов рецепторных белков, таких как трансмембранные белки, богатые лейцином, синтаксин-подобные белки SNARE. Выявлено, что SNARE тесно взаимодействует с кальциевыми каналами плазмалеммы плазмалеммы и играет ключевую роль в передвижении ионов К и CL через нее. Белки этого семейства необходимы в защите растений от фитопатогенов и идентифицированы у ячменя как гены ROR2. Под влиянием АБК в растениях активируются киназы, многие из которых являются трансмембранными сигнальными белками.

Раннее накопление эндогенной АБК является важным условием последующего каскадного синтеза оксидоредуктаз, регулирующих уровень АФК и NO в растениях. Причем, NO и Н2О2 вовлекаются в систему трансдукции сигнала АБК в качестве вторичных посредников и участвуют в формировании как СПУ, так и СИУ, а также формированию в зоне инфицирования СВЧ-реакции. Выявлены различия в воздействии Н2О2 и АБК на экспрессию ряда защитных генов. Так, если часть из них усиливала свою транскрипционную активность под влиянием и Н2О2 и АБК, то другие гены повышали или снижали ее только при участии или Н2О2, или АБК. АБК избирательно активирует НАДФ*Н-оксидазу, супероксиддисмутазу, аскорбатпероксидазу, глутатионредуктазу и повышает концентрацию глутатиона, токоферола, каротиноидов и аскорбата. Активация про/антиоксидантных ферментов, происходящая через 5-7 часов после обработки АБК, тесно связана с накоплением в них NO. Несомненным следствием активации оксидоредуктаз являются значительные изменения в генерации и утилизации АФК и NO, которые каскадно активируют генетические механизмы, чувствительные к АФК и NO.

АБК занимает заметное место и в органоспецифической регуляции генов, кодирующих различные изоформы каталаз и пероксидаз. Влияние АБК на активность пероксидазы зависело как от времени воздействия, так и от концентрации фитогормона. Если кратковременное воздействие АБК повышало активность фермента, то долговременно удерживаемые ее высокие концентрации снижали эту активность. В связи с важностью пероксидазы в формировании устойчивости как к абиотическим, так и биотическим стрессам следует учитывать многообразие ее изоформ в растениях, предпологающее дифференцированную активацию или подавление отдельных изопероксидаз, где экспрессия, например, анионных пероксидаз находится под непосредственным контролем АБК.

АБК участвует в экспрессии гена цитохрома Р450, нарушение работы которого драматически снижает устойчивость растений к патогенам. Важно, что цитохром Р450 является белком, с высокой аффинностью, связывающимся с АБК.

Противоречивы данные о влиянии АБК на СВЧ-реакцию клеток растений. Так, Jiang и Zhang отмечали развитие такой реакции под влиянием высокой концентрации АБК с участием НАДФ*Н-оксидазы. С другой стороны, способность высоких концентраций АБК в значительной степени снижать синтез ФАЛ и ее активность приводила к снижению уровня фитоалексинов, салициловой кислоты и фенольных соединений. Это способствовало снижению интенсивности лигнификации и защитного ответа, связанного с СВЧ-реакцией клеток. В АБК- дефецитных мутантных растениях происходило многократное и более раннее накопление апопластной Н2О2 и торможение роста гриба в зоне инфицирования за счет более специфичного и быстрого укрепления клеточной стенки. Правда, быстрая активация каталазы под влиянием АБК в этих условиях может оказать «медвежью услугу» для растений при грибном патогенезе, поскольку в этом случае исключается защитный эффект АФК, интенсивно генерируемых растениями.

Инфицирование патогенами приводит к синтезу этилена. Позднее АБК, накапливаясь под влиянием этилена как вторичный посреник, запускает механизмы, присущие только ей, связанные с временным торможением практически всей физиологической активности растения. В этих условиях АБК проявляет себя как антагонист этилена и тормозит реакции, индуцируемые этиленом.

АБК участвует в регуляции биосинтеза жасмоновой кислоты, что доказано с использованием дефицитных по АБК растений. Поэтому часть генов, активно экспрессирующихся при поранении и воздействии жасмоновой кислотой, необходимо считать индуцируемыми АБК. Жасмоновая кислота и АБК по-раному запускают экспрессию некоторых генов, например, ингибиторов протеиназ. Так, если первая регулирует этот процесс посредством активации фосфатаз, то вторая – через киназы.

АБК подавляет транскрипционную активность части защитных генов, чувствительных к жасмоновой кислоте. Следовательно, подьем уровня АБК на фоне подавления СИУ может предотвращать накопление защитных белков, происходящее под влиянием фитопатогенов и жасмоновой кислоты. Экзогенное применение жасмоновой кислоты в этих условиях не восстанавливало их экспрессию, что говорит о необратимости этого процесса.

3.4 ХИМИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА, ПОВЫШАЮЩИЕ УСТОЙЧИВОСТЬ ЗЛАКОВ

3.4.1 ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ СВОЙСТВАМИ ЦИТОКИНИНОВ, НА БАЛАНС ИУК И АБК В РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ

Фитогормонам отводят ключевую роль в регуляции интегральных физиологических процессов растительных организмов, в том числе и ответных реакций на воздействие неблагоприятных факторов среды. Изменения в гормональном балансе имеют важное значение в проявлении антистрессового действия препаратов, повышающих устойчивость и продуктивность пшеницы. Более того, индукторы устойчивости часто сами являются регуляторами роста или обладают их свойствами. К таковым, в частности, относятся такие соединения, как картолин, бисол 2, байтан, салициловая кислота. Это позволяет предполагать вероятность их активного воздействия на эндогенный гормональный статус растений. Следовательно, изучение влияния защитных препаратов на сдвиги в гормональном балансе при неблагоприятных воздействиях является важным для оценки механизмов регуляции индуцирования повышения устойчивости и продуктивности растений.

Анализ влияния предпосевной обработки семян пшеницы бисолом 2 и байтаном на уровень ИУК и АБК в листьях пшеницы в ходе онтогенеза выявил существенные сдвиги в их балансе в обычных условиях произрастания и при инфицировании. Препараты в отсутствии инфекции также вызывали некоторое повышение содержания АБК, наблюдаемое на протяжении онтогенеза (приложение: рисунок 3 и 4), которое не сопоставимо по своему уровню с резким накоплением АБК при заражении (приложение: рисунок 5).

Индуцированное обработкой защитными препаратами накопление АБК можно рассматривать как проявление слабого химического стресса, которое, однако, может способствовать развитию антистрессовых реакций, поскольку именно АБК отводят значительную роль в их индукции. Вероятно, это может лежать в основе развития в растениях под влиянием защитных препаратов механизмов предадаптации возможным стрессовым ситуациям и вследствие этого снижения степени их повреждающего действия на растительный организм.

Изменение уровня АБК является важным звеном и в действии другого триазолового фунгицида – тетраконазола, который рассматривается в качестве активатора защитных реакций растений как к биотическим, так и к абиотическим факторам.

Вызванное обработкой препаратами увеличение уровня АБК было вполне благоприятным для растений, в связи с тем , что балансировалось одновременно повышением содержания в них ИУК , играющей важную роль в активации метаболических процессов, лежащих в основе роста растений. В то же время препараты предотвращали вызванное инфицированием резкое накопление АБК в листьях и способствовали поддержанию высокого уровня ИУК на протяжении онтогенеза пшеницы. Однако не следует забывать, что байтан является эффективным фунгицидом системного действия, обладающим способностью подавлять в растительных клетках развитие патогенного гриба, благодаря ингибированию синтеза эргостерола. Действие бисола 2 и байтана на эндогенную систему гормональной регуляции растений включается в повышение под их влиянием устойчивости пшеницы к грибным болезням и ее продуктивности.

Препараты байтан и бисол 2 вызывают также существенное увеличение содержания АЗП в проростках., вызванное ими увеличение уровня АЗП является АБК-контролируемым и таким образом лектин вовлекается в механизмы защитного действия этих соединений, способствующих предадаптации пшеницы (приложение: рисунок №6).

3.4.2 ВЛИЯНИЕ БЕНЗИЛМЕДАЗОЛА НА ЮВЕНИЛЬНУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ ЭГИЛОПСОВ К ЛИСТОВЫМ БОЛЕЗНЯМ

Запас эффективных генов устойчивости к вредоносным болезням в генофонде мягкой пшеницы крайне ограничен. Один из возможных путей его расширения интрогрессия генов от диких сородичей. Среди них важную роль играют роль виды рода Aegilops L. Для изучения ювенильной устойчивости злаков к листовым болезням нередко используется метод инокуляции патогенами отрезков листьев, помещенных в водный раствор бензимидазола (40-60 мг/л). Данное химическое вещество вызывает генотип специфичную индукцию устойчивости пшеницы и ячменя к ряду листовых болезней, что может привести к ошибочной классификации восприимчивых образцов как устойчивых. В ВНИИ Растениеводства имени Н. И. Вавилова изучали реакцию отрезков первых листьев образцов 4 видов эгилопсов, помещенных на вату, смоченную раствором бензимидазола либо водой на заражение сборной популяцией возбудителя бурой ржавчины (Puccinia recondita) и высоко агрессивным изолятом возбудителя септориоза (Staganospora nodorum). Реакцию интактных растений изучали в полевых условиях (Пушкинские лаборатории ВИР, 2003 г.) на естественных инфекционных фонах обеих болезней. Все образцы устойчивые при заражении отрезков листьев на воде были устойчивы и в полевых условиях. Образцы видов Aegilops cylindrical (и-598973, 598980, 598993, 599030) и Aegilops tauschii (и-

599011, 599031) в полевых условиях и при инокуляции листьев, помещенных на воду, были восприимчивы к бурой ржавчине. При инокуляции отрезков листьев, помещенных на воду, эти же образцы проявляли устойчивый тип развития (балл 0). У 3 образцов Aegilops tauschii (и-599011, 599031) и Aegilops cylindrical (и-598973, 598980, 598993, 599030), сильно поражающихся в поле септориозом (балл 6), подтвердились данные о влиянии бензимидазола на устойчивость: при исскуственном заражении отрезков листьев, помещенных на воду, эти образцы были восприимчивы (балл 6), но проявили реакцию устойчивости при заражении отрезков листьев на бензимидазоле (балл 0,2).

Бензимидазол вызывает генотип специфичную индукцию устойчивости у различных представителей рода Aegilops L. к листовым болезням (бурой ржавчине и септориозу).

(с сайта www.tyr@NA8418.spb.edu)

О других фунгицидах защищающих пшеницу смотреть в приложении таблица №3.

ВЫВОДЫ

Среди известных, количество эффективных Lr-генов ограничено, и их число с каждым годом сокращается в результате появления в популяции патогенна новых вирулентных и агрессивных рас и биотипов, преодолевающих устойчивость. Поэтому среди селекционного материала нужно постоянно вести поиск устойчивого материала, с эффективными Lr-генами, ко всем вирулентным и агрессивным патотипам. Эти исследования весьма значимые и актуальные для селекции пшеницы на устойчивость к возбудителю заболевания.
К числу неспецифических ответных реакций растений на воздействие стрессоров относятся сдвиги в гормональном балансе, связанные не только с резким накоплением АБК, но и снижением содержания фитогормонов с явно выраженным ростостимулирующим эффектом, что является важным в переключении функциональной активности клеток с обычных на стрессовые программы. Ключевая роль в ответе принадлежит АБК, этилену и СК, которые участвуют в индукции экспрессии генов разнообразных шоковых и некоторых присущих норме белков, задействованных в защите целостности клеточных структур от повреждений.
При анализе действия природных и синтетических регуляторов роста, обладающих антистрессовой активностью (биорегуляторы) выявляются общие закономерности их влияния на функционирование гормональной системы растений при стрессе. Предобработка пшеницы салициловой кислотой, картолином, бисолом 2, байтаном индуцирует накопление АБК, что способствует повышению устойчивости пшеницы. При этом биорегуляторы вызывают одновременно увеличение содержания ИУК, что может обеспечивать протекание процессов метаболизма клеток на высоком уровне и предотвращать снижение продуктивности растений при стрессе.
К неспецифическим ответным реакциям можно отнести и накопление лектина, PR-белков содержание которых в несколько раз возрастает при инфицировании.
Листья различных сортов озимой пшеницы отличаются интенсивностью выделения этилена. Более устойчивые сорта, такие как Смуглянка и Колумбия продуцировали большее количество этилена, чем неустойчивые Белоцерковская полукарликовая и Подолянка. Колеоптили содержали также различные количества жирных кислот: наибольшее суммарное количество обнаружено у устойчивых сортов, наименьшее – у неустойчивых. Содержание этилена и жирных кислот можно использовать в качестве тестовых показателей.

Чем выше активность ФК, тем более устойчив сорт к ржавчине. Это можно объяснить следующим образом при поражении растения грибком резко усиливаются процессы катаболизма, особенно глютамата. Сорта, имеющие высокую активность ФК, активнее расщепляют глютамат по нетоксическому пути без выделения аммиака, и поэтому они в меньшей степени повреждаются при ржавчинных болезнях по сравнению с неустойчивыми генотипами. Высокая активность ФК повышает жизнеспособность устойчивых сортов и сопротивляемость к ржавчине. Это позволяет рекомендовать активность ФК МДГ-ГОАТ (ферментный комплекс малатдегидрогеназа-глютаматоксалоацетатаминотрансфераза) в качестве маркерного признака к ржавчинным болезням.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Гойман Э. Инфекционные болезни растений, перевод с немецкого. Москва, 1954. 100 с.
Вердеревский Д. Д. Иммунитет растений к инфекционным болезням. Кишинев, 1968. 80 с.
Горленко М. В. , Рубин Б. А. Иммунитет растений // Защита и карантин растений, 2001, №8. С. 16 – 19.
Ерохина С. А. Сорта озимой и яровой пшеницы, устойчивые к болезням и вредителям // Агробюллетень КАРО, 2005, №5. С. 24 – 30.
Киселева М.И., Коваленко Е.Д. Жемчужина А.И., Куркова Н.Н. Вирулентность патотипов бурой ржавчины на линиях пшеницы с генами возрастной устойчивости // АГРО XXI. 2004/2005, №7-12. С. 25-29.
Лебедев В.Б. Ржавчина пшеницы // Саратовский государственный аграрный университет. 1998. С. 295.
Пересыпкин В. Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. М.: «Колос», 1969. 479 с.
Розанов Ю. Л. Перенос спор бурой ржавчины при различных метеорологических условиях и синоптических ситуациях // Эпифитотии сельскохозяйственных культур, их прогноз и профилактика. I. Фитопатологическое прогнозирование как основа создания рациональных систем защиты растений. Сб. докладов научной конференции. 1983. С. 51-58.
Семенов О.Г. Аллоцитоплазматическая пшеница. Биологические основы селекции: Монография. М.: Изд-во РУДН, 2000. С. 208.
Семенов О.Г. Влияние ядерно-цитоплазматических взаимодействий на проявление адаптивных и хозяйственно ценных признаков у пшеницы // Тез. докл. Междунар. генет. конгр. М.: Наука, 1998. Ч.1. С. 434.
Шумный В.К. Генная и хромосомная инженерия растений // Сельскохозяйственная биология. 2004, №7. С. 12-16.
Койшибаев М., Понамарева Л. А., Кочарев А. О. Динамика болезней зерновых культур с листостебельной инфекцией в различных агроландшафтных зонах // Материалы Междунар. научно – теорет. конф. «Стратегия земледелия и растениеводства на рубеже XXI в». Алматы: Бастау, 1999. С. 108-110.
Эйгес Н.С., Вайсфельд Л.И., Волченко Г.А. Повышение эффективности внутривидовой гибридизации методом химического мутагенеза // Материалы докладов 1-ой Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов». 2001.

Ячевская Г.Л., Наумов А.А. Использование метода отдаленной гибридизации в селекции пшеницы. М., 1990.
Кудиярова Ж.С. Изучение ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчине. Алматы, 2009. С. 39-45.
Дьяков Ю. Т. Молекулярно – генетические основы взаимоотношений растений с грибными и бактериальными инфекциями // успехи современной генетики.1994, №19. С. 25-48.
Турапин В. П., Мостовой В. А. Ржавчинные болезни зерновых культур в Республике Казахстан и борьба с ними. Алматы, 1995. 141 с.
Бурмистрова Н. А., Красавина М. С. Салициловая кислота – один из регуляторов флоэмной разгрузки. // 4-й Съезд О-ва физиологов раст. России. Междунар. конф. «Физиология растений – наука 3-го тысячелетия», Москва, 4-9 октября, 1999. С. 117.
Васюкова Н. И., Озерцовская О. Л. Индуцированная устойчивость и салициловая кислота (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т. 43, №4. С. 405-411.
Головатюк Є. О., Ситар О. В., Таран Н. Ю. Роль оксиду азоту в захисних реакцiях рослинного органiзму. // Физиология и биохимия культурных растений. 2008. Т. 40, №1. 15-20 с.
Дмитриев А. П. Сигнальные молекулы растений для активации защитных реакций в ответ на биотический стресс. // Физиология растений. 2003. Т. 50, №3. 465-474 с.
Дмитриев А. П. Сигнальная роль оксида азота у растений. // Цитология и генетика. 2004. Т. 38,№4. 67-75 с.
ДмитриЄв О. П., Кравчук Ж. М. Активнi форми кисню та iмунiтет рослин. // Цитология и генетика. 2005. Т. 39, №4. 64-75 с.
Молодченкова О. О. Предполагаемые функции салициловой кислоты в растениях. // Физиология и биохимия культурных растений. 2001. Т. 33, №6. 463-473 с.
Тарчевский И. А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 2002. С. 294.
Фатхутдинова Д. Р., Сахабутдинова А. Р., Максимов И. В. Влияние салициловой кислоты на антиоксидантные ферменты в проростках пшеницы. // Агрохимия. 2004. №8. 27-31 с.
Бадаева Е. Д., Прокофьева З. Д., Билинская Е. Н. цитогенетический анализ устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе гибридов, полученных от скрещивания мягкой пшеницы (Triticum aestivum Linney, AABBGG) с пшеницами группы Timopheevi (A^tA^tGG)// Генетика. 2000. Т. 36. №12. 1663-1673 с.
Вавилов Н. И. Очерк современного состояния учения об иммунитете хлебных злаков к грибным заболеваниям// Тр. Селекционной станции при МСХИ. 1913. Выпуск 1. 113-158 с.

Бабаянц Л. Т. Генетика устойчивости пшеницы к основным болезням// Проблемы повышения устойчивости зерновых культур и подсолнечника к болезням и вредителям. Сборник научных трудов ВСГИ. 1990. 5-15 с.
Будашкина Е. Б., Дьяков Ю. Т., Жуковский П. М. Генетические основы селекции растений на иммунитет. М.: Наука, 1973. 120-134 с.
Крючкова Л. А., Маковейчук Т. И., Курчий Б. А. Синтез этилена листьями проростков озимой пшеницы различной устойчивости к фитопатогенам и полеганию// Физиология и биохимия культурных растений. 2005. Т. 37, №3. 254-259 с.
. Курчий Б. А. Содержание этилена и жирных кислот у различных сортов озимой пшеницы// Физиология и биохимия культурных растений. 2008. Т. 40, №3. 206-213 с.

САЙТЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

www.tyr@NAspb.edu;

ПРИЛОЖЕНИЕ

Рисунок 1: Цикл развития бурой ржавчины

Рисунок 2: Бурая ржавчина вызывается грибом Puccinia triticina и поражает листья растения:

Рисунок №3. Влияние предпосевной обработки семян бисолом 2 на содержание АБК и ИУК в листьях пшеницы в фазе кущения (а) и трубкования (б): 1 – здоровые, необработанные; 2 – инфицированные, необработанные; 3 – здоровые, обработанные; 4 – инфицированные, обработанные.

а):

б):

Рисунок №4. Влияние предпосевной обработки семян байтаном и заражения на содержание АБК и ИУК в листьях пшеницы в фазе кущения (а) и трубкования (б): 1 – здоровые, необработанные; 2 – инфицированные, необработанные; 3 – здоровые, обработанные; 4 – инфицированные, обработанные.

а):

б):

Рисунок №5. Влияние заражения на уровень АБК и ИУК в листьях пшеницы в фазах кущения и трубкования.

Рисунок №6. Индукция накопления АЗП под влиянием препаратов, повышающих устойчивость растений к инфицированию патогенами. Анализ содержания АЗП в основаниях стебля 7-суточных проростков пшеницы, предобработанных бисолом 2 и байтаном (а). уровень АЗП в корнях 4-суточных проростков пшеницы, выдержанных на растворе СК в течение 8 часов (б).

а):

б):

Русский мужчина обратился к Юлии Навальной и…

Путин обращался к шаманам за благословением на…

В Алматы автобус упал с моста

Трамп не пойдет на второй раунд дебатов…

США выделят Украине пакет помощи более чем…

Трамп готов решить украинский кризис до своей…

Эрдоган призвал мусульман объединиться против Израиля

В сто раз может вырасти стоимость услуг…

Следственные органы РФ возбудили уголовное дело в…

Почему Монголия не арестовала Путина?

Дипломная работа: Тестирование ряда злаковых на устойчивость к ржавчине

Казахстанская дзюдоистка вошла в топ-10 мирового рейтинга

Венгрия и Казахстан построят совместный завод по переработке семян

Больше 200 человек эвакуировали из-за пожара в Петропавловске

До конца месяца Италия направит в Украину новый зенитно-ракетный комплекс

Казахстан занимает 67-е место в мировом рейтинге заработной платы, отставая от Молдавии

О НАС

Мобильное приложение

Наши контакты