Диплом: Антоновка — ведущий сорт яблонь

СОДЕРЖАНИЕ

 

                                                                                                                     Стр.

 

            Введение ………………………………………………………………….  7                                                                                                      

1. Обзор литературы…………………………………………………… 9

1.2.История Антоновки………………………………………………….   11

1.3.Изменения  Антоновки.……………………………………………     14

1.4.Характер Антоновки..………………………………………………    16

1.5.Микроклональное размножение растений и его преимущества….  18

1.6.Термотерапия плодовых культур…………………………………      32

2. Экспериментальная часть …………………………………………. 40

     2.1.Отбор и стерилизация растительного материала……………………  44

     2.2.Приготовление агаризованных питательных сред…………………  51

     2.3.Влияние состава питательной среды на регенерацию и развитие

           эксплантов Антоновки      in vitro..…………………………………  52

3.Экономическая эффективность выращивания 1 тыс. шт. саженцев

Антоновки биотехнологическим методом (in vitro)……………….  58

4.Охрана труда и окружающей среды      …. .………………………  60

4.1.Организация труда в лаборатории     ……………………………..    60

4.2.Охрана окружающей среды     …………………………………….    68

5. Заключение………………………………………………………… 70

          6.Список использованной литературы………………………………  72

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

               В своем послании Президент РК Н.А. Назарбаев народу Казахстана «Через кризис к обновлению и развитию» говорил об агропромышленном комплексе, благодаря развитию которого одновременно решается две важнейшие для страны задачи – обеспечение продовольственной безопасности и диверсификация экспорта. Поэтому приняли решение продолжить финансирование инвестиционных проектов по развитию экспортно-ориентированных производств, таких как организация и развитие молочно-товарных фирм, птицефабрик, откормочных площадок, организация производства плодово-овощных  культур с применением капельного орошения, создание производства по сборке сельскохозяйственной техники, развитие мясоперерабатывающих производств, переработки тонкой шерсти, инфраструктуры импорта казахстанского зерна и его глубокой переработки» (1).

Антоновка- был, есть и еще на долгие годы останется ведущим сортом яблони, восхищая всех высокими качествами своих плодов, что и побудило нас вернуться к этому сорту, впервые изучить его онтогенез и способы его регулирующие в культуре тканей.Однако при решении этого вопроса возникают трудности в выборе маточных деревьев,т.к. в практическом садоводстве имеет место вегетативная изменчивость сорта через почковые мутации. Изменения происходят по окраске, величине, форме, лежкости и качеству плодов, по времени созревания и урожайности, зимостойкости, устойчивости к вредителям и болезням. Но не всегда почковые клоны бывают с положительными уклонениями. Имеются многочисленные отечественные и зарубежные данные о засорении районированных сортов примесями этих же сортов с отрицательными уклонениями. Одна из причин вариаций деревьев яблони – беспорядочное размножение, которое может привести к еще большому ухудшению сорта.

 Исходя из этого  ставится задача размножить  через культуру тканей отборные клоны Антоновки, изучить  особенности онтогенеза и способов его регулирования в культуре тканей и получить корнесобственный материал Антоновки  для изучения его биологических  особенностей.

Единственный  путь  развития  отраслей  растениеводства —  их  интенсификация  через  постоянное  сортообновление,  внедрение  интенсивных   технологии  производства  продукции,  в  том  числе  и  высококачественного  посадочного  материала.  Одним  из  приоритетных  направлений  национальных  экономик  ведущих  стран  мира  по  решению  этой  проблемы  стала  биотехнология.  Значительный  резерв  увеличения   продукции  садоводства  заключается  в  снижении  потерь  от  вирусных  и  микроплазменных  болезней.  Большие  и  постоянные  потери  урожая,  вызываемые  вирусными  хроническими  заболеваниями  плодовых  культур,  требует  перевода  питомниководства  на  производство  свободного  от  вирусов  посадочного  материала,  с  использованием  современных,  надежных  экспресс- методов  вирусологического  контроля.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 

       В  последние  годы  внимание  ученых  и  практиков  привлекают  методы  диагностики,  оздоровления  и  ускоренного  размножения  растений  с  использованием  молекулярных  и  клеточных  технологий  таких  как,  серологические  методы  и  культура  тканей.  Использование  этих  методологий,  в  настоящее  время,  является  определяющим  в  диагностике  вирусных  заболеваний,  культуры  изолированных  тканей  и  органов  на  искусственных  питательных  средах;  ускоренного  клонального  размножения  безвирусных  растений,  в  том  числе  и  плодовых  культур,  закладки  суперэлитных  маточных  ценных  сортов,  изучения  и  внедрения  в  производство  новых  технологий,  таких  как  корнесобственная  культура  плодовых  растений.  Помимо  этого,  биотехнологическими  методами  можно  быстро  размножить  в  нужных  количествах  любой  ценный  клон  растения,  а  также  трудно  размножаемые    в  обычных  условиях  виды  растений,  длительно  хранить  пробирочные  растения  при  пониженных  температурах  и  создать  «банк»  ценных  форм  растений,  обмениваться  растительным  материалом   в  пробирках  без  риска  заноса  карантинных  объектов.

          Прогресс  современной  сельскохозяйственной  биотехнологии  в  растениеводстве  в  настоящее  время  неразрывно  связан  с  расширением  и  совершенствованием  арсенала  используемых  методов  исследований  и,  в  первую  очередь,  молекулярной  биотехнологии.  С  каждым  годом  биотехнологические  исследования  в  области  молекулярной  биологии  и  биотехнологии  дают  новые  успешные  результаты.  Исторически,  биотехнология  растений  начала  свое  становление  еще  с  1935  года,  когда  А.Н.Белозерский  выделил  ДНК  из  растений.  В  1944  году – О.Т.Аvery    установил,  что  ДНК  является  носителем  генетической  информации.  В  1953  году  J.Watson  F.Crick  создали  модель  двойной  спирали  ДНК  на  основе  рентгенограмм.

С  интенсификацией  садоводства,  развитием  фермерских  хозяйств,  требуются  закладки  новых  современных  садов,  необходимо  большое  количество  посадочного  материала.  Стандарты  на  посадочные  материалы  требует  его  оздоровления    от  вирусной  и  микроплазменной  инфекций.  Решение  этих  вопросов  связанно  с  изучением  вирусных  и  микроплазменных  болезней,  их  распространения,  вредоносности,  диагностики,  оздоровления  и  размножения.

Современная  система  безвирусного  растениеводства  включает  в  себя,  как  основные  составляющие  звенья – диагностику  с  превличением  серологических  методов,  оздоровление  и  клональное  размножение  через  культуру  тканей.

Последнее  представляет  собой  массовое  бесполое  размножение  в  искусственных  условиях,  на  питательной  среде  в  культуре  тканей  и  клеток.  Основано  клональное  размножение,  на  способности  живых  клеток  растений  реализовать  тотипотентность  до  формирования  целого  организма  с  сохранением  всех  признаков  исходного  растения  (2).

В  научно – практическом  отношении  были  поставлены  задачи  по  диагностике,  в  том  числе  и  молекулярной,  оздоровлению  и  клональному  размножения  плодовых  культур  с  изучением  генотипических  особенностей  микроклонированной  корнесобственной  Антоновки  в  условиях  in  vivo  среди  которых:

— диагностика  вирусных  болезней  плодовых  культур  Казахстана;

— клональное  микроразмножение  оздоровленных  плодовых  культур  в  системе  производства  безвирусного  посадочного материала;

 

 

 

1.2.История Антоновки.

В настоящее время Антоновка является сортотипом, объединя­ющим ряд родственных между собой сортов. Часть из них, напри­мер, Антоновка сладкая, Антоновка репчатая, Антоновка беспе­риодичная и др., возникли в результате появления на деревьях исходного сорта устойчивых изменений и последующего их раз­множения. Следовательно, такие сорта — измененные клоны пер­воначально существовавшей типичной Антоновки. Некоторые же из них, как например Антоновка белая, вероятно, произошли из семян Антоновки.

Кроме этих народных сортов, представляющих собой изменен­ные клоны или сеянцы Антоновки, имеются новые селекционные сорта, выведенные путем скрещивания ее с другими сортами: Ан­тоновка шафранная И. В. Мичурина, Антоновка новая С. Ф. Чер­ненко, Антоновка-китайка В. В. Спирина и др.

Из всех ныне существующих форм Антоновки, возникших как ее вегетативные уклонения или сеянцы, самое широкое распро­странение получила типичная Антоновка, как наиболее хозяйст­венно ценная форма этого сортотипа. Для того чтобы отличать ти­пичную Антоновку от других Антоновок, ей присвоено название Антоновка обыкновенная.

Антоновка обыкновенная — лучший среднерусский сорт на­родной селекции. Прямых свидетельств о месте и времени возник­новения его нет. По литературным данным, этот сорт начал распространяться из бывшей Курской губернии в половине XIX века. Есть основания предполагать, что там, в Курском садовод­ческом районе, находится его родина.

Антоновка благодаря своим ценным свойствам из бывшей Курс­кой губернии быстро начала распространяться в средней полосе РСФСР, в Белоруссии, Прибалтике, в северных и отчасти цент­ральных районах Украины и др. Здесь она стала основным про­мышленным сортом. Позже ее начали выращивать в горных зонах Дагестана, Северной Осетии, Армении, где этот сорт теперь зани­мает значительное место в сортименте яблони.

На Украине, по данным Всесоюзной переписи садов в 1970 г., Антоновка по распространенности в садах колхозов и совхозов занимает третье место (7,2% всех деревьев яблони) после Ренета Симиренко и Кальвиля снежного, а в группе осенних сортов ей принадлежит первое место (24,3%). Наибольше этот сорт на Ук­раине выращивают в Черниговской, Сумской, Харьковской, Пол­тавской, Житомирской и Волынской областях.

Таким образом, Антоновка благодаря своим неоспоримым достоинствам распространилась в СССР так широко, как ни один другой сорт яблони. Однако с продвижением па юг и восток, где осадков выпадает меньше, а лето жарче, качества плодов этого сор­та заметно ухудшаются: мякоть их становится менее сочной, спе­цифический очень приятный аромат Антоновки ослабевает, а глав­ное — сильно уменьшается лежкость плодов. Если в Московской, Тульской, Калужской областях Антоновка — типичный зимний сорт, то в северных областях Украинской ССР — осенний.

Во всех областях Украины, где выращивается Антоновка, де­ревья ее вполне зимостойки, только в исключительно суровые зимы они очень слабо подмерзают. Так, в суровую зиму 1971/72 г. на Менском сортоучастке плодоносящие деревья этого сорта очень слабо пострадали от морозов (на 1 балл), а на Решетпловском (Полтавская область) совсем не подмерзли.

Деревья Антоновки начинают плодоносить на 6—8-п год после посадки в сад и дают высокие урожаи через год, а в более влажных районах высокий урожай дерева чередуется со слабым. На Ровен­ском сортоучастке в 1971 г. урожай деревьев Антоновки посадки 1959г. составил 389, а в 1972г. — 66 ц/га. Средний урожай за шесть лет (1967—1972) па этом сортоучастке Антоновка дала 127 ц/га, Пепин шафранный — 165, Слава переможцям — 150 и Уэлси — 128 ц/га.

Плоды снимают в конце августа — первой декаде сентября; в обычных плодохранилищах они могут храниться 1,5—2 месяца. Вкус их от вышесреднего до хорошего (3,5—4 балла).

По использованию плодов Антоновка является сортом универ­сального назначения. Плоды ее потребляются в пищу в свежем ви­де, очень хороши в мочке, являются высококачественным сырьем для различных видов технической переработки. Их широко ис­пользуют для приготовления яблочного теста, мармелада, пастилы, желе, пектина. Пригодны они также на сушку, для варенья и пло­дового вина. Среди сортов яблони Антоновка особенно выделяется своими ценными технологическими свойствами.

По данным Всесоюзного научно-исследовательского института садоводства им. И. В. Мичурина (Е. П. Франчук), химический со­став Антоновки таков: общее количество Сахаров — 9,9%, общая кислотность (по яблочной кислоте) — 0,81, пектин — 0,54%, витамип С — 86,5 лез%. Следует отметить, что в плодах Антоновки обыкновенной витамина С содержится больше, чем во всех других старых сортах яблони.

Достоинства сорта: высокая зимостойкость и урожай­ность, высокая товарность и пригодность плодов к различным видам переработки.

Недостатки  сорта:   периодичность плодоношения, ма­лая лежкость плодов.

Сорт районирован в девяти областях Украины, в 42 областях и автономных республиках РСФСР, в шести областях Белоруссии, в Латвийской, Литовской и Эстонской ССР.

Дерево сильнорослое, в молодом возрасте имеет неправильно округлую, довольно компактную, приподнятую кверху крону, ко­торая по мере наступления наиболее продуктивного периода ста­новится развесистой, но не плакучей. Плодоношение сосредото­чено преимущественно на кольчатках и копьецах, а также на не­больших ветвях с затухающим приростом, оканчивающимся разветвленными кольчатками. Ветви кроны значительно изогнуты, коленчатые, образуют прочный скелет. Побеги тонкие, слабоопу-шенные, в сечении граненные, коленчатые в узлах, с очень проч­ной древесиной. Листья широкие или продолговатые, значительно изогнутые, морщинистые, на коротких черешках. Край листа при-тупленно-пильчатозазубренный. Прилистники крупные, лан­цетные.

Плоды крупные или выше средней величины, весом 120— 150г, иногда 170 г, слабо-приплюснутоокруглые (стаканчатые), слегка конические к чашечке с заметными по всей длине плода гранями и ребрами, сильнее выраженными вокруг чашечки. Блюдце глубокое, складчатое; воронка глубокая, узкая, лучисто-оржавленная. Чашечка закрытая; плодоножка толстая, короткая, не выходит из воронки, а у наиболее крупных плодов не достигает ее краев. Окраска при созревании зелеповато-желтая, иногда с золотистым загаром па солнечной стороне, а иногда — со слабым размытым кирпичного или розового цвета румянцем. Мя­коть слегка желтоватая, сочная, средней плотности, с некоторым избытком характерной кислоты и с особым привкусом, неповтори­мым «Антоновским» ароматом, приятного вкуса. Семенные камеры закрытые или слабоприоткрытые. Срок потребления плодов — зим­ний, раннезимний, позднеосенний или осенний — в зависимости от района произрастания, на Украине — сорт осенний.

Отличительные признаки сорта: крупные желто­вато-зеленые плоды на коротких толстых плодоножках; воронка глубокая, узкая, лучисто-оржавленная; характерный для Антонов­ки аромат и вкус мякоти; коленчатые, тонкие, граненые в сечении побеги с очень прочной древесиной; короткие толстые черешки листьев с выраженными ланцетными прилистниками у осно­вания.

 

1.3.Изменения Антоновки.

Известно  около  десяти  разновидностей  яблони,  отличающихся  главным  образом  различной  степенью  окраски  и  незначительной  разницей  в  сроках  созревания,  а  также  вкусом  и  лежкостью  плодов.

Почковые  мутации,  обычно  возникающие  спонтанно  у  отдельных  сортов,  бывают  весьма  ценными  или,  наоборот,  совершенно  не  желательными.  Изменения  происходят  по  окраске,  величине,  форме,  лежкости  и  качеству  плодов,  а  также  по  времени  созревания  и  урожайности,  зимостойкости,  устойчивости  к  вредителям  и болезням.  Используя  почковые  вариации,  американские  ученные  выделили  свыше  97  окрашенных  форм  у  сортов.

Но  не  всегда  почковые  сорта  (клоны)  бывают  с  положительными  уклонениями.  Имеются  многочисленные  отечественные  и  зарубежные  данные  о  засорении  районированных  сортов  примесями  этих  же  сортов  с  отрицательными  уклонениями.

Чтобы  сохранить  сорт  Антоновки,  в  Помологическом  саду  проводят  сортоулучшающи  отбор.  Очень  разнообразна  и  окраска  плодов. При  этом  изменении  Антоновки  происходят,  к сожалению,  не  только  в  недостаточно   благоприятных  для  его  произрастания  юго-западной  и  равнинной  зонах,  но  даже  и  в  оптимальной  горной.

Исследования  по  сортоулучшающему  отбору  только  начаты,  ведутся  они  по  таким  показателям:  величина,  форма  и  окраска  плода,  вкус,  урожайность  и  особенно – склонность  к  ежегодному  плодоношению  и  скороплодность.

Процесс  этот  длительный.  За   отобранными  деревьями  в  саду  наблюдают  в  течение  3 – 4 лет. Если  признаки,  по  которым  они  отобраны,  сохраняются,  тогда  берут  черенки   для  размножения  в  питомники.  Затем  молодые  деревца  высаживают  в  сад,  где  дают  им  окончательную  оценку.

Нужно  отметить,  что  даже  в  оптимальных  условиях  произрастания  Антоновка  дает  вариации  и,  к  сожалению,  больше  отрицательных.  В  опытных  насаждениях  Помологического  сада  типичных  деревьев  Антоновки – 72  процента,  с  положительными  уклонениями  (крупные,  хорошо  окрашенные  плоды,  отличного  вкуса  и  высокая  урожайность) – 3  процента,  с  отрицательными  уклонениями  (мельчание  плодов,  понижение  вкуса  и  урожайности) – 25  процентов.

В Помологическом  саду  отобранные  маточные  деревья  Антоновки  с  типичными  плодами  и  высоким  урожаем.  Все  эти  вариации  размножены  и  высажены  в  сад.  Испытание их позволит отобрать наиболее типичные и положительные уклонения Антоновки.

Одна из причин вариаций деревьев Антоновки — беспорядочное размножение, которое в дальнейшем может привести к ещё большему ухудшению сорта.

Всегда следует помнить, что в неблагоприятные суровые зимы прежде всего гибнут деревья, нагруженные урожаем, а низкоурожайные сохраняются.

Работа, проводимая Помологическим садом по сортоулучшающему отбору и изучению лучших форм Антоновки, вселяет надежду на то, что удастся выделить положительные уклонения, обладающие полным комплексом самых лучших качеств, присущих этому сорту. При строгом соблюдении всех правил размножения в питомнике (создание матовых насаждений и тщательная их апробация) можно будет ещё на многие десятилетия продлить историю этого замечательного сорта.

 

1.4.Характер  Антоновки.

В  дальнейшем,  уже  в  саду,  молодые  деревья  Антоновки  отличаются  довольно  сильным  развитием,  давая  ежегодный  прирост  50-60  сантиметров,  но  в то  же  время  у  них  усиливается  тенденция  к  замиранию  почек  на  побегах.

Обычно  у  молодых  деревьев  наблюдается    последовательное   развитие  из  почек  на  двух – трехлетних  побегах  боковых  веточек  или  плодовых  образований  различного  типа,  а  у  Антоновки,  кроме  верхушечной  почки,  развиваются  редкие  боковые  побеги,  остальные  же  почки  образуются  мелкие  разетки  листьев,  или  зачастую  превращаются  в  спящие  почки,  не  образуя  даже  листьев.  Поэтому  ветви  Антоновки  сильно  оголены,  побеги  в  кроне  расположены  редко,  облиственность  деревьев  гораздо  слабее  чем  у  других  сортов.

У  Антоновки,  кроме  того,  ярко  выражена  вильчатость – раздвоение  побегов,  а  иногда  появляются  даже  «тройчатки».  Причина  такого  явления – неправильное  деление  клеток  в  точке  роста  и  образование  двух  точек  на  одном  побеге. Такие  раздвоенные  побеги  слабо  соединены  друг  с  другом,  поэтому  зачастую  одна  из  ветвей  под  тяжестью  урожая  отламлевается.  Это  особенность  развития  почек  у  побегов  Антоновки.

       У  молодых  деревьев  Антоновки  крона  неправильной  овальной  формы,  с  неровной  поверхностью  и,  кроме  того, с  отдельными  угловатыми  выступами.

В  период  же  возрастающего  и  полного  плодоношения  особенности  эти  еще  более  резки:  к  25-30 годам  крона  сильно  изреживается,  плодоношение  в  основном  переносится  на  перефелию,  прирост  ветвей  в  длину  и  рост  боковых  разветвлений  прекращаются,  начинают  отмирать  отдельные  ветки  и целые  скелетные  сучья,  а  затем  и  все  старые  скелетные  ветви  кроны.  Чтобы  этого  не произошло, у деревьев Антоновки в 15-20-летнем возрасте крону нужно снизить до 3-3,5 метра, тогда образуются новые молодые побеги и в результате этого мероприятия улучшается облиственность всего дерева.

Однако такая вторичная крона крайне несовершенна и недолговечна, быстро вновь изреживается  и отмирает, как правило, — уже к 50-летнему возрасту. Бывают, конечно, и более долговечные  деревья  Антоновки, но они редки и встречаются обычно в благоприятных природных условиях предгорных и горных зон.

Возобновление кроны из волчков, вырастающих на сгибах и у основания скелетных, в силу пониженной побегообразовательной способности Антоновки происходит слабо.

В  условиях интенсификации плодоводства большее  значение  приобретает  не  долголетие,  а  скороплодность.  Старые  же  деревья  плодоносятся  нерегулярно, дают  низкие  урожаи  и  становятся  нерентабельными,  именно  поэтому  в  нашей  стране  срок  амортизации  плодовых  деревьев  ограничен  тридцатью  годами.

Молодые  деревья  Антоновки  подвергались  и  довольно  сильной  формирующей  обрезке.  В  дальнейшем  ветки  у  них  не  оголялись,  а  почки  у  обрезных  веток  трогались  в  рост  и  давали  новые  разветвления,  превращающиеся  в  полускелетные  и  плодовые  веточки.  Но  затем,  когда  регулярную  детальную  обрезку  деревьев  прекращали,  у  Антоновки  появлялась  свойственно  ему  «голенастость»,  слабая  облиственность  всей  кроны  и,  как  правило,  присущий  тип  плодоношения.

 

1.5.Микроклональное размножение растений и его преимущества

Микроклональное  размножение – это  ускоренная  репродукция  сортов, клонов, видов  с  соблюдением  генетических  особенностей.  Это  одна  из  форм  вегетативного  размножения,  как, например, черенкование,  но  проводится  в  условиях  полной  асептики  на  специально разработанных  питательных  средах при контролируемом  температурном  и  световом  режиме. Исходным  материалом  служат  меристематические  верхушки или целые почки. При  правильно  подобранных  условиях,  через  несколько  недель  указанные  экспланты  продуцируют  несколько  побегов,  которые, в  свою  очередь,  при  пересадках  образуют  добавочные  побеги  на  новой  питательной  среде.  Таким  образом,  за  несколько  месяцев  культивирования,  получают  несколько  тысяч  побегов(4).

Использование  биотехнологических  методов  в  садоводстве  обеспечивает,  высокий  экономически  эффект.  Этот  эффект  связан  с  получением  за  коротки  сроки  посадочного  материала  высокого  качества,  обладающего    высокой  урожайностью  и  коэффициентом  размножения.  При  этом  сокращается  на  2-3  года  срок  внедрения  новых  форм  в  производство,  уменьшается  в 50-100 раз  площади  хранения  коллекционного  материала,  сокращается  на  2-5  лет  сроки  получения  новых  гибридных  форм  и  возникает  возможность  улучшения  существующих  сортов  по  отдельным  признакам.  На  сегодняшний  день  в  садоводстве  наиболее  широко  внедрено  клональное  микроразмножение.  Включенное  в  систему  производство  посадочного  материала,  она  обеспечивает  ряд  бесспорных  преимуществ по сравнению  с  традиционным  черенкованием  и  прививкой.  Однако  культура  тканей  и  органов  in vitro,  как и  любой  другой  прием  имеет  свои  преимущества  и  недостатки. К  преимуществам  относятся:  возможность  комплексного  оздоровления;  высокий  коэффициент  размножения;  гибкость  процесса;  возможность  получения  большого  количества  растений  за  короткое  время;  хранение  и  накопление  пробирочных  растений  для  высадки  в  оптимальные  сроки;  возможность  получения  большого  количества  растений  за  короткое  время;  возможность  ввести  тиражирование  форм,  обладающих  пониженной  способностью  к  репродукции  в  обычных  условиях;  получения  материала, с  увеличенными  потенциальными  способностями к  дальнейшему  размножению  за счет  повышения  способности  черенков  к  ризогенезу,  образование  большого  числа  побегов  у  древесных  растений.  С  другой  стороны,  для  биотехнологических  методов  требуется  тщательный  отбор  исходных  форм  по  всем  показателям,  так  как примесь  нельзя  удалить  до  высадки  растений  в  нестерильных  условиях.  К  недостаткам  метода  относится  и  то, что  после  операции  in vitro  при  переносе  материала  для  выращивания в нестерильных  условиях,  требуется  дополнительные  затраты  для  достижения  растениями  стандартных  показателей.  Тем  не  менее,  в  ряде  случаев,  единственным  способом  получения  оздоровленного  посадочного  материала  становится  культура  изолированных  апексов,  используемая  в  качестве  инструмента  оздоровления  самостоятельно  или  в  сочетании  с  термотерапией.

В  настоящее  время  микроклональное  размножение  используют:

—  в  селекции  для  подержания  и  размножения  небольшого числа  отдельных  генотипов  или  новых  перспективных  сортов, включая  и  все  продукты  генной  инженерии,  полученные in vitro;

—  для быстрого  размножения  (до  нескольких  тысяч  в  течении  месяца)  новых  выведенных  сортов,  экономия  затраты  и  время  их  внедрения  в  промышленное  производство;

—  для  быстрого  получения  больших  количеств  безвирусного  материала.  При  культивировании  in vitro в  течение нескольких  месяцев  можно  получить  то же  число  отводков,  который  в  поле  получают  за 4  года;

—   у  древесных  видов  растений,  для  укоренения  размножения  и  селекции,  которая  осуществляется  медленно  вследствие  длительности  процесса  полового  размножения.  Кроме  того,  многие  из  этих  видов  с  большим  трудом  поддаются  вигитативному  размножению.

На  фоне достаточно  больших  затрат  по  тестированию,  содержание  индикаторов,  амортизации  лабораторного  оборудования  и  тепличных  площадей  себе  стоимость  растений,  произведенных  биотехнологическими  методами,  относительно  не  высокая.  Повышение  же  эффективности  оздоровления  сделало  эти  методы  стандартными  для  производство  оздоровленного  посадочного  материала.

Обязательным  условием  клонального  микроразмножения  является  использование  объектов,  полностью сохраняющих  генетическую  стабильность  на  всех  этапах  процессов:  от экспланта  до растении  в  поле.  Этому  условию  удовлетворяет  апексы  и  пазушные  почки  органов  стеблевого  происхождения,  т.е.  меристемы.  Меристемные  ткани  растения  непрерывно  поддерживаются  в  эмбреанально — активно  состоянии.  Они  устойчивы к  генетическим  изменениям  вследствие  высокой  активности  систем  репарации  ДНК.

В  питомниководстве  также  используют  культуру  изолированных  тканей  и  органов  для  оздоровления  от  вирусов  и  патогенных  микроорганизмов  и  размножения  растении.  Освобождение  от  вирусов  и других  патогенов  этим  способом  возможно  лишь  у вегетативно  размножаемых  растений,  у  которых  сам  способ  размножения  способствует  распространению  болезней.  Бороться  с  вирусными  болезнями  привычными  химическими  методами  невозможно,  так  как  жизнедеятельности  вирусов  тесно  связано  с метаболизмом  клетки  растения – хозяина.  Основной  путь  борьбы  с  вирусными болезнями – получение здорового  посадочного материала, используя  метод  клонального  микроразмножения  in vitro.

Большим  преимуществом  данной  технологии  является  также  то  обстоятельство,  что  в  условиях  in vitro  часто  размножаются  и  укореняются  те  растения,  которые  совсем  не  размножаются  или  плохо  размножаются  обычными  способами,  например  яблоня.  Преимущества  микроклонального  размножения  растении  перед  традиционным  способом  размножения  настолько  очевидно,  особенно  с  точки  зрения  ее  высокой  рентабельности,  что  несомненно  стимулирует  ее дальнейшие  совершенствование  в  развитие.  Это  особенно  актуально  в  настоящее  время.

Выделяет  несколько  моделей  клонального  микроразмножения  растений  (5),  различающихся  по  коэффициенту  размножения,  надежность  в  отношении  генетической стабильности  растении,  использования  для  определенного  вида  растении.  Среди  этих  моделей  заслуживает  внимание:

• индукция органогенеза  или  соматического  эмбриогенеза  из  каллуса  тканей  растений;
• развитие адвентивных  побегов  из  тканей  эксплантов;
• индукция развития  пазушных  меристем.

В  биотехнологии наибольшее распространении получила  третья  модель  размножения – пролиферация  пазушных  побегов,  основанная  на  снятии  апикального доминирования.

Этот  метод  уже  стал  промышленным  при  производстве  посадочного  материала  и  является  наиболее  надежным  в  отношении  размножения  плодовых  культур.  Способ  основан  на  снятии  апикального  доминировании,  что  может  осуществляться  двумя  путями  (6):

1.Получение  побегов  нормальных пропорции с  последующим  их  делением  на «однопочковые  микрочеренки»,  которые  используются  в  качестве  вторичных  эксплантов  для  повторения  цикла  размножения. Часто  используется  при  размножение  яблони.  Теоретическая  возможность  такого  способа  составляет  приблизительно  100 тыс. -1млн.  побегов  в  год,  при  условии,  что  за  два  месяца  можно  получить  1 побег,  дающий  10 микрочеренков.

2.Снятие  апикального  доминирования  с  помощью  цитокининов  приводит  к  формированию  побегов  с  относительно  укороченными  междоузлиями,  а  пазушные  почки  и  меристематические  бугорки  дают  начало  новым  побегам.  Для  индукции  пазушных  почек  очень  правильно  подобрать  концентрацию  фитогормонов  в  среде.  Большое  количество  цитокининов  может  быстрее  способствовать  развитию  пазушных  побегов,  в  то  же  время  может  изменить  морфологию  растений  и  ведет  к  появлению  уродливых  форм.  В  результате  токсического  действия  высоких  концентрации  цитокининов  экспланты  даже  погибают.

При  правильно  подобранных  концентрациях  фитогормонов  в  среде  риск  получения  неоднородного  потомства  минимален,  частота  появления  мутации  не  больше,  чем  при  традиционных  способах  размножения.  Метод  относительно  универсален  и  имеет  хорошую  воспроизводимость  результатов  в  пределах  вида,  и  даже  рода  растений.

Вторая  модель  микроразмножения  основана  на  формировании  адвентивных  почек  из  меристематических  тканей  экспланта,  взятых  из  различных  частей  и  органов  растений.  Отдельные  клетки  этих  изолированных  из  растений  тканей  могут  дедифферинцироваться  из-за  нарушения  корреляционных  связей,  и  образовывать  меристематические  очаги,  в  которых  затем  закладываются  стеблевые  почки.  Эти  адвентивные  почки  в  культуре  возникают  из  эпидермиса,  мезофилла  чешуи  листа,  субэпидермиса.  Укоренение  адвентивных  побегов  ведет   к  образованию  целых  растений.  Развитие  адвентивных  побегов  может  осуществляться  также  за счет  боковых  и  интеркалярных  меристем.  Благодаря  меристематическому  происхождению  эти  растения  генетически  идентичны  родительским  формам.

Разработка  этой  модели  микроразмножения  особенно  актуальна  в  связи  с  развитием  метода  генетической  инженерии,  возможности  которой  в  настоящее  время  ограничены  из-за  отсутствия  эффективных  способов  регенерации из  соматических  тканей.  У  многих  видов  плодовых  культур  регенерация  растений  из  соматических  тканей  наблюдается  редко  и  зависит  от  генотипа,  типа  экспланта,  состава  питательной  среды  и  ряда  других  факторов.

Заслуживает  внимание  и  индукция  эмбриогенеза  в  культуре  каллусов  и  суспензии  клеток  (7). При  микроразмножении  с  использованием  развития  адвентивных  почек  из  тканей  экспланта  и  индукции  эмбриогенеза  в  каллусе  и  суспензии  клеток  вероятность  возникновение  генетических  отклонений  возрастает.  Каллус  может  быть  получен  почти  из  любого  вида  растения  и  представляет  собой  неорганизованную  массу  делящихся   клеток.  Иногда  образование  каллуса  на  экспланте  происходит  случайно,  представляя  собой  реакцию  заживления  раны,  но  обычно  для  этого  процесса  необходимое  добавление   в  среду  ауксина,  часто  в  сочетании  с  цитокинином.  Концентрации  гормонов,  более  благоприятны  для  образования  каллуса,  варьируют  в  зависимости  от  вида  растении  и  используемого  органа,  однако  в  основном  они  выше,  чем  необходимые  для  формирования  побегов  непосредственно  на  экспланте.  Например,  побеги,  сформированные  непосредственно  на  экспланте  листа  яблони,  культивируемого  на  среде,  содержащей  16 мг/л  БАП  и  0,5  мл/л  НУК,  а  побеги  на  каллусе,  сформировавшего  на  том  же  экспланте  образуются  при  содержании  в  среде  16 мл/л  БАП  и  4 мл/л  НУК (8).

У  большинства  растений  каллус  может  быть  отделен  от  экспланта,  пересажен  и  размножен  на  среде,  содержащей  гормоны  в  концентрациях  используемых  для  получения  исходного  каллуса.  При  снижении  концентрации  гормонов  или  при  определенном  соотношение  ауксина  и  цитокинина  из  некоторых  каллусов  будут  регенерировать  побеги  или  эмбриоиды.  Массовое  производство  каллуса  с  последующей  регенерацией  побегов  можно  было  бы  считать  идеальным  методом  крупномасштабного  размножения,  однако  в  настоящее  время  существуют  два  серьезных  недостатка,  ограничивающее  использование  этого  метода.

1. При последующей пересадках  каллусной  ткани  способность  многих  каллусов  регенерировать  побеги  снижается  или  даже  теряется.
2. Постепенно возрастает  число  полиплоидных  (ядро,  клетка,  организм,  характеризующиеся  умноженным  основным  числом  хромосом),  анеуплоидных  (ядро,  клетка,  организм  с  числом  отклоняющихся  от  Х  и  от  чисел,  кратных  Х)  и  другие  генетически  абберантных  клеток,  а  следовательно,  и  вероятность  образования  из  каллуса  растений,  отличающихся  от  исходного  родительской  формы.

На  морфогенетический  потенциал  каллусной  ткани  оказывает  влияние  возраст  и  физиологическое  состояние  растения – источника  экспланта,  его  происхождение,  возраст  каллусной  ткани  и  условия  его  культивирования.

Чем  моложе  растение – источник  экспланта,  тем  выше  регенерационная  способность  каллуса,  полученного  из  него.  Наибольший  морфогенетический  потенциал  наблюдается  у  каллусной  ткани,  сформировавшейся  из  экспланта,  выделенного  из  растений  ювенильного  возраста.

Чем  меньше  эксплант,  тем  слабее  проявляется  в  каллусе  способность  к  органогенезу.  Чем  крупнее  эксплант,  тем  выше  генетическая   стабильность,  но  зато  увеличивается  возможность  появления  в  его  клетках  вирусов.  Поэтому  на  практике   подбирают  какие то  средние   размеры  экспланты.

С  возрастом,  каллусные  ткани  постепенно  утрачивают  способность  к  морфогенезу.  Кроме  того,  при  длительном   культивировании  в  каллусных  клетках  накапливаются  генетические  изменения  (увеличивается  плоидность,  происходят  хромосомные  и  генные  мутации),  приводящие  к  регенерации  ненормальных  растений.  Поэтому  при  микроразмножении  растений  период  неорганизованного  роста  каллуса  должен  быть  как  можно  короче (9).  Таким  образом,  метод  микроразмножения  путем  индукции  органогенеза  в  недифференцированной  каллусной  ткани  является  эффективным  и  в  ряде  случаев  единственно  возможным  способом  регенерации  плодовых  растений.

С  помощью  культуры  каллусных  тканей,  возможно,  оценить  степень  совместимости  привоя  и  подвоя  плодовых  культур  при  прививках  (аффинитет)  на  ранних  этапах,  т.е.  до  высадки  растений  в  поле.

Несмотря  на  то,  что  методика  культивирования  изолированных  меристем  достаточно  разработана  применительно  к  большему  числу  видов  растений,  на  практике  воспроизводимость   результатов  весьма  низка,  а  размножение  многих  растений  in vitro  остается  в  лабораторной  стадии.  При  размножении  in vitro  индивидуальная  реакция    генотипов  проявляется  значительно  сильнее,  чем  при  традиционных  способов  размножения.  Поэтому  приходится  подбирать  условия  культивирования  не  только  в  зависимости  от  вида,  но  даже  сорта  и  подвоя.  Разработаны  для  одного  вида  растений  условия  культуры   in vitro  растений  другого  вида.

Процесс  клонального  микроразмножения  условно  можно  разделить  на  несколько  этапов.  Обычно  насчитывается  четыре:

1) выбор  растения – донора,  изолирование    и  стерилизация  экспланта,  создание  условий  для  его  роста  на  питательной  среде  in vitro;

2) собственно  размножение  путем:  а)  стимуляция  развития  всех  пазушных  почек  экспланта  в  результате  подавления  апикального  доминирования    как  первичного,  так  и  вновь  возникающих  побегов;  б) микрочеренкование  побега,  сохраняющего  апикальное  доминирование;  в) индукция  образования  адвентивных  почек  тканями  листа,  стебля;

3)  ускоренное  размножение  побегов  и  адаптация  пробирочных  растений  к  условиям  in vivo;

4)выращивание  извлеченных  из  культуральных  сосудов  и  адоптированных     in vivo  растений  в  условиях  теплицы  на  почве  или  на  искусственном  субстрате.  Подготовка  к  реализации  или  высадке  в  поле.

Клональное  микроразмножение – это  использование  техники  in vitro  для  быстрого  не  полового  получения  растений,  идентичных  исходному.  Преимуществом  клонального  микроразмножения  растений,  в  сравнении  с  традиционным  методом,  является  значительно  более  высокие  коэффициенты  размножения (1:1млн);  миниатюризация  процесса,  приводящая  к  экономии  площадей,  занятых  маточными  и  размножаемыми  растениями;  размножение  сеянцев  без  выхода  их  из  ювинильной  фазы.  Большинство  работ  выполняют  в  лабораторных  условиях  в  течение  года  и  получают  растения  к  определенному  сроку.  Длительное  хранение  пробирочных  растений  при  пониженной  температуре  позволяет  создать  «банк»  ценных  форм  растений  и  проведение  обмена  пробирочными  растениями,  в  том  числе  и  в  международном  масштаба  без  опасности  заноса  карантинных  объектов (10).  Хранящиеся  ценные  генотипы  и  оздоровленные  растения  при  необходимости,  возможно,  быстро  включить  либо  в  селекционный  процесс,  либо  в  существующие  схемы  производства  оздоровленного  посадочного  материала   без  риска  повторного  заражения,  что  в  свою  очередь  дает  возможность  экономить  материальные  и  трудовые  ресурсы  на  тестирование  и  оздоровление.  Для  генетиков  и  селекционеров  эти  методы  дают  возможность  при  индуцированном  мутагенезе  расширить  спектр  получаемых  мутации  за  счет  доведение  до  стадии  полностью  развитого  растения  идентичных,  мутированных  клеток  точки  роста.  Появляется  возможность  на  ранних  стадиях  получить  генетически  идентичные  копии  иного  фактора  внешней  среды  в  становление  организма.

Метод in vitro позволяют длительно хранить пробирочные  растения  при  пониженной  температуре,  что  дает  возможность  создать « банк »  ценных  форм  растений,  а  также  проводить  обмен  пробирочными  растениями  в  международном  масштабе  безопасности  заноса  карантинных  объектов.  Хранящиеся  ценные  генотипы  и  оздоровленные  растения  при  необходимости  можно  быстро  включить  либо  в  селекционный  процесс,  либо  в  производство  оздоровленного   посадочного  материала  без  риска  повторного  заражения. Это  в  свою  очередь  дает  возможность  экономить  материальный  и  трудовые  ресурсы  на  возможность  при  индуцированным  мутагенезе  расширить  спектр  получаемых  мутации  за  счет  доведения  до  стадии  полностью  развитого  растения  из  единичных,  мутированных  клеток.  Появляется  возможность  на  ранних  стадиях  ломаются  или  плохо  размножаются  обычными  способами. Модеполучить  генетически  идентичные  копии  сеянцев,  что  позволяет  в  дальнейшем  более  четко  выделить  роль  того  или  иного  фактора  внешней  среды  в  становлении  организма.

Большим  преимуществом  данной  технологии  является  также  то  обстоятельство,  что  в  условиях  in  vitro  часто  размножаются  и  укореняются  те  растения, которые  совсем  не  размножали  микроклонального  размножения  растений  через  инициацию  образования  каллуса  представлены  на  схеме. Любой  из  источников    растительного  материала  (листья,  стебли,  зародыши, корни)  может  быть  вовлечен  в  процесс  микроклонального  размножения  и  размножен через  образование  каллусной  массы  с  последующей  регенерацией  растений.

Живые  клетки  самых  различных специализированных тканей, помещённые на питательную среду в стерильных условиях, могут реализовать свою тотипотентность и дать начало целому растению. Способность отдельных клеток восстановить целый организм, обладающий всеми признаками исходного растения, успешно используется для микроклонального размножения.

Клон (от греческого clon -отпрыск, ветвь)- растение, полученное путём бесполого, т.е. Вегетативного размножения. Клоны идентичны материнскому растению и между собой. Микроклональное размножение- это массовое бесполое размножение в культуре тканей и клеток, при котором возникшие растения генетически идентичны исходному экземпляру.

Микроклональное размножение имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными  методами  вегетативного  размножения:

1) Высокий  коэффициент размножения. Из  одной почки  яблони  за  8 месяцев  культуры: можно  получить  до  60  тыс.   побегов. При  культивировании  меристемы  in  vitro удается  получить  до  50  тысяч растений  в  год. Культура  меристемы яблони, которая служит  подвоем для  прививок  и  с  большим  трудом  размножается  при  использовании  традиционных  методов, позволяет  получить  1 млн. растений

в  год. Таким  образом, коэффициент микроразмножений в  несколько тысяч раз больше, чем при использовании обычных методов вегетативного размножения.

2) Одновременно с микроразмножением происходит оздоровление растения от вирусов и патогенных  микроорганизмов.

3)  Ускорение  селекционного  процесса. Сроки  получения  товарной  продукции  новых сотов  сокращаются  до  2-3 лет  вместо  10 – 12.

Исследования  в  области  биотехнологии  и  практическая  реализация  их  результатов  в  производственной  сфере  является  одним  из  приоритетных  направлений  научно – технического  прогресса.

Биотехнология  используется  в  практической  деятельности  человека  с  давних  пор. Это  хлебопечение, виноделения, приготовление  кисломолочных  продуктов, квашение  овощей, силосование  и др.

Значительные  успехи,  достигнутые  во  второй  половине  XX  века  в  фундаментальных  исследованиях  в  области  биохимии  и  молекулярной  биологии,  создали  предпосылки  для  качественно  нового  понимания  микробиологических  процессов,  а  преобладающее  ранее   морфолого-систематическое  и  экологическое  направления  уступили  место  интенсивному  изучению физиолого-биохимических  параметров  жизнедеятельности  микробной  клетки.

Биотехнология,  в сущности,  не  что  иное,  как  использование  культур  клеток  бактерий,  дрожжей,  микроскопических  грибов,  животных  или  растений,  метаболизм  и  биосинтетические  возможности  которых  обеспечивают  выработку  специфических  веществ. Согласно  определению  Европейской  биотехнологической  фракции, биотехнология  на  основе  применения  знаний  и  методов  биохимии, микробиологии,  генетики и  химической  техники  позволяет  извлекать  выгоду  в  технологических  процессах  из  свойств микроорганизмов  и  клеточных  культур. Она  сознает  возможность  получения  с  помощью  легкодоступных  и  легкодоступных  и  возобновляемых  ресурсов  тех  веществ  и  соединений,  которые  важны  для  жизни  и  благосостояния  людей.

По  одному  из  последних  определений  биотехнология – это  промышленное  использование  биотехнологических  процессов  и  агентов  на  основе  получения  высокоактивных  форм  микроорганизмов,  культур  клеток  и  тканей  растений  и  животных  с заданными  свойствами.

В  промышленном  масштабе  подобная  биотехнология  представляет  собой  уже  биоиндустрию.  Последняя  включает  в себя,  с  одной  стороны,  отрасли,  в  которых  биотехнологических  методы могут  с  успехом  заменить  широко  используемые  традиционные  методы,  а  с  другой – отрасли,  в  которых  биотехнология  играет  ведущую  роль.  Среди  первых    в  области  химической  промышленности – это  синтез  исскуственных  полимеров  и  сырья  для  текстильной  промышленности,  в  энергетике – получение  метанола, этанола, биогаза  и  водорода,  в  биометалургии – извлечение  некоторых  металлов. Во  второе  группе  отраслей  биотехнология  охватывает  производство  продовольствия  (широкомоштабное  выращивание  дрожжей,  водорослей  и  бактерий  для  получения  белков, аминокислот,  витаминов, а также  использование  их  ферментов);  увеличение  продуктивности  сельского  хозяйства  (клонирование  и  селекция  сортов растений,  исходя  из  тканевых  и  клеточных  культур,  производство  биологических  препаратов  для  защиты  растений  от  вредителей,  болезней  и  сорняков);  фармацевтическую  промышленность  (разработка  вакцин,  синтез  гормонов,  интерферонов  и  антибиотиков);  защиту  окружающей  среды  и  уменьшение  ее  загрязнения  (очистка  сточных  вод,  переработка  хозяйственных  отходов,  изготовления  компоста,  деградация  вредных  соединений  с  помощью  микроорганизмов).

Возможность  управления  внутриклеточными  процессами  и  контролируемая  модификация  свойств  организмов  на  основе.  Геной  и  клеточной  инженерии  открывают  неисчерпаемые  перспективы  целенаправленного  и  более  рационального  использования  ценных  для  человека  свойств  этих  биообъектов.  В  настоящее  время  успехи,  достигнутые   в  этом  направлении,  связанные  с  простейшими  биологическими  системами,  в  частности  с  прокариотными  микроорганизмами,  что  же  касается  более  сложных  систем,  а  именно  эукариотных  организмов,  то  здесь  делаются  лишь  первые  шаги  и  идет  пополнение  фундаментальных  знаний.

Биотехнология  является  одним  из  приоритетных  направлений  научно – технического  прогресса,  позволяющая  на  основе  современных  достижений  в  области  биологических  и  технических  наук,  генетической  и  клеточной  инженерии  максимально  использовать  потенциальные  возможности  целенаправнно  созданных   живых  систем  (прежде  всего  микроорганизмов)  для  повышения  жизненного  уровня  людей,  на  основе  решения  производственно – технологических,  экологических  и  социально – экономических  проблем  как  на  ближайшую  перспективу,  так  и  в  стратегическом  плане.

    По  заключению  экспертов  ООН  в  XXI  веке  биотехнология  будет  определять  развития  человечества  во  всех  сферах  его  деятельности,  и  в  первую  очередь,  в  получении  продуктов  питания,  медицинских  препаратов,  в  сельском  хозяйстве,  экологии,  энергетики.

  Важнейшим  условием  успешной  реализации  государственной  научно – технической  политики  является  концентрация  научного  потенциала  на  приоритетных  направлениях  науки  и  техники,  реализация  которых  должна  внести  значительный  вклад  в  социально – экономическое  и  научно – техническое  развитие  страны,  обеспечить  отечественную  промышленность  передовыми  конкурентоспособными   технологиями.

           Процесс  отбора  приоритетов  сложен  и  требует  всестороннего  и  целенаправленного  подхода.  В  мировой  практике  существует  достаточно  формализованные  критерии  отбора  приоритетов.

     Целью  и  задачей  генетической  инженерии  является  модификация  и  конструирование  новых  геномов  с  заранее  заданными  свойствами  с  помощью  методов,  не  доступных  для  классической  генетики  и  селекции.   Генная  и  клеточная  инженерия – это  принципиально  новое  направление  биологической  науки,  которое  по  мнению  ученых  с  мировым  именем,  можно  поставить  в  одон  ряд  с  проблемами  расщепления  атома  и  преодоления  земного  притяжения.

1.6.Термотерапия  плодовых  культур

Получение  без  вирусного  посадочного  материала  плодовых  культур  сложный  и  трудоемкий  процесс,  связанные  со  значительными  затратами.  В  тех  случаях,  когда  проверка  на  индикаторах,  ELISA  или  PCR  показывает,  что  ценные  сорта  или   подвои  заражены  вирусами  на  100%, применяют  специальные  методы  их  оздоровления  от  вирусов.

Термическая  терапия  растений,  полностью  поражены  вирусами,  является  эффективным  и  распространенным  методом  получения  безвирусного  посадочного  материала  плодовых  культур  большинства  вегетативно  размножаемых  растений.  Оно  имеет  большое  практическое  значение,  способствуя  повышения  качественного  посадочного  материала  плодовых  культур.  Получение  после  термообработки  безвирусные  растения  во  многом  отличаются  по  своим  качествам  от  больных  растений.  После  термообработки  растения  растут  нормально,  дают  высокий  урожай  и  становятся  более  долговечными.

Известно,  что  плодовые  культуры  поражают  комплексом  вирусов,  для  индикации  которых  необходимо  относительно  высокие  температуры  +35 +38℃.  Поэтому  получить  полностью  свободные  от  вирусов  растения,  не  нанесения  прямого  ущерба  их  тканям  и  органам  довольно  трудно.

Уже в 20-е годы прошлого века было отмечено, что при высокой тем­пературе в естественных условиях происходит медленная репродукция виру­сов в растениях с маскировкой симптомов. Так, J. Jonson (11) отмечал, что при температуре 38°С   в условиях летних темпера­тур и заметил, что он исчезал из кроны зараженных растений и сохранялся только в корнях (12).

На основе оздоравливающего действия высокой температуры было предложило использовать высокие температуры в целях получения безвирусного посадочного материала (13) и доказательством в пользу использо­вания высоких температур для получения безвирусного посадочного мате­риала, являются многочисленные практические результаты, полученные в последние годы по термотерапии плодовых культур.

Существует много методик термической терапии растений, которые, в  целом, объединены в две группы — водной и воздушной обработок.

Сущность водной терапии заключается в погружении целых растений или отдельных частей в виде черенков (14) отводков в прогретую до 35-60°С воду с различной экспозицией — от нескольких минут до нескольких суток. Температура воды и длительность обработки зависят от термостойко­сти вирусов и микоплазм в пораженном растении.

После термообработки безвирусный материал получают в виде почек, черенков, корневых отпрысков или целых обработанных растений.

В 1936 году, в Америке,  L.O. Kunkll (15) начал исследования по тер­мотерапии плодовых культур с помощью горячей воды. Он впервые излечил персик от мелкоплодности и красного шва, погружая ветки или черенки больных деревьев в воду с температурой 50°С на 3 минуты, а от розеточности — на 8 минут. От желтухи персик был излечен путем выдерживания целых деревьев в течение 10 минут в воде той же температуры.

Е.М. Hildebrandt (16,17), обрабатывая деревья персика, пораженные х-болезнью, горячей водой (50°С) с краткими экспозициями (6-15 мин), инак-тивировал микоплазму, вызывающую это заболевание. Кроме этого, методом водной терапии, были инактивированы в черенках и целых растениях виру­сы: хлоротическое скручивание листьев персика (18), ржавая некротическая пятнистость черешни (19).

Однако, не смотря на то, что этот метод отличается непродолжитель­ной обработкой и технической простотой, он не перспективен, т.к. при этом способе не от всех вирусов освобождаются растения и часто обрабатываемый материал погибает раньше вируса.

В борьбе с вирусными болезнями наиболее эффективен второй способ — обработка растений горячим воздухом в специальных камерах (20,21). Этот метод борьбы в настоящее время самый эффективный и распространен­ный, применяется во всех плодоводческих районах мира, осуществляющих производство безвирусного посадочного материала. К настоящему времени создано большое количество разнообразных по типу термокамер: от простых боксов до современных фитотронов (22,23). Наиболее простым видом та­кой обработки является выдерживание некоторых частей растений или орга­нов больных растений в термокамерах регулируемой температурой от +35 до+80°С.

Методом воздушной обработки покоящихся черенков инактивируются такие вирусы плодовых как шарка, карликовость сливы, некротическая пят­нистость листьев вишни, мозаика яблони, каменистость плодов груши и кольцевая мозаики груши.

Безвирусный материал получают из верхушек, отрезков стебля, почек или листьев, образовавшихся во время термической обработки вследствие нормального роста растений при температуре + 32-40°С. Полученный безви­русный материал в дальнейшем прививается на безвирусные подвои, укоре­няется в почве в условиях тумана или вводится в культуру тканей (24).

Наиболее эффективный метод термотерапии связан с воздушной тер­мообработкой вегетирующих растений в специальных термокамерах. Он ус­пешно применяется для получения здорового посадочного материала в слу­чае полного заражения культивируемого сорта вирусными заболеваниями. Для термообработки подбираются крепкие, хорошо облиственные и окоре­нившиеся в горшках растения, прогревание которых следует начинать в пе­риод их активного роста (апрель). В камере соблюдаются следующие пара­метры: температура воздуха + 37 +0,5°C, температура почвы в области кор­ней +23-26°С, относительная влажность воздуха 80-90%, освещенность 5 тыс. люкс, при 16-часовjм фотопериоде. Период  обработки — 6 недель.

При термотерапии семечковых культур для лучшего развития корневой системы саженцы в течение года выращивают в специальных вазонах объе­мом 10 кг почвы. На следующий год, в начале интенсивного роста растений, т.е. в апреле, их помещают в термокамеры с начальной температурой 20-25°С на 5-7 дней для предварительной акклиматизации. В течение следующих 10 дней температуру в камере постепенно повышают до 38 С. В течение 4-5 не­дель саженцы находятся в камере при температуре +38°+0,5° С, относитель­ной влажности 50-60%, освещенности 3500-4000 люкс/м², продолжительно­сти освещения 16 часов в сутки. Для снятия отрицательного действия высо­кой температуры на корневую систему, между надземной и подземной ча­стью прокладывается пенопласт, и по дну камеры укладывают трубы с про­точной водой или делают искусственную вентиляцию воздуха (25).

Косточковые культуры, в частности черешню и ее подвои, подвергают термотерапии при температуре +38°+1°С. Освещенность на уровне верхушек должна быть не менее 6000 люкс/м², продолжительность освещения не менее  15 часов в сутки. Прогревание растений в термокамерах проводят 2-3 недели (26).

При термотерапии от вирусной инфекции освобождаются только вер­хушки однолетних побегов, отросших в период обработки. Эти верхушки срезают, для семечковых культур не более 1 см, для черешни 2-3 см, и при­вивают на здоровый подвой или на безвирусные сеянцы (27,28, 29, 30), укореняют в условиях тумана или выращивают на искусственных питатель­ных средах (31, 32,33,34,35,36,37).

Привитые растения содержат при температуре +27°С и 100% относи­тельной влажности. После прижимания прививок их проверяют на скрытое заражение вирусами на травянистых, древесных индикаторах и серологиче­ским тестом. Оздоровленному сорту присваивают категорию ССЭ и ими за­кладывают ССЭ маточники (38).

Латентные вирусы Антоновки  достаточно быстро и высоко поражают вер­хушки обрабатываемых растений, поэтому успех излечивания верхушек за­висит от длины побегов, отросших по время обработки. Первые работы, про­веденные по термотерапии этих вирусов в середине 60-х годов, показали, что их инактивация происходит за короткий период (3-4 недели), за исключением вируса, возбудителя ямчатости древесины, для которого продолжительность термообработки увеличивается до 9-10 недель (39,40,41,42,43,44).

В Австралии разработана программа получения и размножения поса­дочного материала плодовых культур, не содержащих вирусной инфекции. Установлено, что молодые деревья, выращенные при температуре +37°С, да­ют семена, свободные от вирусов (45).

Плодовые культуры различаются по чувствительности к повышенным температурам. Различия наблюдаются не только между культурами, но и в пределах одной культуры. При термическом обеззараживании растений от вирусов наблюдается увеличение уровня транспирации, снижение интенсив­ности фотосинтеза, уменьшение поглощающей способности корней (46), усиливаются ферментативные процессы, в частности процессы, ответствен­ные за окисление. Фенолы, которые находятся в значительном количестве в растениях, окисляются полифенолоксидазой в хиноны. Последние являются токсинами для клеток растений и вызывают их быстрое отмирание (47).

Часто гибель растений от тепла наступает вследствие истощения запас­ных питательных веществ от высокой скорости дыхания, наступает и недос­таток углекислоты, поскольку при высокой температуре она плохо раствори­ма в воде.

Исходя из этого, поиск путей повышения устойчивости обрабатывае­мого растения к повышенным температурам и стимулирования активного их роста в камерах (подбор субстрата, режимов орошения, удобрения, обработка стимуляторами роста и т.д.) является очень актуальным в изучении борьбы с вирусной инфекцией.

Так, для яблони нами был предложен способ термического обеззара­живания не саженцев, а побегов, с последующим вводом в культуру тканей отросших во время термотерапии, точек роста побегов (48).

   Когда вирусы находятся в растениях в скрытой (латентной) форме про­водят обеззараживание их методом суховоздушной термообработки в специальных автоматических камерах. При этом существенное значение для вы­живания растений имеет их закаливание или акклиматизация к повышенным температурам, например, медленное повышение температуры. Работами Помазкова Ю.И. (32) предложено начинать обработку растений весной при + 20°С. Эту температуру надо увеличивать на 4-5 С через каждые 4-5 дней, пока не наступит температура 37°С. По его мнению, такая акклиматизация способствует подготовке растений к обработке, как в анатомическом, так и в физиологическом отношении.

Продолжительность обработки и температура в значительной степени определяется размерами растений, уровнем питания и освещенности. При недостаточном питании и слабой освещенности растения менее устойчивы к повышенной температуре. Режимы с длительной экспозицией, но при более низкой температуре эффективнее, чем с короткой экспозицией и критической температуре. Одним из основных факторов, влияющим на выживаемость и выход растений, является относительная влажность воздуха. Рекомендуемая влажность воздуха в камерах 80-90%. В период термообработки большое внимание уделяют уходу за растениями, находящимися в условиях, экстре­мальных для них. В целях исключения зараженности различными паразита­ми еженедельно проводят опрыскивание пестицидами, поливают почву рас­твором марганцево-кислого калия, а через’ две недели поливают раствором Кнопа. Наилучшим почвенным субстратом является смесь почвы, торфа и песка в соотношении 1:1:1, Для улучшения выживания растений в период термотерапии и активирования ростовых процессов различные авторы ис­пользуют внесение макро- и микроудобрений и обработку ростовыми веще­ствами (50,51).

Существуют различные гипотезы для объяснения механизма освобож­дения растений от вирусов во время термообработки. Одна из них предпола­гает, что высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные частицы, лишая их инфекционности (52,53). Однако большая часть изученных — вирусов плодовых имеет температуру инактивации 50-70°С, т.е. более высо­кую, чем температура, применяемая при термотерапии растений (38-40°С). Поэтому прямым воздействием высоких температур нельзя объяснить инак­тивацию вирусов.

Согласно, второй гипотезы в зараженных вирусами растениях постоян­но происходят процессы синтеза и деградации вирусных частиц. Если преоб­ладает первый процесс — концентрация вируса растет, если второй — то ‘ уменьшается. При помещении растений в неблагоприятные для размножения вирусов температурные условия на длительное время, часто происходит раз­рушение всех вирусных частиц в клетках и, таким образом, освобождение растений от вирусной инфекции (54).

Однако чаще всего от вирусов освобождаются лишь отросшие части растения в период обработки. При неблагоприятных условиях, каким являет­ся повышенная температура, преобладающим является естественный распад, и в этом случае наблюдается общая убыль вируса в клетке, что замедляет распространение его от клетки к клетке. Быстро растущие меристемные тка­ни растения таким способом освобождаются от инфекции, т.е. наблюдается «бег от инфекции».

Третья гипотеза объясняет инактивацию вируса при термообработке ингибирующей активностью клеток растения, т.е. растения сами борются с вирусной инфекцией. Так, при работе с вирусами табачной мозаики на тома­тах наблюдается заметное повышение устойчивости и снижение концентра­ции вируса в зараженных растениях, растущих при температуре +35-36°С, и одновременное возрастание ингибирующей способности их размножатся (12).

Согласно второй гипотезе, отросшие в термокамере растительные тка­ни уходят от инфекции в результате деградации вирусов. Однако имеются факты, что освобождение яблони от комплекса латентных вирусов происхо­дит при очень незначительном приросте — 1,5-5 см (55). Это указывает на то, что инактивация вирусов в растениях под воздействием высоких темпера­тур — процесс сложный и многофакторный, где играют роль чувствитель­ность вируса к температуре, направленность процессов синтеза и распада ви­русных частиц, защитные реакции растения и иммунитет растений.

Например, описанные классические методы термотерапии не оправды­вают себя при работе с очень чувствительными к теплу плодовыми культу­рами (56). Для оздоровления таких растений во многих странах мира ис­пользуется микропрививка кончиками побегов. Таким способом освобожда­ются от вирусов цитрусовые растения, персик, черешня и груша  (57,58). От вирусов карликовости сливы, некротической кольцевой пятни­стости и хлоротической кольцевой пятнистости методом микропрививок ос­вобождаются растения персика и вишни (10), от вирусов шарки и некроти­ческой пятнистости коры освобождаются растения персика и абрикоса (20), от вирусов, имеющих стеблевую вирусную инфекцию — вирус бороздчатости древесины груши освобождаются растения яблони (45).

Метод микропрививки основан на том, что в системно зараженных рас­тениях концентрация вируса снижается по мере приближения к конусу на­растания. Изолированную верхушечную меристему длиной 0,1-0,2 мм с 1-2 примордиями помещают на декапитированный подвой, контактируя его с зо­ной камбия. Прививка меристемы обеспечивает 65%-ную приживаемость и полное освобождение от вирусов (59).

 

 

 

 

 

 

 

2.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

 

 Объектами  исследования  были  груши, выращиваемые  в  Помологическом  саду.  НИИ Плодово – ягодных  культур  в  лаборатории  биотехнологии.

Материалы и оборудование.  Боковые почки Антоновки,  инструменты  (скальпели,  пинцеты,  препаральные  иглы),  стерильные  фильтры  и  вата,  стерилизующие  реагенты,  ламинарный  бокс  с  кварцевыми  лампами.  Инструменты  перед  началом  работы  стерилизуют в  сушильном  шкафу  в  течение  1  часа  при  температуре  130-140 ℃.  Фильтры  и  вату  автоклавируют при  1  атмосфере  в  течение  1  часа.  Бокс  перед  работой  кварцуют  не  менее 1  часа.

Методика  и  проведение  работы.  Поставить  лабораторный  опыт  по  влиянию  различных  способов  стерилизации  растительных  тканей:  диоцид,  перекись  водорода,  активный  хлор  (в  концентрациях  указанных  в  таблице  1 и 2)  и  времени  экспозиции  (5-10  минут.  Отобранные  и  промытые  стерильной  водой  экспланты  ввести  в  культуру  на  «голодную»  стерильную  среду  («голодная»  среда  состоит  только  из  0,7-1% агара).

Боковые  почки  Антоновки  промыть  в  мыльной  воде  3  раза, затем  одним  из  заявленных  стерилизующих  агентов  в  различном  временном  режиме.  После  обработки  промыть  стерильной  водой  3  раза  по  15 минут  каждый  раз.  Приготовить  «голодную»  питательную  среду.  Для  этого  взвесить 7-10  грамм  агара,  замочить  его  в  небольшом  количестве  воды и  прокипятить,  после  чего  довести  общий  объем  до  1  литра  воды.  Разлить  по  пробиркам  и  автоклавировать  при  1  атмосфере  в  течение  0,5  часа.

После  стерилизации  у  почек  Антоновки  обновляется  базальный  срез,  меристематические  верхушки  доводят  до  1  мм,  остовляя  2-3  пары  примордиальных  листочков  и  экспланты  высаживаются  в  пробирки  по  одному  в  каждую.

Изоляцию  эксплантов  и  операцию  разделения  развившихся  почек  или  побегов,  а  также  обновление  срезов  у  эксплантов  в  процессе  пересадок  проводят  в  ламинарных  боксах  на  стерильных,  увлажненных  фильтрах,  помещенных  в  чашки  Петри.  Увлажнение  фильтра  предохраняет  экспланты  от  высыхания,  которые  в  условиях  пылезащитных  камер  при  постоянном  движение  воздуха  является  неизбежным  явлением.

Инструменты  в  процессе  работы  содержат  в  стакане  со  спиртом,  а  перед  операцией  вычленения,  обновления  среза,  разделения  конгломератов  почек  обжигают  в  пламени  спиртовки.

Через  10  дней  проводят  ревизию  эксплантов  и  записывают  в  журнале  количество  инфицированных  грибами  и  бактериями  эксплантов.  Рассчитывают  % контаминации  и  делают  вывод  о  приемлемости  того  или  иного  стерилизующего  агента  для  стерилизации  растительных  тканей  яблоня.  Стерильные  экспланты  пересаживают  на  новую  питательную  среду,  согласно  таблице  для  регенерации  и  развитие  эксплантов.

Для  культуры  изолированных  апексов  используют  большие  количество  питательных  сред,  отличающихся  по  минеральному  составу  которые  представлены  в  таблице  1.

Питательные  среды  спецефичны  для  каждого  видарастении,  для  культивирования  каждого  органа  и  ткани  или  клеток.  Обычно  они  носят  названия  рекомендовавшего  их  автора.  Наиболее  широко  используются  питательные  среды  представлены  в  таблице  1.

В  состав  каждой  среды  в  строго  определенном  количественном  соотношении  входят  минеральные  макро-  и  микросоли,  органические  вещества  (сахароза,  глюкоза),  стимуляторы  роста  (ауксины,  цитокинины),  некоторые  витамины  группы  В  и  другие  соединения.

В таблице 6 приведен состав широко используемых питательных сред для культивирования клеток и тканей растений  плодовых культур.

Таблица 1.  Питательные среды для клонального микроразмножения плодовых  культур

Компоненты	Концентрация в среде для культивирования, мг/л
	Андерсон (1978)	Мурасиге-Скуга (1962)	Гамборга В5 (1968)	Боксуса (1964)	Уайта (1963)	Нича (1969)	Шенка-Хельде-брандта (1972)
Ca(NO3)34H2O	—	—	—	500	300	—	—
KNO3	480	1900	2500	125	81	950	2500
Na2SO4	—	—	—	—	200	—	—
NH4NO3	400	1650	—	—	—	720	—
(NH4)2SO4	—	—	134	—	—	—	—
KH2PO	—	170	—	125	12	68	—
MgSO42H2O	370	370	250	125	74	185	400
CaCl22H2O	440	440	150	—	—	166	200
	1	2	3	4	5	6	7
	1	2	3	4	5	6	7
KCl	—	—	—	—	65	—	—
NH4H2PO4	—	—	—	—	—	—	300
NaH2PO4H2O	380	—	150	—	16,5	—	—
MnCl24H2O	—	—	—	—	7,0	—	—
MnSO44H2O	16,9	22,3	10	22,3	4,5	25	10
Продолжение таблицы 1
H3BO3	6,2	6,2	3	6,2	1,5	10	5,0
ZnSO47H2O	8,6	8,6	2	8,6	3,0	10	1,0
KJ	—	0,83	0,75	0,73	0,75	—	1,0
CuSO45H2O	0,025	0,025	0,025	0,025	—	—	0,2
Na2MoO42H2O	0,25	0,25	0,25	0,25	—	0,25	0,1
CoCl26H2O	0,025	0,025	0,025	—	—	0,025	0,1
AlCl3	—	—	0,03	—	—	—	—
FeSO47H2O	55,7	27,8	27,8	27,8	—	27,8	15
Na2 ЭДТА	74,5	37,3	37,3	37,3	—	37,3	20
Fe2(SO4)3	—	—	—	—	2,46	—	—
Тиамин HCl	0,4	0,5	10	0,1	0,1	0,5	5
Никотиновая кислота	—	0,5	1	0,5	0.5	5,0	5
Аскорбиновая кислота	—	1,0	—	—	—	—	—
Пиридоксин HCl	—	0,5	1	0,5	0,1	0,5	0,5
Глицин	—	—	—	2,0	3,0	2,0	—
Биотин	—	—	—	—	—	0,05	—
Мезоинозит	100	100	100	100	—	—	1000
Аденин SO4	80	—	—	—	—	—	—
Дрожжевой экстракт	—	—	—	—	100	100	—
Продолжение таблицы 1
Сахароза, г	30	30	30	20	20	20	30
Агар-агар, г	6	5-7	7	8	7	8	7
рН		5,9	5,5	5,6-5,8	5,5	5,6	5,9

 

2.1.Отбор  и  стерилизация  растительного  материала

   В  качестве  источника  эксплантов  при  культивировании  в  стерильных  условиях  используют  вегетативные и  генеративные  органы  растения.  В зависимости  от   поставленных  целей  это  может  быть  почка,  участок  стебля  или  корня  и  др. Обычно  при  микроклональном  размножений   используют  апикальные  и  латеральные   (боковые  почки), а  также  меристематические  верхушки  с  растений,  находящиеся  как  в  открытом  грунте, так и  теплице.  Экспланты  можно  использовать  в  течение  всего  года,  когда  растение  находятся  в  стадии  покоя   или  вегетирует.  Меристематическая  верхушка  состоит  из  собственно  меристемы  и  двух -0 трех  примордиальных  листочков  размером 200–500мм. Вычисление  меристематической  верхушки  производят  под  бинокулярной  лупой  или  микроскопом  при  30 -40-кратном  увеличении.  Размер  экспланта  контролируется  с  помощью  окуляр-микрометра.

Исходный  материал  (стеблевые  верхушки  длиной  1-2 см или  покоящиеся  почки)  в  общей  комнате  очищают  от  кроющих  чешуй  и  тщательно  с  помощью  щетки  и  мыла моют   под  проточной  водой  в  течений  1-2 часов,  после  чего  споласкивают  дистиллированной  водой  и  в  колбочке  заносят  в  бокс.

Затем  материал  стерилизуют,  согласно  его  физиологического  состояния,  по  предложенным  в  таблице  2 вариантом  в  результате  он  освобождается  от  сапроциной  микрофлоры.

      При использовании в качестве привоя растений, регенерировавших из эксплантов, прошедших термотерапию, длину изолированной верхушки можно увеличить до 2-3 мм, что позволяет повысить приживаемость до 80% (60). Привитые растения культивируют в стеклянных пробирках или кол­бочках с питательной средой при режиме: 14 часов день, 25°С и 10 часов ночь, 21°С до полной срастаемости, показателем чего является начало актив­ного роста привитой части (54).

Все эти микрометоды, возникшие из-за необходимости освободить цитрусовые, семечковые и косточковые породы от комплекса вирусов, уже определенно воздействуют на классические способы термотерапии плодовых культур. Главное их достоинство в удешевлении и ускорении процедуры ос­вобождения растений от вирусов. Поэтому, приступая к получению безви­русного растительного материала методом термотерапии, обязательно апро­бируют основные из применяемых методик и останавливаются на тех, кото­рые в данных условиях дают наилучший эффект.

В свете сказанного мы поставили перед собой задачу упростить способ термотерапии и добиться максимально возможного роста побегов не у са­женцев, а у побегов яблони. Для этой цели, срезали побеги в период покоя (февраль-март), длиной 50-100 см и помещали для пробуждения почек в тер­мостат на 4 недели при температуре 38º С, фотопериоде 16 часов в сутки и относительной влажности воздуха 50-60%. Для лучшей адаптации и роста растений при повышенной температуре испытывали варианты с замачивани­ем побегов в растворах гиббереллина и Кнопа.

Как показали исследования, выживаемость и интенсивность роста по­бегов при высокой температуре из пазушных и апикальных почек сильно от­личается в зависимости от сорта и обработки растений стимуляторами роста (табл.2).

Как видно из таблицы, представленные сорта оказались устойчивыми к действию высокой температуры с ростом побегов из апикальных почек у Голден Делишеса 4,0 -7,6 см при за­мачивании в обычной воде, у Антоновки 3,1-4,6. 

Таблица 2. Влияние обработки побегов на ростовую активность Антоновки при термотерапии

Сорт	Состояние почек после 4 недель термотерапии
	Контроль/вода			Гиббереллин, 50 мг/л		Раствор Кнопа
	Поги бшие, %		Рост, см пазушные/ апикальные	По­гиб­шие, %	Рост, см пазушные/апикальные	По­гиб шие, %	Рост, см пазушные/ апикальные
Голден Делишес	0		2,1±0,14/ 7,6±0,38	0	2,2±0,25/ 4,8±0,44	0	2,0±0,35/ 4,0±0,10
Антоновка		0	1.1 ±0,1/4,6 ±0,19	0	1,3 ±0,21/ 3,8±0,24	0	1,6 ±0,22 / 3,1 ±0,30

 

Обработка гиббереллином Антоновка Голден Делишес способ­ствовала не только лучшей интенсивности роста побегов, но и выживанию почек: если в контроле погибли все 100%, то при обработке гиббереллином соответственно 50 и 53% почек. У Антоновки  влияние предварительной обработки побегов на рост пазушных почек было несколько меньше, что говорит о меньшей его термолабильности. Наименьший прирост по этим сортам, отмечался при замачивании побегов в растворе Кнопа, который ввиду богатого содержания питательных веществ очень быстро зарастал микрофлорой.

Значительным количеством работ доказана эффективность приживае­мости изолированных верхушечных меристем в культуре тканей, обработан­ных теплом (54,34). Соотношение безвирусных растений, полу­ченных комбинированным методом и только методом верхушечных мери­стем, определяется как 6:1.

Перед введением апексов в культуру тканей обязательным условием является стерилизация апексов. Стерилизацию растительных тканей осуществляют одним из предложенных в таблице 3 методов.

Таблица  3. Стерилизация  исходного  растительного  материала

объекты	Время стерилизации,мин.
	Диоцид,0,1%	Сулема,0,1%	Гипохлориты Ca,Na,5-9%	Перикись водорода,10-12%
апексы	1-10	0,5-7	3-15	2-7
Семена набухшие	6-10	6-8	10-15	6-8
Ткани мясистого корня,клубня	20-30	15-25	15-20	—
Ткани стебля	20-40	20-25	20-25	—
листья	1-3	0,3-3	3-6	3-5

 

Эффективность  стерилизующего  агента  оценивается  по  степени  освобождения  от  инфекции  и  по  токсичности  для эксплантов.

Отросшие  части  побегов  при  термотерапии  и  после  стерилизации  вводят  в  культуру  тканей.  Эффективность  размножения  in vitro  на  начальном  этапе  культивирования  тесно  связано  с  получением  асептических  эксплантов.

Разработанная  Ист – Моллинской  опытной  станции  методика  размножения  Антоновки  in vitro  предусматривает  значительную  гибель  меристематических  верхушек  при  введении  в  культуру,  что  очевидно,  связано  с  использованием  эксплантов  большого  размера  и  недостаточной  обработкой  их  стерилизатором.  При  введении  в  культуру  мы  использовали  экспланты  размером  1 – 2 мм,  поскольку  они  довольно  хорошо  регенерируют  и  сравнительно  слабо  инфицированы.  Изучение  стерилизующих  препаратов  диоцида  и  перекиси  водорода  при  разных  концентрациях  показала  не одинаковое  влияние  их  на  контаминацию (табл.4).

 

Таблица 4. Влияние  стерилизующего  вещества  и  экспозиция  обработки  на  контаминацию  апексов  Антоновки

Варианты	Общее количество высаженных эксплантов, шт.	Инфицировано   %
Диоцид (0,1%), 15 мин.	409	40,7
Н 2О 2 (16%), 7 мин.	392	15,3
Н 2О 2 (33%), 4 мин.	710	15,1
С2Н2ОН,10сек.+Н2О2 (16%), 4 мин.	123	9,1

 

 Стерилизация  диоцидом  в  течение  15 мин. Обеспечила  освобождение  от  вирусной  инфекции  на  59%,  тогда  как  стерилизация  перекисью  водорода  на  85%.  Стерилизация  концентрированным  пергидролем  в  отличие  от  16%  эффекта  не  дала,  но  действовала  более  жестко  на  апикальные  верхушки  Антоновки,  вызывая  повреждения  отдельных  тканей,  а  затем  и  полный  некроз  самого  экспланта.  Наибольшее  стерилизующего  эффекта  (91%  стерильных  эксплантов)  можно  добиться,  сочетая  обработку  этанолом  в  течение  10  секунд,  а  затем  16% Н 2О2  в  течение  4  минут.

При  стерилизации  апексов  Антоновки  максимальный  выход  эксплантов  получен  при  обработке  растительного  материала  диоцидом  в  течение  10 минут  65%  и  гидроперитом  в  течение  4  минут – 64%.

Была  проведена  работа  по  изучению  влияния  электроактивированных  водных  растворов  (ЭАВ)  на  контаминацию  Антоновки  при  введение  в  культуру  тканей.  Результаты  исследовании  представлены  в  таблице  5 .

Таблица  5. Влияние  ЭАВ  на  приживаемость  апексов  Антоновки

Вариант	ЭАВ, режим  стерилизации	Всего  вычленено, шт.	Погибли, шт		Выход %
			Химический ожег	заросли
1	Аналит нейтральный рН6(безсоли) 3мин+каталит 5 мин.	24	20	0	17
2	Аналит нейтральный рН6 АНК,5 мин	24	24	0	0
3	Аналит нейтральный АНК, 5мин+кеталит 3 мин.	24	10	2	40
4	Аналит кислый рН3, 5 мин.	24	0	4	83
5	Аналит кислый рН3, 3мин.+аналит нейтральный (без соли),3 мин.	24	8	0	67
6	Диоцид,3мин. контроль	24	0	4	83

 

Анализ  таблицы  5 показывает,  что  наибольший  стерилизующий   эффект  получен  при  обработке  эксплантов  Антоновки   диоцидом  (3 мин.) и в 4 варианте  при  отборе  кислым  аналитом  рН3  в  течение  5  минут  (83%).  Хороший  эффект  по  снижению  контаминации  получен  при  отборе  вариантом  5,  однако  меристемные  ткани  получили  сильный  ожог,  в  результате  чего  выход  живых  эксплантов  был  не  высоким  (67%).  Сильный  ожог  получили  ткани  при  обработки  аналитом  нейтральным  (без  соли)  и  АНК.  Последующая  обработка  католитом,  как  стимулятора,  не  дала  положительного  эффекта.  Исходя  из  этого,  можно  рекомендовать  стерилизовать  экстракты  яблони,  наряду  с  диоцидом,  кислым  аналитом   рН3  в  течение  5 минут.  При  введении  в  культуру  тканей  инфекция  преимущественно  имеет  грибную  природу   и  относительно  легко  устраняется  с  помощью   различных  стерилизующих  агентов – диоцида  или  сулемы.  Были  продолжаны  исследование  в  направлении  поиска  экологически  безопасных  препаратов.  Изучалось  влияние йода  (J)  на  контаминацию  апексов  яблони.  Установлено,  что  наибольшего  стерелизующего эффекта  можно  добиться  при  обработке  эксплантов  0,-1 %  раствором   J  в  течение  15  мин,  когда  выход  стерильных  эксплантов  достигает  80%.  Увеличение  концентрации  J  привело  к  угнетению  апексов,  их  ожогу  и  гибели.

При  использовании  методов  культуры  тканей,  серьезную  проблему  создают  медленно  растущие  бактерии.  Они  не  оказывают  явного  действия  на  развивающиеся  побеги,  однако  жизнеспособность  растений  и  последующее  формирование  корней  часто  подавлены.  Большая  часть  этих  микроорганизмов – сапрофитные  организмы,  сохраняющиеся  после  исходной  стерилизации  исходного  материала.  Ущерб  от  нее  весьма  ощютим,  в  отдельных случаях  достигает  100%.

2.2.Приготовление  агаризованных  питательных  сред

   Среда  Мурасиге – Скуга – наиболее  универсальная  и  многоцелевая  среда,  пригодная  для  растительных  клеток  многих  видов.  Она  характеризует  наиболее  полным  содержанием  питательных  веществ,  высоким азота  и  калия,  что очень важно для приживаемости  и  роста  отчлененных  тканей    и органов,  поскольку экспланты  не имеют  проводящей системы и  обладают слабой поглощающей  способностью.  Эта среда  дает хорошие результаты   при  каллусообразовании  у  большинства  растений,  хорошо  ЭДТА,  необходимый  для  образования  хелата  железа,  необходимо  прокипятить  в  течение  5  мин.  поддерживает  неорганизованный  каллусный  рост  и  вызывает  индукцию  морфогенеза  у  большинства  двудольных  видов.

    Среда  Гамборга  (среда  В5)  дает  хорошие  результаты  при  культивировании  клеток  и  тканей.

   Среда  Уайта  применяется  для  укоренения  побегов  и  нормального  роста  стеблевой  части  после  регенерации.

   Среда  Нича  рекомендуется  для  индукции  андрогенеза  в  культуре  пыльников  и  для  индукции  морфогенеза  у  злаков.

   Для  приготовления  питательных  сред  используют  маточные  (концентрированные)  растворы  минеральных  солей,  отдельно  макро —  и  микроэлементов,  а  также  хлорида  кальция,  поскольку  ионы  кальция  образуют  с  фосфатами  малорастворимые  соединения  и  раствор  хелата  железа.

     Маточные  растворы  хранят  в  холодильнике,  а  раствор  хелат  железа – в  сосуде  из  темного  стекла.  Витамины  и  мезоинозит  хорошо  растворимы  в  воде,  но  быстро  разлагаются  и  поэтому  их  растворы  готовятся  не  более  чем  за  неделю  до  приготовлениния  питательной  среды  и  хранят  в  холодильнике  также    как  и  растворы  физиологически  активных  веществ.  Цитокинины  растворяют  в  0,1N  соляной  кислоты  при  подогреве,  а    ИМК  в  небольшом  количестве  спирта.  Раствор  FeSO 4+Na2ЭДТА,  необходимый  для  образования  хелата  железа,  необходимо  прокипятить  в  течение  5  мин.  После  соединения  всех  компонентов  питательной  среды  и  сахарозы  питательную  среду  доводят  до  нужного  объема  бидистиллированной  водой  и  измеряют  рН,  который  должен  быть  в  пределах  5,5-5,6.  Затем  нагревают  раствор  и  добавляют  предварительно  прокипяченный    агар (5 — 10  г /л  в  зависимости  от  типа).  После  растворения  агара  питательную  среду  разливают  в  пробирки  или  колбы  и  закрывают  фольгой  или  ватными  пробками  с  целлофановой  оберткой  и  помещают  в автоклав,  где  стерилизуют  15-20  минут  при  давлении  1  атм.

 

2.3.Влияние  состава  питательной  среды  на   регенерацию  и  развитие  эксплантов  Антоновки  in  vitro

   Экспланты  культивируют  первую  неделю  при  освещенности  800-1000  люкс,  а  затем  увеличивают  освещение  до  2-5 тыс.  люкс  и  16-ти  часовом  дне  при  температуре  23-28 ℃.  Для  подавления  бактериального  и  грибного  заражения  на первом этапе культивирования эксплантов в состав питательной среды  вводят  антибиотики  карбонициллин  (динатривая  соль) 1 мг/мл.

  Через 20-23 дней  культивирования  меристиматической  верхушке  начинают  развиваться  и  экспланты  увеличиваются  в  размере  до  1-2 см.  в  начале  разворачиваются  и  растут  листья,  а затем  начинается  рост  стебля  в  журнале  отмечают  дату  начала  развития  экспланта  переход  к  активному  росту.Большое влияние на регенерацию апексов Антоновки оказывает физиологическое состояние маточных деревьев. Так, при изучении высоты над уровнем моря произрастания маточных деревьев Антоновки  было установлено, что лучшей регенерацией отличались апексы взятые с маточных деревьев, произрастающих на уровне 1060 м/над Ур. моря (таб.6).

 

Таблица 6. Приживаемость и регенерационная  способность     апексов  клонов  Антоновки  in  vitro

Антоновка, м\ур. Моря	Вычленено  апексов, шт.	Регенерировало эксплантов, шт.	Приживаемость, %	Число пазушных  побегов, шт\1 черенок,1 пассаж
1240	30	25	86	3,0±0,14
1060	30	26	80	3,4 ±0,19
600	30	20	74	2,7 ±0,21

 

  Это  указывает  на то,  что оптимальные  условия   произрастания  маточных  растений,  где  с  наибольшей  степенью  реализуются  генотипические  признаки  сорта, положительно  влияют  на  регенерационную  способность  при  их  культивировании  в условиях  in  vitro. Как  видно  из  таблицы  6,  варьирование  приживаемости  было  в  пределах  от 5  до 15%, а в  пролиферации  достигало  30%  в  зависимости  от  клона  и  места  произрастания. Наибольшей  регенерационной активностью  отличался Антоновка,  произрастающий  в среднегорной  зоне,  менее в нижнегорной  и  слабой  на  высоте  600 м над  уровнем  моря.

   Питательная среда  является  субстратом,  на  котором  протекают  все  морфо – генетические  процессы, характерные  для  экспланта,  введенного  в культуру in  vitro. Успех  клонального  микроразмножения  растении  зависит  от  присутствия  в  питательной среде компонентов,  способных  вызвать  регенерацию растений из  ткани  экспланта. Неоднозначная реакция  клеток, тканей  и  органов  растений  в культуре  in vitro  на  введение  биологически – активных  соединений  в  питательную  среду  контролируется  на уровне  генома.

      Наиболее  высокий  процент  выхода  генетически  стабильных  регенерантов  можно  получить при  использовании  метода активации пазушных  меристем,  прямого  соматического  эмбриогенеза  и  образования побегов  непосредственно  из  ткани  экспланта,  минуя  стадию  каллусообразования  на  питательной  среде.  В  последнее   время  появились  исследования,  свидетельствующие  о  роли  осмотического  давления  для  индукции  эмбриогенного  каллуса  и  регенерации  растений,  т.е.  включение  в  питательную  среду  различных  осмотиков  типа  сахарозы  или ПЭГ (полиэтиленгликоль)   вызывают  осмотический  стресс, который  приводит  к  усилению  формирования  и  развития  эмбриоидов.

    С  целью  изучения  влияния  осмополярности  питательной  среды  на  выход  генетически  стабильных  регенератов  был  поставлен  полный  факторный  эксперимент  по  влиянию  осмотического  стресса,  вызванного  введением  в питательную  среду  осмотиков  на активность  каллусообразования  Антоновки  и  индукцию  осмотического  эмбриогенеза.  Изучали  влияние  осмотиков – сахарозы, ПЭГ (20000 м.м.) и  цитокинина  6 – БАП  каждый  из  которых  рассматривался  на  2 – х  уровнях. Критерием  оптимизации  питательной среды  на  сохранение  генетически  стабильного  материала  является  подавление  роста  каллусной  ткани  и  индукции  соматического  эмбриогенеза. План  эксперимента  приведен  в  таблице  7.

 

Таблица 7. Факторный эксперимент влияния осмотиков на индукцию эмбриогенеза.

Факторы	Варианты  сред								Уровень фактора
	1	2	3	4	5	6	7	8	+   мг\л    —
Сахароза	—	+	—	+	—	+	—	+	400	1500
ПЭГ (м.в.20000)	—	—	+	+	—	—	+	+	20000	1000
6 — БАП	+	—	+	—	—	+	—	+	10	0,1

 

 В   результате  проведенных  исследовании  установлено,  что  содержание  осмотиков  типа  сахарозы  и  ПЭГ  в  высоких  концентрациях  в  питательной  среде  приводит  к  образованию  эмбриогенного  каллуса  в сочетании  с  высоким  содержанием  6 – БАП (10 мг\л). Низкие  значения  6- БАП  (0,1 мг\л)  на  фоне  осмотического  стресса,  вызываемого  высокими  концентрациями  осмотиков,  хотя  и  ведут  к  незначительному  росту  каллусных  тканей,  но  не  провоцируют  соматический  эмбриогенез.

   Таким  образом,  для  получения  генетически  стабильных,  не  измененных  форм  регенерантов  при  клональном  размножении  Антоновки необходимо  избегать  в  составе  питательных  сред  сочетания  высоких  концентраций  осмотиков  и  цитокининов.

    После  получения  нормально  развитых  микрорастений  Антоновки  их  пересаживают  на среду  для  укоренения. Этап  ризогенеза  является  самым  сложным  и  определяющим  выход  качественной  продукции. Неоднозначная  реакция  органов  растений  в  культуре  in  vitro на  введение  биологически – активных  соединений  в  питательную  среду  контролируется  на  уровне  генома.

В  процессе  исследований  на  этапе  ризогенеза  испытывалась  среда  Мурасиге – Скуга,  модифицированная  нами  регуляторами  роста  и  витаминами. На  основании  результатов  опытов по  изучению  каллусогенеза  Антоновка  установлено,  что  чем  длиннее  период  культивирования  растении  на  среде  с  цитокининами,  чем  активнее  развитие  каллуса  и  слабее  образование  и  регенерация  корневых  зачатков  (табл.8).  Согласно  таблице  25,  при  культивировании  Антоновки  на среде  с  содержанием  6 – БАП – 2 мг\л  в течение  2 – 6 месяцев,  каллус при  пересадке  растении  на  корневую  среду  не  образуется  и  наблюдается  максимальное  развитие  корневых  зачатков.  При  увеличении  срока  культивирования  на  среде  с  6 – БАП  отмечается  угнетающее  развитие  каллуса  и снижение  образования  корней.

 

Таблица  8. Развитие  каллуса  и  образование  корневых  зачатков  на  этапе  ризогенеза  Антоновки  в  зависимости  от  периода  предкультивирования  с 6 – БАП.

Показатели (культивирование  на  среде с ИМК, 2 мг\л)	Предкультивирования  на  среде с 6- БАП (2 мг\л), месяцы
	2	4	6	10	12
	Формирование каллуса и корневых зачатков, %
Каллус	0	0	9	51	80
Корневые зачатки	29	46	40	21	14

 

  Нами  установлено,  что  для  получения  саженцев  Антоновки  in  vitro  в  технологическую  схему  клонального  микроразмножения  должны  быть  включены  регламенты  применения  6 – БАП.  На  этапе  регенерации  содержание  6 – БАП  в  концентрации  3,6 мг\л,  увеличивает  коэффициент  регенерации  на  21%. На  этапе  пролиферации  содержание  6 – БАП  в  концентрации  1.8 мг\л  (не  более 4  месяцев  размножения),  увеличивает  при  ризогенеза  закладку  корней  до  46%  (концентрация  ИМК  при  ризогенеза  2 мг\л).

  С  целью  изучения  активности  экспрессии  генов,  ответственных  за  резогенезе  были  изучены  токоферол  и  аскорбиновая  кислота.  Активное  действие  токоферола  лежит  в   области  стимуляции  восстановительных  способностей  растительных  клеток  на  уровне  репарации  молекул  ДНК.  Аскорбиновая  кислота – активатор  ферментов  тканевого  обмена  и  дыхания.  Введение  этих  препаратов  в  питательные  среды  способствовало  активизации  роста  корневых  зачатков  Антоновки.

     Полученные  через  культуру  тканей  безвирусные  саженцы  Антоновки  высажены,  как  маточные  деревья,  в  суперэлитный  маточно-черенковый  сад  для  дальнейшего  размножения.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫРАЩИВАНИЯ 1 тыс. шт. САЖЕНЦЕВ АНТОНОВКИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ (in vitro)

 

Затраты на выращивание саженцев Антоновки методом культуры тканей складываются из расчета затрат на амортизацию теплицы площадью 10000 м² (вода, электроэнергии), которая по стандартной технологии составляет 130 тыс. тг. в год (61,62). Нам для выращивания 1 тыс. шт. саженцев Антоновки in vitro требуется площадь 250 м², затраты на амортизацию составляют 31 тыс. тг. в год.

Заработная плата сотрудника, занимающегося выращиванием in vitro (30% от годовой зарплаты) – 53 тыс. тг. Себестоимость саженцев составляет 60% от рыночной стоимости.

Рыночная реализационная цена 1 саженца Антоновки, размноженного in vitro равна 200 тг. (включает стоимость всех реактивов, работу в боксе, автоклавирование), размноженных по традиционной технологии (контроль), древесными черенками –200 тг. (таблица 9).

Таблица 9. Экономическая оценка новой и традиционной технологии производства корнесобственных саженцев Антоновки

№ п/п	Показатели	Новая технология	Традиционная технология
1.	Производство одного саженца, год	2	4
2.	Затраты на выращивание 1 саженца, тенге	50	60
3.	Реализационная цена 1 саженца, тенге	200	200
4.	Сумма реализации (35 тыс.шт.), тыс.тенге	8.000,0	5.000,0
5.	Полная себестоимость тыс. тг.	2.000,0
Продолжение таблицы 9
6.	Прибыль от реализации 1 тыс.шт./тыс.тенге	5.600,0
7.	Экономическая эффективность тыс. тенге на 1 тыс. шт.	160	130
8.	Рентабельность %	5.600,0	—

 

Экономический эффект выращивания 1 тыс. саженцев Антоновки составляет 200 тыс. тенге, за счет высокого коэффициента размножения и в 2 раза сокращения срока выращивания. Новая технология эффективно традиционной технологии

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.Охрана труда и окружающей среды

4.1. ОРГАНИЗАЦИЯ ОХРАНЫ ТРУДА В ЛАБОРАТОРИИ

 

Основные исследования по данной работе проводились в лаборатории биотехнологии и генофонда и теплице элитных культур.

Для воспитания у рабочих и сотрудников сознательного отношения к выполнению правил и инструктажей по технике безопасности и производственной санитарии, а также для усвоения ими безопасных приемов труда, администрация обязана проводить инструктирование и обучение работающих.

Инструктаж проводится лицом ответственным за технику безопасности – заведующим лабораторией или его заместителем и включает:

а) вводный инструктаж при поступлении на работу;

б) инструктаж на рабочем месте;

в) повседневный и текущий инструктаж;

г) периодический (повторный) инструктаж;

д) курсовое обучение.

 

1. I. Меры безопасности при работе с оборудованием лаборатории вирусологии
2. К работе с оборудованием и электронагревательными приборами допускаются сотрудники лаборатории, прошедшие инструктаж по технике безопасности и ознакомившиеся с устройством и правилами безопасной работы на данном оборудовании.
3. Перед началом работы с оборудованием наружным осмотром убедиться в его исправности.
4. Все электрические приборы и оборудование должны быть надежно заземлены через заземляющий контакт штепсельного разъема.
5. Запрещается:

а) производить замену предохранителей и ремонтные работы не обесточив щит;

б) заменить предохранители на более высокую силу тока;

в) заменить предохранители самодельными вставками;

г) хранить в помещении ЛВЖ.

5. При мытье посуды особое внимание обращать на целостность краев. Запрещается пользоваться треснутой посудой.

 

1. II. Порядок работы в меристемной комнате:
2. На рабочем столе в меристемной комнате должно постоянно находиться необходимое оборудование.
3. Перед работой протирать пол 3%-ным раствором хлорамина.
4. Включить бактерицидные лампы 2 часа. Проветрить 20-30 мин. Перед тем, как зайти в меристемную, тщательно с помощью щетки промыть руки, особенно под ногтями.
5. При входе в меристемную комнату переодеться в халат, одеть косынку и марлевую повязку.
6. Протереть руки спиртом, стол. Включить ламинар-бокс и приступить к работе.
7. Во время работы не разговаривать, не вставать, не делать резких движений.

 

III. Инструкция по охране труда для работающих в теплице

1. Технологический процесс.

Теплица предназначена для доращивания посадочного материала плодово-ягодных культур, полученных через культуру ткани. В помещении теплицы готовится смесь из песка, торфа, перегноя и почвы с заполнением в горшочки, установленные на столах.

Условия выращивания при температуре +20º+25ºС, освещение в течение 14 часов, полив шлангами.

2. Требования безопасности.
3. Обязательное выполнение Положения об организации работы по охране труда (утверждено Госагропромом СССР 4 июня 1986г) и приказа по НПО «Алмалы» № П-5 от 13 января 1992 года “О мерах по улучшению работы по технике безопасности в институте”.
4. Все технологическое оборудование, инструменты должны отвечать требованиям техники безопасности и производственной санитарии. Размещать их нужно в соответствии с характером и особенностями технологического процесса с тем, чтобы обеспечить безопасность обслуживающих его сотрудников.
5. Обеспечить требования к воздушной среде регламентируемые санитарными нормами температуры, влажности и чистоты воздуха на рабочих местах.
6. Правильно эксплуатировать осветительные установки и остекления светопроемов естественного света. В случае возникновения аварийной обстановки выключить рубильник.
7. Подъем и перемещение тяжестей (грузов) должны осуществляться с неукоснительным соблюдением правил и норм безопасности, не допускать применения неправильных методов труда и непроверенных технических средств и приспособлений.
8. Технологическое оборудование в лаборатории – теплице при нормальных режимах работы должно быть пожаробезопасным, а на случай опасных неисправностей и аварий необходимо предусматривать меры, ограничивающие масштаб и последствия пожара.
9. Пол в теплице должен быть сухим и чистым. Не оставлять на рабочем месте тряпки, бумагу, спецодежду и инструменты.
10. При смешивании почвы в обязательном порядке пользоваться средствами индивидуальной защиты с учетом физико-химических свойств и концентрации вредно действующего вещества в воздухе, а также особенности трудового процесса.
11. Помещение должно быть обеспечено первичными средствами пожаротушения в соответствии с действующими нормами и с учетом специфических особенностей тушения.
12. Каждый работающий в лаборатории обязан четко знать и строго выполнять установленные правила техники безопасности, не допускать действий, могущих привести к пожару или загоранию.

 

1. IV. Правила пожарной безопасности в лабораториях

Общие положения.

1. К работе в химических лабораториях допускаются лица не моложе 18 лет. Прошедшие противопожарный инструктаж и обучение безопасным методам работы, сдавшие экзамен на допуск к самостоятельной работе.
2. Персонал лаборатории обязан знать:

— свойства имеющихся в лаборатории химических реактивов, технических продуктов, продуктов реакции и синтезируемых веществ и материалов, поступающих для анализов, их огне и взрывоопасность, опасные моменты при проведении работ и способы их предупреждения, порядок хранения химических веществ, который должен отвечать “Правилам совместного хранения огне и взрывоопасных веществ”.

3. Все электронагревательные приборы должны иметь свое постоянное место с достаточной теплоизоляцией снизу и у стен (керамические плиты, асбест).
4. Нагревание и отгонку эфира, спирта, бензина, ацетона и др. легко воспламеняемых и летучих веществ разрешается проводить на водяной или воздушной бане с электрообогревом или на плитке с закрытым нагревательным элементом. Объем отгоняемой жидкости должен быть не более 1 л.

Запрещается:

— работать с неисправным электрооборудованием;

— вскрывать электрощиты, магнитные пускатели и делать исправления в них;

— вскрывать электрощиты вблизи ЛВЖ, летучих веществ (эфир, бензол, бромэтил и др.);

— применять проводники с поврежденной изоляцией и без штепселей;

— оставлять без присмотра работающие включенные электропотребители;

— работать с нагревательными приборами без подложенных термоизоляционных прокладок (асбест, керамика и др.);

— работать с незаземленным электрооборудованием;

— применять самодельные предохранители “жучки”.

5. Проведение работ с ЛВЖ недопустимо в помещениях, где имеется открытый огонь;

— нагревание и разгонка  ЛВЖ производится в круглодонных колбах на закрытых электроплитках или водяной, масляной, песчаной банях.

С масляной баней нельзя допускать перегрева масла, что может привести к его воспламенению.

При перегонке нельзя допускать полного испарения жидкости из колбы, стекло может треснуть.

6. При выпаривании растворов, содержащих соли, окислители (нитросоединения, соли хлорной, хлорноватой кислот, перекисные соединения) необходимо постоянное присутствие работающего, так как малейшее отклонение режима может привести к взрыву.
7. При высушивании огне и взрывоопасных веществ следует заблаговременно отрегулировать требуемую температуру шкафа.
8. ЛВЖ и ГЖ в лабораториях должны храниться в толстостенных стеклянных банках, склянках с притертыми пробками в специальном металлическом шкафчике с выложенными асбестом стенками. Шкаф должен быть в стороне от проходов и вдали от источников сильного обогрева.
9. Запасы ЛВЖ и ГЖ в лабораториях должны быть в пределах дневной потребности.
10. Категорически запрещается выливать ЛВЖ и ГЖ в канализацию, жидкости сливать в специальную герметически закрывающуюся тару.
11. Работы с взрывоопасными веществами выполнять стоя. Запрещается работающие приборы с взрывоопасными веществами оставлять без присмотра.
12. Если в помещении пролита ЛВВ необходимо:

— немедленно погасить все горелки и выключить электронагреватели, закрыть двери, открыть окна и форточки, в резиновых перчатках тряпкой собрать пролитую жидкость. После полного исчезновения запаха пролитой жидкости проветривание можно прекратить.

13. После окончания работы проверить, потушены ли горелки и выключены электронагреватели, газовые и водяные краны.

В лаборатории запрещается:

— загромождать и захламлять коридоры и проходы, подходы к средствам огнетушения, электрощитам, кранам;

— мыть и протирать столы керосином, бензином и другими органическими растворителями;

— сушить на отопительных приборах различные предметы;

— хранить вещества неизвестного происхождения без этикеток.

14. В случае пожара в лаборатории:

— немедленно сообщить на вахту или 01 и приступить к ликвидации пожара всеми имеющимися подручными средствами – огнетушителем, ковриком, песком;

— удалить из лаборатории все огне и взрывоопасные вещества, баллоны с газом;

— перекрыть газ, обесточить электросеть, выключить вентиляцию;

— для тушения веществ, несмешивающихся с водой (бензин, керосин) нельзя применять воду, тушить сухим песком, накрыть.

 

Средства тушения химических веществ

Азотная кислота – воспламеняется при соприкосновении с органическими и ГЖ. Тушить водой, известью.

Азотнокислый калий и натрий – взрывается при взаимодействии с органическими веществами и сероводородом тушить водой.

Алюминий в порошке – взрывается от удара в среде сероводорода тушить песком, накрыть асбестом.

Азотнокислый аммоний – взрывается в контакте с органическими веществами при нагревании, ударе. Тушить водой.

Ацетилен – взрывается в контакте с хлором в концентрации 2,5 – 30% под действием солнечного света. Тушить водным паром.

Ацетон – взрывается в концентрации 2,5 – 13% при взаимодействии с перекисью водорода и от искры. Тушить пеной огнетушителя.

Аммиак – взрывается при контакте с хлором в концентрации 15,5 – 27%.  Тушить водяным паром.

Бензин, бензол – воспламеняется при взаимодействии с кислородом, хлорной кислотой. Тушить пеной огнетушителя.

Бром – взрывается при взаимодействии с этилфосфатом, карбидом натрия.

Водород – взрывается при контакте с хлором, под действием солнечного света в концентрации 4 – 75%. Тушить водяным паром, СО₂.

Сера – воспламеняется при взаимодействии с перекисью свинца, солями хлорноватой кислоты. Тушить водой, песком.

Перекись водорода – взрывается при взаимодействии с органическими веществами, металлической пылью. Тушить водой.

Металлические калий и натрий – воспламеняются при взаимодействии с водой. Тушить сухим песком.

Метан – взрывается при контакте с кислородом, хлором в концентрации 5 – 14,9%. Тушить водяным паром, СО₂.

Керосин – воспламеняется при взаимодействии с перманганатами. Тушить пеной, песком.

Спирт метиловый – воспламеняется в воздухе от искры. Тушить пеной.

Формальдегид – взрывается при взаимодействии с перекисью натрия. Тушить песком.

Этиловый эфир – взрывается при контакте с кислородом, хлором, хлорной кислотой. Тушить пеной.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.2.  ОХРАНА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

      В  нарастающем  процессе  производственной  деятельности  человеческого  общества  происходит  естественный  процесс  изъятия  из  природы  необходимых  веществ:  сырья  для  промышленности;  воды;  продуктов  питания;  леса  и  других  природных  ресурсов.  Одновременно  нарастает  выброс  в  природу  отходов  промышленности,  бытовых  отходов,  отработанных  предметов  и т.д.  Кроме  того,  человек  перестраивает  природу  для  своих  нужд,  в  первую  очередь  для  сельскохозяйственного  производства,  существенно ее  изменяя(63,64).  Охрана  природы  есть  плановая  система  государственных,  международных  и  общественных  мероприятий,  направленных  на  рациональное  использование,  охрану  и  восстановления  природных  ресурсов,  на  защиту  окружающей  среды  от  загрязнения  и  разрушения  для  создания  оптимальных  условий  существования  человеческого  общества,  удовлетворения  материальных  и  культурных   потребностей  ныне  живущего  и  грядущего  его  поколения.  Таким  образом  термин  «охрана  природы»  шире,  чем  понятие  «охрана  окружающей  среды».  Следует  иметь  в  виду  среду,  окружающую  человеческое  общество,  а  не  отдельного  человека  и  только  природные  объекты  среды,  а  не  социальные  вещи  и  людей.  Нередко  для  того  чтобы  подчеркнуть  природно – охранительный  аспект  проблемы,  употребляют  термин  «окружающая  природная  среда».  В  эпоху  научно – технического  прогресса  воздействия  на  биосферу  нашей  планеты,  ее  структуру  и  энергетику  стало  поистине  всеобъемлющей.  Из  недр  земли  ежегодно  извлекаются  миллиарды  тонн  угля,  нефти  и  других  ископаемых,  рассеивается  масса  химических  элементов,  нарушая  естественное  соотношение  их  в  биосфере.

     Огромное  распространение  в  мире  имеют  ветровая  и  водная  эрозия,  засоление  почв,  снижение  продуктивности  сельскохозяйственных  угодий,  в  некоторых  природно – географических  зонах  сокращения  площади  лесов,  ухудшения  водного  баланса,  падения  численности  или  исчезновения  некоторых  видов  растений  и  животных.  В  связи  с  быстрым  ростом  народонаселения  тревогу  вызывает  истощения  ряда  природных  рисурсов,  необходимых  для  развития  производительных  сил.  Загрязнение  земной  и  водной  поверхности,  воздушного  бассейна  планеты  грозит  глобальной  катастрофой  для  человечества.  Все  экологические  преступления  должны  строго  наказываться.  Все  страны  должны  предпринять  усилия  для  предотвращения  экологической  катастрофы.  В  сельском  хозяйстве  необходимо  отказаться  от  широкомасштабного  применения  химических  средств  защиты  растений  от  вредителей,  болезней  и  сорняков.  Шире  внедрять  для  защиты  растений  интегрированный  метод защиты,  делая  упор  на  современные  методы  биотехнологии,  внедрять  в  производство  безвирусный  посадочный  материал.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

 

 

                                    ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате  исследований, проведенных в рамках дипломной работы установлено, что  обработка гиббереллином , включая Антоновки  способ­ствовала не только лучшей интенсивности роста побегов, но и выживанию почек: у сорта Голден Делишес в контроле погибли все 100%, при обработке гиббереллином соответственно 50 и 53% почек. У Антоновки влияние предварительной обработки побегов на рост пазушных почек было несколько меньше, что говорит о меньшей его термолабильности. Наименьший прирост по этим сортам, отмечался при замачивании побегов в растворе Кнопа, который ввиду богатого содержания питательных веществ очень быстро зарастал микрофлорой.

Стерилизация  диоцидом  в  течение  15 мин. обеспечила  освобождение  от  вирусной  инфекции  на  59%,  тогда  как  стерилизация  перекисью  водорода  на  85%.  Стерилизация  концентрированным  пергидролем  в  отличие  от  16%  эффекта  не  дала,  но  действовала  более  жестко  на  апикальные  верхушки  яблони,  вызывая  повреждения  отдельных  тканей,  а  затем  и  полный  некроз  самого  экспланта.  Наибольшее  стерилизующего  эффекта  (91%  стерильных  эксплантов)  можно  добиться,  сочетая  обработку  этанолом  в  течение  10  секунд,  а  затем  16% Н 2О2  в  течение  4  минут.

Универсальной питательной средой  для культивирования апексов Антоновки  оказалась среда  Мурасиге – Скуга  которая является  наиболее  универсальной  и  многоцелевой  средой,  пригодной  для  растительных  клеток  многих  видов.  Она  характеризует  наиболее  полным  содержанием  питательных  веществ,  высоким азота  и  калия,  что очень важно для приживаемости  и  роста  отчлененных  тканей   и органов,  поскольку экспланты  не имеют  проводящей системы и  обладают слабой поглощающей  способностью.  Эта среда  дает хорошие результаты  и при  культивировании Антоновки.

             Это  указывает  на то,  что оптимальные  условия   произрастания  маточных  растений,  где  с  наибольшей  степенью  реализуются  генотипические  признаки  сорта, положительно  влияют  на  регенерационную  способность  при  их  культивировании  в условиях  in  vitro. Как  видно  из  таблицы  6,  варьирование  приживаемости  было  в  пределах  от 5  до 15%, а в  пролиферации  достигало  30%  в  зависимости  от  клона  и  места  произрастания. Наибольшей  регенерационной активностью  отличался Антоновка,  произрастающий  в среднегорной  зоне,  менее в нижнегорной  и  слабой  на  высоте  600 м над  уровнем  моря.

     Экономический эффект выращивания 1 тыс. саженцев Антоновки  составляет 200 тыс. тенге, за счет высокого коэффициента размножения и в 2 раза сокращения срока выращивания.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.Послание президента РК Н.А.Назарбаев народу Казахстана «Через кризис к обновлению развитию». Астана 2009 г.

2.Богушев Л., Чернец А. Вирусные и микроплазменные заболевания плодовых, ягодных культур и винограда в Молдавии.- Кишенев: 1983- С.73-79

3.Бунцевич Л.Л.  Реализация генеративного  потенциала  яблони домашней.// Весник  сельскохозяйственной  науки  России: 2006, №4 –С.62-65

4.Баев И.А., Варломова З.Н., Васильева О.Е. «Экономика предприятия».-Питер: 2005.-С.16

5.Григорьева  Л.В.  Факторы  повышения  продуктивности  яблоневых  насаждений.// Садоводство  и  виноградарство: 2003, №4 – С.3-5

6.Долгих С.Г. «Биотехнология диагностики вирусных болезней, оздоровление и размножения плодовых культур в Казахстане».- Алматы: 2007-225.-с.

7.Долгих С. Г. «Учебно–методическое пособие к практическим занятиям по биотехнологии растении».-  Алматы: 2007- С.88

8.Долгих С.Г., Избасаров Д.С. Способ  выращивание саженцев семячковых культур in vitro // Патент № 46336 от 11.06.2004

9.Долгих С.Г.  Особенности культивирования яблони in vitro.//Сб. трудов Каз.НИИПиВ: 2001, т.16-С.37-49

10.Долгих С.Г., Карычев К.Г., Остаркова Л.В. Клональное микроразмножение и оздоровление сортов и подвоев яблони.//Сб. трудов Каз.НИИПиВ «Научные достижения в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве»: 1997. -С.3-7

11.Долгих С.Г. Размножение и выращивание яблони в  в корнесобственной культуре.// Садоводство и виноградарство: 2004, № 5-С. 14-17

12.Журавлев Ю.Н., Корень О.Г., Музарок Т.И., Реунова Г.Д. Козыренко М.М., Артюкова Е.В.,Илюшко М.В. молекулярные маркеты для сохранения редких видов растений Дальнего Востока.// Физиология растений: 1999, т.46, № 6-С.935-964

13.Исаева И.С.  Органогенез  плодовых  растений. – М.: 1977 – С.1-34

14.Исаева И.С.  Продуктивность  яблони. – М.: 1989 – С.1-149

15.Ильин С.С., Маренков Н.Л. «Основы экономики».-.Высшее образование. Растов-На-Дону:Издательство «Феникс» 2004.-С.190

16.Клоконос Н.П., Долгих С.Г. Учебное пособие по биотехнологии размножения плодовых и ягодных культур. – Алматы: Республиканский  учебно издательский центр, 2006-С.158

17.Ковальчук И.Ю. Совершенствование  методрв термотерапии косточковых культур.// Ускорение научно-технического прогресса в плодоводстве и виноградарстве и задачи молодых ученых.- Алма – Ата: 1987-С.25-26

18.Кудрявцев Р.П. продуктивность  яблони.- М., 1987- С.1-303

19.Литвиненко  И.С. Изучение  реакции  плодовых  растений  на  термическое  обеззараживание  от  вирусов. //  Выращивание  посадочного  материала  плодовых и ягодных  культур.- М.: 1981.

20.Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.Н., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии.- М.: Агропромиздат 1990-384с.

21.Маслов В.А. Корнесобственная культура яблони в сравнение с привитой.

22.Охрана  труда. Сборник официальных материалов.- М.: Профиздат     1977.-С.25

23.Охрана труда и техника безопасности. Состав. Скала В.И.-Алматы:«LEM»,2002.-С.139

24.Помазков Ю.А. Итоги  изучения вирусных и микроплазменных болезней и вопросы  организации защитных мероприятий в Нечерноземной зоне.// В кн.: Технология выращивания безвирусного  посадочного материала плодовых культур.- Кишенев: Штиинца, 1977.

25.Положение  о производстве супер-суперэлитного, суперэлитного посадочного материала, закладка и эксплуатация маточных насаждений  плодовых и ягодных культур.- М.: Колос, 1984-С.23

26.Расулов А.Р., Лучков П.Г. Определение продуктивности и структуры прироста фитомассы деревьев яблони в интенсивных насаждениях.// Известие ТСХА: 1998, N 4 – С.137-147

27.Рекомендации по выращиванию безвирусного посадочного материала семечковых культур.- Алма-Ата: 1989-С.20

28.РСТ КазССР: 901-89. Яблоня и груша. Метод выращивания безвирусного посадочного материала.- С.16

29.Тулеуов Ж.Т. Получение  без вирусного  посадщчного  материала яблони (в Казахстане).// Плодоовощное хозяйство: 1986, №10 С. 15-17

30.Тулеуов Ж.Т. Термотерапия семечковых культур. // Защита растений:1988, 8-С.26

31.Цуркан И. Г., Бивол Т. Ф. термотерапия латентных вирусов яблони и ее эффективность.- Кишинев :1983 – С. 64 – 72

32.Achmet S. System of virus  eliminanion by thermotherapu in fruit trees.// Acta Phytopathol. Asad. Scient. Hung., 1980, 15, 1-4-p. 257-360

33.Cornuet P., Marrou J. Essais d ‘amelioration  du  rendement  de la thermatherapie de fraiser. // Adv. In. Hort. Sci., 1961,1

34.Campebell A.I.Heat sensitivity of some apple viruses // XII Europaisches Sumposium u ber viruskra nheiten der obstbaume/- Berlin, 1968-p.10

35.Cambell A.I. Apple virus inactivator by heat therapy and tip propagation // Research Station University  of Bristol, Long Aachton Bristol.// Nature, 1962, 195- p.332-324

36.Cfmpbell A.I. Le taux de guerison et la position du burgeon,la duree et I époque du traitement //Tab 11 ronde: Le thermotherapy des espoces ligneuss //Stat. Cult. Fruit maraich a Grand-Manil (Gembloux), les 11 et 12 mars., 1970 – p.104-110

37.Deogratias J.M., Luts A., Dosba F. In vitro  micrografting jf shoon- tips frjm juvenile and adult Prunus persica (L). Batsch to produce virut- tree plant.\\ Acta Hortic. Wageningen. 1986, 193-p.139-145

38.Fehrmann W., Vogl M. Bedeutung biotechnologischer Methoden furdie pbstproduktion./// Gartenbau (Berlin), 1988. 35 p. 175-176

39.Fulton R,W., Hamilton R.I.-Phytopath., 1960, 50-p. 635-636

40.Fulton R.W. Mitt. Biolog. Land. Forst-Berlin : Danleb, 1976, -p. 29

41.Guengerich H.W., Millikan D.F. Heat therapy as a method  for odtaining virus-free douse of apple.// Plant Disease Reporten., 1964, 48, 5-p.343

42.Hampton R.E., Fulton F.W., Virology, 1961, 13- p.44-52

43.Huang Slm-Ching, Millikan D.F. In vitro micrografting jf аpple shoot tips.\\ Hortscience, 1980, 15. N 6. Sce. 1-p. 741-743

44.Jakob H. Untersuchungen sur  Thermotherapie von Steinobstvirosen. Dtcsh. Pflanzschutz. Bundesants. Zand. Forstwirtsch – Berlin, 1972-р.146

45.Jakob H. Untersuchungen  unden  zur  thermotherapie von  stcinolstoiresen/  Acta Phytomedica, 1974, 2 – p.5-53

46.Jonard R., Hugard J., Macheix J., Martinez J., Mosella L.,Poessel J., Villemur P, 106 Congr. Nat, soc. Savants. Perpingnan, 1981, Seen. Sci. Fasc.2. Paris,1982-p. 9-29

47.Kassanis B., Posnette A. Recent Adv. Bot. Univ. of Toronto Preess, 1961 – p.557 -563

48.Lenz F., Baumann G., Kornkamhaeng P. High temperature treatment of Prunus avium L. <F12 1> for virus elimination. Phutopath. Z.106, 1983-s. 373-375

49.Marenaud c., Keramidas C. Separation par thermotherapia du  Virginia decline et de six autres infection virales du pommier.//Ann.Phytopathol.,1969, 1.-4-p.645-652

50.Morre  J.D.. Boyle I.S.,Keitt G.W. Science. 1948, 108-p.623-624

51.Navarro L., Juarez J., Pina J.A., Ballester J.F. The citrus quarantine station in Spain. 9^th  IOCV Conference, 1983 – p.1-13

52.Navarro L.,Llacer G., Cambra M. Arregui J.M., Juarez J. Shoot-tips grafting in vitro for  elimination of viruses in peach plants (Prunus Persica (L) Batsch). Acta Horticulturae, 1982, J.30 – p.185-192

53.Ozzamba K.E. Schmidt Hanna. in vitro and in vivo  micrografting jf cherry (Prunus Avium L)/\\ Gavtenbauwisstn-schaft, 1991. 56, N5-p.221-223

54.Penrose L. Virus disease in deciduous fruit trees – reducing the problem.//Agr. Aoz. NSW,   1974, 1985, 2- p. 8-9

55.Quamme H.A., Brownlee R.T. Ealy  performance jf micropropagated trees jf several Malus and Pybys cultivars jn there own roots.\\Can. J. Plant Sci., 1993, 73, N 3 – p.847-855

56.Tomlinson J.A., Walkey D.G. Ann. Appl. Biol., 1967, 59-p.415-427

57.Van der Meer F.A. – Stat. Cult. fruit. Maraich. A Grand – Vanil (Gembloux), 1970-p.56-58

58.Welsh M.F., Nyland G. Canad. J.Pl. Sci., 1965, 43,5-p. 443-454

59.Wang A., Sanfacon H., Stobbs L.W., James D., Thompson D., Svircev A.M., and Brown D.C.W. Plum pox  virus in Canada : progress  in  research  and  future  prospects  for  disease control // Can. Plant  Pathol. 28, 2006 – p 182-196

60.Walsh C.S., Swarts H.J., Carison P.S. Are tissue culnure plants for you? Am. Fruit  Grower, 1996, 106,3,  38-p. 40-41.

61.Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA Polymorphism Amplified dy Arbitary primers are useful as GeneticMarkers.// Nucleice Acids Res., 1990, V. 18-p 6531-6535

62.Wood  G.A.  Heat  therapy: method  and application  to  control  plant  viruses.//  Comb. Proc/  (Internat. Plant  Propagatiors  Soc. Milltown, N.J.), 1975, vol. 25-p. 322-324

 

 

 

 

Гордостью Казахстана и раньше и теперь является сорта яблоня «Антоновка».

Однако за последнее столетие  Антоновка уступил место новым сортам, который по природным условиям различных районов  или по экономическим причинам оказались предпочтительнее. Тем не менее в условиях юго-востока Казахстана Антоновка был, есть и еще на долгие годы останется ведущим сортом яблони, восхищая всех высокими качествами  своих плодов, что и побудило нас вернуться  к этому сорту, впервые изучить его онтогенез и способы его регулирующие в культуре тканей. Однако при решении этого вопроса возникают трудности в выборе маточных  деревьев, т.к. в практическом садоводстве имеет место  вегетативная изменчивость сорта  через почковые мутации. Изменения происходят  по окраске, величине, форме, лежкости и качеству плодов, по времени созревания и урожайности, зимостойкости, устойчивости к вредителям и болезням. Но не всегда почковые клоны  бывают с положительными уклонениями. Имеются многочисленные  отечественные и зарубежные данные о засорении районированных  сортов примесями этих же  сортов с отрицательными уклонениями. Одна из причин вариаций деревьев  Антоновки – беспорядочное  размножение, которое  может при вести к еще большему ухудшению сорта.

Исходя из этого  ставится задача размножить  через культуру тканей отборные клоны Антоновки, изучить  особенности онтогенеза и способов его регулирования в культуре тканей и получить корнесобственный материал Антоновки для изучения его биологических  особенностей.

Единственный  путь  развития  отраслей  растениеводства —  их  интенсификация  через  постоянное  сортообновление,  внедрение  интенсивных   технологии  производства  продукции,  в  том  числе  и  высококачественного  посадочного  материала.  Одним  из  приоритетных  направлений  национальных  экономик  ведущих  стран  мира  по  решению  этой  проблемы  стала  биотехнология.  Значительный  резерв  увеличения   продукции  садоводства  заключается  в  снижении  потерь  от  вирусных  и  микроплазменных  болезней.  Большие  и  постоянные  потери  урожая,  вызываемые  вирусными  хроническими  заболеваниями  плодовых  культур,  требует  перевода  питомниководства  на  производство  свободного  от  вирусов  посадочного  материала,  с  использованием  современных,  надежных  экспресс- методов  вирусологического  контроля.

Нами проводилась работа по отбору клонов Антоновки и его введения в культу тканей. Для  культуры  изолированных  апексов  используют  большие  количество  питательных  сред,  отличающихся  по  минеральному  составу  которые  представлены  в  таблице  1.

Питательные  среды  спецефичны  для  каждого  видарастении,  для  культивирования  каждого  органа  и  ткани  или  клеток.  Обычно  они  носят  названия  рекомендовавшего  их  автора.  Наиболее  широко  используются  питательные  среды  представлены  в  таблице  1.

В  состав  каждой  среды  в  строго  определенном  количественном  соотношении  входят  минеральные  макро-  и  микросоли,  органические  вещества  (сахароза,  глюкоза),  стимуляторы  роста  (ауксины,  цитокинины),  некоторые  витамины  группы  В  и  другие  соединения.

В таблице 1 приведен состав широко используемых питательных сред для культивирования клеток и тканей растений  плодовых культур.

Таблица 1.  Питательные среды для клонального микроразмножения плодовых  культур

 

Компоненты	Концентрация в среде для культивирования, мг/л
	Андерсон (1978)	Мурасиге-Скуга (1962)	Гамборга В5 (1968)	Боксуса (1964)	Уайта (1963)	Нича (1969)	Шенка-Хельде-брандта (1972)
Ca(NO3)34H2O	—	—	—	500	300	—	—
KNO3	480	1900	2500	125	81	950	2500
Na2SO4	—	—	—	—	200	—	—
NH4NO3	400	1650	—	—	—	720	—
(NH4)2SO4	—	—	134	—	—	—	—
KH2PO	—	170	—	125	12	68	—
MgSO42H2O	370	370	250	125	74	185	400
CaCl22H2O	440	440	150	—	—	166	200
KCl	—	—	—	—	65	—	—
NH4H2PO4	—	—	—	—	—	—	300
NaH2PO4H2O	380	—	150	—	16,5	—	—
MnCl24H2O	—	—	—	—	7,0	—	—
MnSO44H2O	16,9	22,3	10	22,3	4,5	25	10
H3BO3	6,2	6,2	3	6,2	1,5	10	5,0
ZnSO47H2O	8,6	8,6	2	8,6	3,0	10	1,0
KJ	—	0,83	0,75	0,73	0,75	—	1,0
CuSO45H2O	0,025	0,025	0,025	0,025	—	—	0,2
Na2MoO42H2O	0,25	0,25	0,25	0,25	—	0,25	0,1
CoCl26H2O	0,025	0,025	0,025	—	—	0,025	0,1
AlCl3	—	—	0,03	—	—	—	—
FeSO47H2O	55,7	27,8	27,8	27,8	—	27,8	15
Na2 ЭДТА	74,5	37,3	37,3	37,3	—	37,3	20
Fe2(SO4)3	—	—	—	—	2,46	—	—
Тиамин HCl	0,4	0,5	10	0,1	0,1	0,5	5
Никотиновая кислота	—	0,5	1	0,5	0.5	5,0	5
Аскорбиновая кислота	—	1,0	—	—	—	—	—
Пиридоксин HCl	—	0,5	1	0,5	0,1	0,5	0,5
Глицин	—	—	—	2,0	3,0	2,0	—
Биотин	—	—	—	—	—	0,05	—
Мезоинозит	100	100	100	100	—	—	1000
Аденин SO4	80	—	—	—	—	—	—
Дрожжевой экстракт	—	—	—	—	100	100	—
Сахароза, г	30	30	30	20	20	20	30
Агар-агар, г	6	5-7	7	8	7	8	7
рН		5,9	5,5	5,6-5,8	5,5	5,6	5,9

 

 

Таблица 2.Влияние обработки побегов на ростовую активность сортов ябло­ни при термотерапии

 

Сорт		Состояние почек после 4 недель термотерапии
		Контроль/вода			Гиббереллин, 50 мг/л		Раствор Кнопа
		Поги бшие, %		Рост, см пазушные/ апикальные	По­гиб­шие, %	Рост, см пазушные/апикальные	По­гиб шие, %	Рост, см пазушные/ апикальные
Голден Делишес		0		2,1±0,14/ 7,6±0,38	0	2,2±0,25/ 4,8±0,44	0	2,0±0,35/ 4,0±0,10
	Антоновка		0	1,0±0,1/4,5±0,18	0	1,2±0,20/ 3,7±0,23	0	1,5±0,21 / 3,0±0,29

 

      Результаты исследований показали, что обработка гиббереллином Антоновки и сорта яблони Голден Делишес способ­ствовала не только лучшей интенсивности роста побегов, но и выживанию почек: если в контроле погибли все 100%, то  при обработке гиббереллином соответственно 50 и 53% почек. У сорта Антоновки влияние предварительной обработки побегов на рост пазушных почек было несколько меньше, что говорит о меньшей его термолабильности. Наименьший прирост по этим сортам, отмечался при замачивании побегов в растворе Кнопа, который ввиду богатого содержания питательных веществ очень быстро зарастал микрофлорой.

Значительным количеством работ доказана эффективность приживае­мости изолированных верхушечных меристем в культуре тканей, обработан­ных теплом

Таблица 3. Влияние  стерилизующего  вещества  и  экспозиция обработки  на  контаминацию  апексов  яблони сорта Антоновки

 

Варианты	Общее количество высаженных эксплантов, шт.	Инфицировано   %
Диоцид (0,1%), 15 мин.	409	40,7
Н 2О 2 (16%), 7 мин.	392	15,3
Н 2О 2 (33%), 4 мин.	710	15,1
С2Н2ОН,10сек.+Н2О2 (16%), 4 мин.	123	9,1

 

 Стерилизация  диоцидом  в  течение  15 мин. Обеспечила  освобождение  от  вирусной  инфекции  на  59%,  тогда  как  стерилизация  перекисью  водорода  на  85%.  Стерилизация  концентрированным  пергидролем  в  отличие  от  16%  эффекта  не  дала,  но  действовала  более  жестко  на  апикальные  верхушки  яблони,  вызывая  повреждения  отдельных  тканей,  а  затем  и  полный  некроз  самого  экспланта.  Наибольшее  стерилизующего  эффекта  (91%  стерильных  эксплантов)  можно  добиться,  сочетая  обработку  этанолом  в  течение  10  секунд,  а  затем  16% Н 2О2  в  течение  4  минут.

Таблица  4. Влияние  ЭАВ  на  приживаемость  апексов  яблони сорта Антоновка

 

Вариант	ЭАВ, режим  стерилизации	Всего  вычленено, шт.	Погибли, шт		Выход %
			Химический ожег	заросли
1	Аналит нейтральный рН6(безсоли) 3мин+каталит 5 мин.	24	20	0	17
2	Аналит нейтральный рН6 АНК,5 мин	24	24	0	0
3	Аналит нейтральный АНК, 5мин+кеталит 3 мин.	24	10	2	40
4	Аналит кислый рН3, 5 мин.	24	0	4	83
5	Аналит кислый рН3, 3мин.+аналит нейтральный (без соли),3 мин.	24	8	0	67
6	Диоцид,3мин. контроль	24	0	4	83

 

Анализ  таблицы  5 показывает,  что  наибольший  стерилизующий   эффект  получен  при  обработке  эксплантов  Антоновка   диоцидом  (3 мин.) и в 4 варианте  при  отборе  кислым  аналитом  рН3  в  течение  5  минут  (83%).  Хороший  эффект  по  снижению  контаминации  получен  при  отборе  вариантом  5,  однако  меристемные  ткани  получили  сильный  ожог,  в  результате  чего  выход  живых  эксплантов  был  не  высоким  (67%).  Сильный  ожог  получили  ткани  при  обработки  аналитом  нейтральным  (без  соли)  и  АНК.  Последующая  обработка  католитом,  как  стимулятора,  не  дала  положительного  эффекта.  Исходя  из  этого,  можно  рекомендовать  стерилизовать  экстракты  яблони,  наряду  с  диоцидом,  кислым  аналитом   рН3  в  течение  5 минут.  При  введении  в  культуру  тканей  инфекция  преимущественно  имеет  грибную  природу   и  относительно  легко  устраняется  с  помощью   различных  стерилизующих  агентов – диоцида  или  сулемы.  Были  продолжаны  исследование  в  направлении  поиска  экологически  безопасных  препаратов.  Изучалось  влияние йода  (J)  на  контаминацию  апексов  яблони.  Установлено,  что  наибольшего  стерелизующего эффекта  можно  добиться  при  обработке  эксплантов  0,-1 %  раствором   J  в  течение  15  мин,  когда  выход  стерильных  эксплантов  достигает  80%.

  Через 20-23 дней  культивирования  меристиматической  верхушке  начинают  развиваться  и  экспланты  увеличиваются  в  размере  до  1-2 см.  в  начале  разворачиваются  и  растут  листья,  а затем  начинается  рост  стебля  в  журнале  отмечают  дату  начала  развития  экспланта  переход  к  активному  росту.Большое влияние на регенерацию апексов Антоновки оказывает физиологическое состояние маточных деревьев. Так, при изучении высоты над уровнем моря произрастания маточных деревьев Антоновки было установлено, что лучшей регенерацией отличались апексы взятые с маточных деревьев, произрастающих на уровне 1070 м/над Ур. моря (таб.6).

 

Таблица 5. Приживаемость и регенерационная  способность     апексов  клонов  Антоновки  in  vitro

 

Антоновка, м\ур. моря	Вычленено  апексов, шт.	Регенерировало эксплантов, шт.	Приживаемость, %	Число пазушных  побегов, шт\1 черенок,1 пассаж
1250	40	35	87	4,0±0,15
1070	40	36	90	3,5±0,20
700	40	30	75	2,8±0,22

 

 

  Это  указывает  на то,  что оптимальные  условия   произрастания  маточных  растений,  где  с  наибольшей  степенью  реализуются  генотипические  признаки  сорта, положительно  влияют  на  регенерационную  способность  при  их  культивировании  в условиях  in  vitro. Как  видно  из  таблицы  6,  варьирование  приживаемости  было  в  пределах  от 5  до 15%, а в  пролиферации  достигало  30%  в  зависимости  от  клона  и  места  произрастания. Наибольшей  регенерационной активностью  отличался Антоновка,  произрастающий  в среднегорной  зоне,  менее в нижнегорной  и  слабой  на  высоте  700 м над  уровнем  моря.

 

Таблица 6. Экономическая оценка новой и традиционной технологии производства корнесобственных саженцев Антоновки

 

№ п/п	Показатели	Новая технология	Традиционная технология
1.	Производство одного саженца, год	1,5	3
2.	Затраты на выращивание 1 саженца, тенге	40	70
3.	Реализационная цена 1 саженца, тенге	200	200
4.	Сумма реализации (35 тыс.шт.), тыс.тенге	7.000,0	4,550,0
5.	Полная себестоимость тыс. тг.	1.400,0
6.	Прибыль от реализации 1 тыс.шт./тыс.тенге	5.600,0
7.	Экономическая эффективность тыс. тенге на 1 тыс. шт.	160	130
8.	Рентабельность %	5.600,0	—

 

 

Экономический эффект выращивания 1 тыс. саженцев Антоновки составляет 200 тыс. тенге, за счет высокого коэффициента размножения и в 2 раза сокращения срока выращивания. Новая технология эффективно традиционной технологии