Дипломдық жұмыс: Цитокини медиоторының жоғары сатыдағы өсімдіктер морфогенезіне әсерін зерттеу

әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті

 

БИОЛОГИЯ ФАКУЛЬТЕТІ

 

Генетика және молекулалық биология кафедрасы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

БІТІРУ ЖҰМЫСЫ

 

Цитокини медиоторының жоғары сатыдағы өсімдіктер морфогенезіне әсерін зерттеу

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Алматы,  2009

РЕФЕРАТ

 

Бітіру  жұмысы: 34 беттен, 38 әдебиеттен, 1- сызбадан,  9 -суреттен  тұрады. Бітіру жұмысын  Тоқтасын Нұргүл  М. А.  Айтхожин   атындағы биохимия  және молекулалық  биология институтының  ферменттердің  құрылымы  мен реттелу  лабораториясында өткізді.

Өзектілігі: Цитокинин медиаторын бөліп алып, тазартып,  медиаторының  морфогенезге әсерін қарастыру

 Неізгі сөздер: бидай дәні,  ұрық бөлігі,  алейрон қабаты,  НАДФ  глютаматдегидрогеназа,   цитокинин,  цитокинин  медиаторы,   ризогенез,  морфогенез, каллус

 Алдына  қойылған  мақсаты: цитокинин  медиаторын бөліп алып,тазартып  оның   морфогенезге әсерін  қарастыру.

  Қолданылған әдістер: Октил сефароза (CL-4B) гидрофобты хроматографиясы және RP-18 колонкада жасалынатын жоғары қысымды кері  фазалы хроматография, гомогенизациялау, центрифугалау, инекьция жасау, , Мурасиге – Скуг ортасында каллустарды өсіру

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР

 

ДАГ — диацилглицерол

PIP — фосфоинотидилинозитол

ИФ₃ — инозитол үш фосфат

ФИФ₂  — фосфоинотидилинозитол 2 фосфат

  НАДФ-ГДГ-             никотинамидадениндинуклеотидфосфат                                                                                                глютаматдегидрогеназа                     

РНҚ — рибонуклеин қышқылы

ЦББ – цитокинин байланыстырушы белоктар

ИУК — индонил сірке қышқылы

БАП — бензоаминопурин 

ФК–фузикокцин   
                                              МАЗМҰНЫ

 

 

Кіріспе.…………………………………………………………………………………………………5

1. Әдебиеттерге шолу…………………………………………………………………………6

     1.1Цитокининнің ашылуы мен химиялық    табиғаты……………………………..6

1.2. Фитогормондардың  атқаратын ролі………………………………………………..8

1.3. Цитокинин медиаторының өсімдік морфогенезіне әсері………………….11

1.4. Цитокининнің медиаторы……………………………………………………………….16

1.5.Цитокинин синтездеуші гендердің  трансфромациясы……………………..16

2. Тәжірибелік бөлім…………………………………………………………………………..18

2.1. Материалдар мен     зерттеу әдістері……………………………………………….18

2.2.Алынған нәтижелерге талдау жасау…………………………………….19              

Қорытынды……………………………………………………………………………………….30

Пайдаланылған әдебиеттер……………………………………………………………….32

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

КІРІСПЕ

 

Қазіргі заманғы биологияның ең болашағы зор әдістерінің бірі өсімдік клеткасы мен  ұлпасын жасанды жағдайда өсіру. Әсіресе гаплоидты технологияның тиімділігі зор. Гаплоидты организмде барлық рецессивті белгілері көрінеді. Аталық тозаңдарды өсіру арқылы гаплоидты организмдерді алуға болады. In vitro  жағдайында өсімдік ұлпасын өсіріп, өсімдік жүйесінің бір клеткадан дифференциация гистогенез, морфогенез арқылы біртұтас өсімдік алу мүмкіндігінің күрделі механизмдерін зерттеуге болады. Клеткаларды In vitro   жағдайында өсіру әдістерінің ең күрделі мәселесі каллус клеткаларының морфогенез процестерін реттеу болып табылады.  өсімдік клеткасын жасанды жағдайда өсіргендегі технологияда қолданудың басты мақсаты біртұтас регенерант өсімдігін алу. Даражарнақты өсімдіктердің, әсіресе астық тұқымдастардың оқшауланған ұлпаларын In vitro жағдайында өсіруге өте қиын, себебі бұл өсімдіктердің тотипатенттілік қасиеті төмен. Сондықтан органогенез процесіне эффективті әсер ететін және каллус түзуге, өсу және морфогенез  процестерін реттейтін жаңа биореттегіштерді іздеу қажет [1,2]. Гормондар – тірі организмдердің тіршілігі үшін маңызы өте зор.  Организмдердің дамуы,  өсуіндегі ең негізгі процестер гормондармен реттелуге тәуелді.  Гормондар жетіспеген жағдайда немесе артып кететін болса онда организмді ауруға ұшыратады. Яғни осы қызметтеріне қарап гормондарды — организмді реттеуші патшалық деп айтуға болады. Өсімдік тіршілігін реттеуде өсімдік гормоны цитокининнің  маңызы зор. Цитокининнің функциясы өсімдік онтогенезінің барлық кезеңдерінен көрінеді. Цитокининді зертеу аймағындағы жаңа жетістіктер мен көріністерге кейінгі жылдары ғалымдардың қолы жетуде [3,4]. Цитокинин — клетка бөлінуін реттейді, хлоропластардың дифференцациясына қатысады. Клетка бөлінуі үшін цитокининнің маңызы зор.  Осы гормонның сигнальды трансдукция  механизмі әлі анықталмаған. 

Трансдукция дегеніміз — сигналдың сигналға қатарымен берілуі.  Трансдукцияның ерекшеліктері бар.  Сигнал иерархиясы — жоғары дәрежелі сигнал  төменгі дәрежелі сигналды тудырады,  ал төменгі дәрежелі сигнал жоғары дәрежелі сигналды тудыра алмайды. Трансдукция сигналды эстафета тәрізді өткізіледі.  Эстафета тәрізді сигнал әр сатыда өзгереледі,  басқаша айтқанда  жоғары сатылы сигнал тек қана көршіге әсер етеді,  ол ары қарай  сигналды бере алмайды. Сигналды трансдукцияның механизмінде медиатордың ролі өте маңызды.  Медиатор –  екінші сатыдағы  сигналды беретін зат. Себебі гормон  тікелей өзі емес медиаторлар арқылы клеткаға әсер ете алады.  Сол себептен цитокинин   медиаторын зерттеу қызығушылық тудырады  [5]. Біздің мақсатымыз цитокинин медиаторын бөліп алып, тазартып оның  морфогенез процесіне әсерін зерттеу; Осы мақсатқа жету үшін алға қойылған  міндеттер: Цитокинин медиаторын бөліп алу; цитокинин медиаторын in vitro жағдайында өсіп жатқан бидайдың каллустарының морфогенезіне әсерін тексеру,  Практикада цитокинин медиаторының қолдану жолдарын іздестіру.

1.ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ

 

1.1. Цитокининдердің ашылуы  мен химиялық табиғаты

 

Клетка бөлінуін қоздыратын, морфогенез, қартаю процестерін,   тыныштықты реттеуде іске қосылатын және   алуан түрлі  биологиялық белсенділіктің    белгілі бір жиынтығына ие болатын фитогормондар типінің бірі – цитокинин болып табылады.  Өсімдіктерден цитокининді 1955 жылы алғаш рет  АҚШ-тағы Висконсинс университетінде Миллер мен Скуг ашты [6,7]. Цитокининнің ашылуына келесі жағдайлар көмектесті. Авторлар темекі сабағы өзегінен алынған каллустармен  жұмыс істей отырып, белгісіз фактордың жетіспеуінен оның өсуінің тоқтап қалатынын байқаған. Сондықтан ғалымдар каллустардың өсуіне  жеткіліксіз белгісіз факторды  ашытқы экстрактысынан бөліп алуды қарастырды. Осымен бірге бұл активті заттың құрамына пуриннің кіретіндігін де анықтады. Сонымен қатар табиғи  пуриндік негіздің РНК және ДНК гидролизатындағыдай  темекі сабағы каллусының өсуіне жағдай туғыза алмайтындығын тексерді. Байқаусызда активті болып бұрыннан сақталып келе жатқан ДНК препаратының  эфирлі экстрактысы болып табылды. Сонымен активті затты кез-келген ДНК  препаратын қышқылдық ортада автоклавтау жолымен оны дегидрациялау арқылы алуға болатындығын анықтады. Бұл зат кристал түрінде және иденфикациялау арқылы бөлініп алынды [8,9]. Ол 6-фурфурил-аминопурин болып табылады. Өте активті цитокинин -6-(g g -диметилалил)﹣аминопурин немесе изопентениладенин  деп аталады.ол тасымалдаушы РНК құрамына минорлы негіз түрінде кіреді.  6-фурфуриламинопурин ИСҚ-ның қатысында темекі сабағының орталық ұлпасын оқшаулағанда  клеткалық бөліну жүрген. Ол  кинетин деп аталды. Түрлі синтетикалық цитокининнің активтілігі  салыстырылып, тексерілді. Солардың ішіндегі ең активтісі- 6-(g g — диметилалил) аминопурин ал 6-бутил  6-амил-, және 6-гексиламинопурин  активтілігі   бойынша 6-БАП-қа жақындаған [9]. 1913-1923 жылы Г. Габерланд өсімдіктен бөліп алынған жапырақ тақташасының бетіне белгісіз заттың бөлініп шыққанын байқаған. Ол осы заттың өсімдіктің  жарақат алған жерін қалпына келтіретін қасиеті бар екенін байқады.  Осыдан кейін Габерланд бұл зат клетка бөлінуіне әсер ететінін,  өсімдік жарақат алған кезде  қалпына келтіру гормонына айналады деп тұжырымдады [10,11] . Кокос “сүтінің ” құрамынан бөлініп алынған цитокининдер тобына жататын активті қосылыстың бірі – дифенилмочевина,  өсімдіктер клеткаларының бөлінуіне күшті  әсер етеді.Цитокинин   тамырдың ұшында түзіліп,  су ағынымен қоса жоғары қарай жылжиды [12] . Қазіргі кезде цитокинин микроорганизмдерден,  балдырлардан,  папортниктерден,  мүктерден және көптеген  жоғары сатылы өсімдіктерден табылған.  Негізінен цитокинин клетканың индукциялық бөлінуін активтендіреді.  бұл қасиетін жекеленген темекі ұлпасын арнаулы ортада өсіру кезінде байқаған.  Сонымен қатар цитокининнің тағы бір қасиеті бұл мүше түзуге қатысуы.  Цитокинин ауксинмен қатарласа тамыр,  гүл,  тағы басқа мүшелерді түзетіндігі ашылған болатын.  Цитокинин споралы өсімдіктер мүк,  папортниктердің мүше түзуіне қатысып,  оны реттеп отырады.  Генеративті мүшелердің түзіліп оның қалыптасып,  тез жетілуіне де әсері бар.  Бір сөзбен айтқанда цитокинин басқа гормондармен бірігіп морфогенез процестерін активтендіреді [13,14].                   Алғашқы табиғи цитокининді 1964 жылы  Лезамом Letham бөліп алды, бұған дейін жүгерінің сүттену кезеңіндегі дәнін алып, спирттік экстрактысын  бірнеше саты тазартудан өткізіп қолданған [15]. Цитокининді жүгеріден бөліп алынғандықтан оны зеатин деп атаған. Табиғи цитокининнің формуласы 2 — суретте көрсетілген.      Сонымен қатар зеатин өріктің пісіп жетілгенінен, өсіп тұрған алма өнімінен микоризді саңырауқұлақтың  культуралық сұйықтығынан табылған. Люпин ұрығынан – дегидрозеатинді тапқан. Сонымен бірге цитокиинин папортниктен, қыналардан, және балдырлардан табылған  [16] .

Зеатинге басқа туыс заттар өсімдіктер бактериясынан Corynebacterium fascians патогендік культурасынан бөлінген. Өсімдікке оның әсері  цитокинин препаратының әсеріне ұқсайды және  апикальды басымдылықтың бұзылуымен байланысты. Осымен бірге зеатин және оған туыс цитокинин активтілігімен  байланыстар өсімдіктер әлемінде  кеңінен таралған.

Цитокининнің физиологиялық әсерінің бірі  жапырақтың қартаюын кештетуінде. Бұл алғаш рет  Richmond және Lang-тың жұмыстарын  әйгілі етіп көрсетті. Цитокинин және апикалдық басымдылықты тежейді.

 1955 жылы алғаш рет американ зерттеушісі Ф. Скугтың лабораториясында цитокинин ашылған. Олар in vitro жағдайында тәжірибе жасау кезінде  өсімдікте белгісіз бір заттың клетка бөлінуін жылдамдататынын байқаған.  Ол зат 6 — фурфураминопурин  екенін анықтады.  Бұл зат кейіннен кинетин деп аталды  [17].

Кинетеин – ақ түсті кристалды зат,  құрылымдық формуласы C₁₀H₉ N₅O молекулалық салмағы 215, 5  Кинетин суда нашар ерісе,  этанолда,  сілтілі ерітінділерде,  қышқылда жақсы ериді. Ол қыздырғанда қышқыл мен сілтілердің әсеріне өте төзімді келеді.

Қазіргі кезде цитокининдердің төмендегідей түрлері белгілі: кинетин,  зеатин,  6- (g g — диметилалил) — аминопурин, дифенилмочевина,  фитогормондардың бұл топтары аденин туындылары болып табылады.

Жетілмеген яғни пісе қоймаған жүгері дәндерінен анықталған цитокининді зеатин деп атайды.

Өте активті цитокинин – 6 — (g g — диметилалил)-аминопурин деп аталады. Ол тасымалдаушы РНК құрамына минорлы негіз түрінде кіреді.  Кокос сүтінің ” құрамынан бөлініп алынған цитокининдер тобына жататын активті қосылыстың бірі – дифенилмочевина,  өсімдіктер клеткаларының бөлінуіне күшті  әсер етеді:          Цитокинин тамырдың ұшында түзіліп,  су ағынымен қоса жоғары қарай жылжиды  [18].

    Қазіргі кезде цитокинин микроорганизмдерден,  балдырлардан,  папортниктерден,  мүктерден және көптеген  жоғары сатылы өсімдіктерден табылған.  Негізінен цитокинин клетканың индукциялық бөлінуін активтендіреді.  Бұл қасиетін жекеленген темекі тканін арнаулы ортада өсіру кезінде байқаған.  Сонымен қатар цитокининнің тағы бір қасиеті бұл мүше түзуге қатысуы.  Цитокинин ауксинмен қатарласа тамыр,  гүл,  тағы басқа мүшелерді түзетіндігі ашылған болатын.  Цитокинин споралы өсімдіктер мүк,  папортниктердің мүше түзуіне қатысып,  оны реттеп отырады.  Генеративті мүшелердің түзіліп оның қалыптасып,  тез жетілуіне де әсері бар.  Бір сөзбен айтқанда цитокинин басқа гормондармен бірігіп мүше түзу процестерін активтендіреді  [19].

 

 

 

1-сурет  Цитокининнің табиғи түрі – зеатиннің формуласы

 

1.2 Өсімдік гормондарының атқаратын ролі

Кейінгі зерттеулердің барлығы дерлік өсімдік фитогормондарының өсу процесіне,  клетка бөлінуіне әсерін зерттеу бағытында жүргізіледі.  Небәрі 60 жыл ішінде  бірінен соң бірі этилен, цитокинин ашылған болатын.  Ал енді фитогормондарға  толығырақ анықтама беретін болсақ  фитогормон – бұл  аз молекулалы органикалық салмағы төмен эндогендік зат.  Клеткада, тканде өте аз мөлшерде болады. Фитогормондар клеткамен клетка, тканмен ткан, мүше мен мүше байланысқанда көптеген морфогенетикалық және физиологиялық программаларды атқарады.  Фитогормондар өсімдік организміндегі заттардың  мөлшеріне, маңыздылығына,  ерекшелігіне көбеюге,  клетканың бөлінуіне,  тыныс алуға,  қартаюға,  зат алмасуға қатысады.  Сонда әр топтың өзіне тән атқаратын қызметі бар. Мысалы:

1. Өсімдік гормоны тек органикалық қосылыстардан тұрады.  Оның молекулалық салмағы 28 ден (этилен) 346 (ГА) дейінгі аралықта болады. Өсімдік тканінен осы уақытқа дейінгі фитогормондар құрамынан белокты және полипептидті қосылыстар табылған жоқ.  
2. Фитогормондар клеткада, тканде бос физиологиялық активті күйде болады. Өте аз концентрациядада 10^-5-10^-10 концентрацияда өте активті бола алады.
3. Гормондар бір клеткада түзіліп, басқа клеткаларға әсер етеді.  Бұл өсімдіктің барлық мүшелері бірдей бір қалыпта жұмыс істеуіне мүмкіндік жасайды.
4. Фитогормондар физиологиялық және морфогенетикалық процестерді реттейді. Сонымен қатар генді аппараттың белоктарымен байланысады. Осы жағынан фитогормондар витаминдерден ерекшеленеді [20,21].

Өсімдіктердің гормондық жүйесінде фитогормондарды 5 топқа бөледі: ауксин,  гибберлин, цитокинин, абсциз қышқылы, этилен.  Бұл физиологиялық заттардың арасында көптеген байланыстар бар.   Цитокинин-бүршік қалыптасуын реттейді. Фитогормонның физиологиялық әсері рецептормен байланысты. Рецепторлар — бұл берілген гормонның физиологиялық әрекетін іске асыру үшін қажетті, нәтижесінде биохимиялық реакциялардың рецепторларымен инициация жүретін гормонды  қайтымды байланыстыру үшін қажетті жоғары спецификалық сайттарға ие, сәйкес нысана клеткаларында болатын химиялық құрылымдар. Сол себепті рецепторлар клетканың гормонға жауап беретіндігін ескертуде  ең маңызды қызмет атқарады  [22].

    Негізгі биохимиялық процестердің  негізгі нәтижелері арқылы және жануарлар мен өсімдіктердің клеткаларында ерекше белгілерге ие рецепторлардың  критерийлерін таратып қарауға болатындығы белгілі болды. Жануарлардың рецепторлары жәй және модификацияланған болып бөлінетіндігі белгілі, оларды  негізінен екі негізгі типке жатқызады:

1. Клетка ішіне енген гормон молекулаларын байланыстырушы – клетка ішілік рецепторлар.
2. Клетка сыртындағы сұйықтықтағы мембрана  үстіндегі гормондарды байланыстырушы – мембраналық рецепторлар.

Сонымен қатар бірінші типтік рецепторлар гормонмен байланысқан уақытта өзінің конформациясын өзгертіп, гормон рецепторлық комплекс түрінде клеткадағы әртүрлі  метоболиттік процестерге әсер ету қабілеттілігіне ие бола алады. Екінші типтің рецепторлары берілген гормонның физиологиялық әрекетін іске асыратын заттар: с АМР, с GMP, Са²⁺, фосфоинозитид, диацилглицерин,  екіншілік медиаторлардың клетка ішілік концентрациясының күрт үлкеюіне шақырады. Сонымен қатар,  гормондарды рецепторларымен басқа рецепторлық емес гормон байланыстырушы белоктары болады. Олар: метаболизм ферменттері. Сондықтан оларды рецепторлардан ажырату үшін келесі критерилер қолданылады:     

• Гормон мен рецепторлардың бір – бірімен қатынасы жоғары маманданған болуы қажет. Рецептор гормон молекуласының құрылымын танып, оны жоғары аффинділігімен байланыстыруы қажет.
• Гормон мен рецептордың байланысы қайтымды болуы қажет, бірақ гормон химиялық өзгермеген  күйінде қалуы керек.
• Гормон мен рецептордың байланысуы үшін процесс қанықты болу қажет.
• Физиологиялық эффекті шақыратын, гормонның рецепторы және концентрациясы мен байланысуы қандырылған болса, гормондардардың концентрациялары арасында сәйкестілік болуы керек.
• Осы рецепторлармен ұлпа және мүше реттеуші клетканың үйлісімділігі болуы керек

Бұл жұмыста өсімдіктер гормондарының рецепторларын зерттеудегі соңғы жылдардағы жетістіктер келтірілген  [23,24].    

Этилен рецепторларындағыдай, N – ұшында гидрофобтық сегменттер бар: екі сегмент АНК 4-те және  үш сегменттен АНК2 мен  АНК3 -те. Негізгі фитогормондардың нысанасы ретінде өсімдіктер клеткалары қолданылады. Өсімдіктердің өсуі мен даму процестеріне  әртүрлі гормондар  әсер етеді. Сонымен қатар, бір гормон әсер ету  орны және өсімдіктердің даму фазасына байланысты әртүрлі физиологиялық процестердің жүзеге асырылуына қатыса алады. Бұл жағдайда гормондардың әсерінің көп функциялдылығы өсімдіктердің гормональді жүйесін зерттеуде қосымша қиыншылықтар тудырады. Мысалы, бір өсімдіктердегі жан-жақты жалғыз рецептор арқылы әртүрлі бағдарламаларды индукциялайтындығы әлі де табылмаған. Өсімдіктер мен жануарлардың гормондары химиялық жағынан ұқсас емес, ал белгілі гормондардың жалпы саны яғни өсімдіктердің гормондары жануарлар гормондарына қарағанда  саны жағынан аз. Бұл жағдайда гормондар биохимиялық реттеуші — өсімдіктерде ең маңызды және жалғыз реттеуші болып табылады, ал бұл жануарлардың нерв реттеушісіменен қатар әсер етеді. Дегенмен өсімдіктер клеткаларының фитогормондарға спецификалық реакциялардың мүмкіншілігін ескере отырып, жануарлардың гормональды информациясын іске асырудағы  молекулалық механизмдерін зерттеу  нәтижесінде өсімдіктер клеткаларындағы гормондардың реттелуін және трансдукциясын  зерттеуде үлкен табыстарға жетті. Мысалға алсақ  өсімдіктерде де жануарлар секілді  гормон рецепторларының екі типі бар екені белгілі болды. Рецепторлардың бірінші типіне цитоплазмалық және ядролық локализацияның ерігіш белоктары жатады, олар гормондармен байланысқа түсіп, гормон рецепторлық комплекс түзеді. Екінші типтің рецепторлары мембранада жинақталған, сонымен бірге, гормонмен мембрананың сыртқы бетінде орналасқан рецептор домені әсерлеседі. Гормон — рецепторлық   әсерлесуінің нәтижесінде, белок – рецепторындағы  конформациялық өзгерістер, екіншілік сарапшылардың түзілуін шақыратын, G – белок арқылы ферменттердің біреуіне (мысалы: фосфолипазалар, аденилатциклазалар) берілетін спецификалық сигналды индукциялайды. Нәтижесінде  клеткада амплификацияға және әртүрлі клеткалық құрылымдарға берілуіне әкелетін екіншілік сигналды молекулалар пайда болады. Екіншілік сарапшыларға  сАМФ молекулалары, инозитол үш фосфат, және басқа да мембрана липидтерінің  жатады. Олардың кейбіреулері клетка метаболизмін өзгертумен қатар ондағы  ферментерді, құрылымдық белоктарды модификациялайтын протеинкиназаларды немесе протеинфосфотазаларды белсендіреді. Көп жағдайда сигналды тапсыруда Са²⁺ қатысады, ол клеткаға әсер еткен кезінде құрамын өзгертіп отырады. Бұл жағдайда кальций мембрананың  сыртқы бетінде гормон молекуласымен  рецепторды байланыстыру арқылы  индукцияланған соң өзгерістердің өсуіне қатысады. Бірінші және екінші типтің рецепторлары цитокининдердің сигнальды трансдукциясына қатысады [25,26].

    Фитогормондардың рецепторларын іздеуде екі маңызды бағыт болды:

1. In vitro жүйесінде біріншілік гормональды жауаптардың ұдайы өндірілуі.
2. Шашыраңқы гормондарды спецификалық түрде байланыстыратын белоктарды іздеу. Дегенмен бірінші бағыттың дамуы күрделі болып шықты, ал тәжірибелердің нәтижелері аз өндірілетіндікке және қайшылыққа әкеліп соқтырды. Екінші бағыттың нәтижелері үлкен табыстарға, жетістіктерге жетті – онда фитогормондардың рецепторлары болатындығын, соның ішінде цитокининдер бар өсімдіктерде көптеген белоктар табылды [27].

 

1.3 Цитокинин медиаторының өсімдік морфогенезіне  әсері

Фитогормондар — өсiмдiктердің өсуiн реттегiштер. Өте аз мөлшерде болса да жоғары сатыдағы өсiмдiктердiң зат алмасу процессiне әсер ететiн табиғи және синтетикалық органикалық қосылыстар тобы. Осы реттегiштердiң әсерiнен өсiмдiктердiң өсуi және дамуы бiршама өзгерiстерге ұшырайды.

Табиғи реттегiштер бiзге фитогормондар ретiнде белгiлi. Фитогормондардың көмегiмен клеткаларда, ұлпалар мен органдарда физиологиялық және морфологиялық бағдарламалар реттелiп iске қосылады. өсiмдiктер гормоны — әртүрлi органдар мен ұлпаларда түзiлетiн органикалық заттар.Олардың химиялық құрамы және физиологиялық әсерi әр алуан. Фитогормондар өсiмдiктердiң өздерiнiң өнiмi бола тұра мүше түзу процестерiн анықтауға және метаболизм процессiн реттеуге қатысады.Морфогенетикалық және физиологиялық бағдарламалардың iске қосылуы немесе iстен шығарылуы фитогормондар мөлшерiнiң ара қатынасының  өзгеруiмен жүргiзiледi [28].

 Өсiмдiк гормондарын негiзгi бес топқа жiктейдi: ауксиндер, гибберелиндер, цитокининдер, абсциз қышқылы және этилен. Қазiргi кезде

фитогормондардың өзiндiк әсерiн мәлiмдейтiн көптеген деректер бар. Әрбiр фитогормонның физиологиялық активтiлiгi жоғары және арнайы әсер етедi. Жалпылама айтатын болсақ: цитокининдер клетканың бөлiнуiне, ауксиндер мен   гиббереллиндер клетка мөлшерiнiң ұлғаюы мен жiктелуiне, абсциз қышқылы тыныштық күйге,этилен жемiстiң пiсiп жетiлуiне әсер етедi.

    Фитогормондардың басты белгiсi — өсiмдiк бойында жылжи алу қабiлеттiлiгi. Гормондық жүйе барлық мүшелерiн iске қосатын заңды бiрiздiлiк жеке даму сатысымен сәйкестендiрiлген. Өсiмдiк организмiнiң функционалды бiртұтастығын қамтамассыз етедi. 

In vitro жағдайында морфогенез процесi мен регенерацияға фитогормондар мен химиялық өсу реттегiштерiнiң әсерi жөнiнде әдебиеттерде көптеген мәлiметтер бар. Қоректiк ортаның құрамына қосымша гормондар енгiзу арқылы морфогенез процесiнiң жолдарын реттеуге болады. Скуг пен Миллердiң тәжiрибесiндегi көрсетiлгендей ауксин мен цитокининнiң мөлшерлiк ара қатынасын өзгерте отырып, морфогенез типiн анықтауға болады. Осы гормондар концентрациясын өзгерту арқылы регенерациялық қабiлетi жоғары немесе төмен каллустар алуға болады.  Цитокинин концентрациясы ауксиннен басым болғанда бүршiктер мен сабақтар түзiлген, ал керiсiнше жағдайда тамыр түзiлуіне әкелiп соққан, екi гормонның концентрациясы шамалас болғанда ұйымдаспаған каллустар өскен. Гормондар мөлшерiн өзгерту арқылы жүргiзiлген зерттеулер көрсеткендей жасанды ортада өсiрiлген ұлпалардан сабақ бүршiктердiң түзiлуi каллус ұлпаларының гормондарының концентрациясының физиологиялық және диффузиялық градиентiнiң өзгеруiмен байланысты екен  [29].

    Экзогенді цитокининнің байланысына қатысты клетка ішілік домендердің екі жағына қарай шектелді. Бұл жағдай гистидинкиназалар, С-соңындағы рецепторда локализденген, цитокинин домендегі оның транслиттері нәтижесінде консервативті фосфориленеді гистидинді қалдық (His 459)  транслиттері доменнің келесіге берілуін аспарагин қышқылы (receiver) қабылдайды. Сол  рецептордың домені, жауапты реттеуде (receiver regulator)  ол сигнал клетка ішілік процеске беріледі. Рецептордың мұндай функциясы оның негізгі  амин қышқылдырының жұмыстарымен  басқа жақсы зерттелінген бактериялар мен ашытқылар жүйелерімен сипатталынады. Гибридті гистидинді киназада SLN 1 осы геноммен қалыпта кодталды ішкі сигналға  активтенеді және клеткада фосфатты каскадтармен қамтамасыз етеді, белгілі ашытқылардың штамдары галактозасыз ортада  тірі қалуы үшін қажет. Жарақаттанған  мутантта   бұл галактоза  жеткілікті жағдайда клеткаларды өлімге әкеледі. Sln 1Δ мутантының трансформациясы  цитокиинин рецепторы  CRE1 мутанттарының летальдылығын цитокининнің басшылығымен бекітті. Егер ортаға цитокининді қосса, мутант галактозасыз ортада  қалыпты өсу қасиетін қалыптастырған осындай цитокинин ашытқы клеткаларында  гистидинді протеинкиназаны CRE1  активтендіреді, сенсорлы киназа SLN1-ді зақымдалғанын ескереді және ол сигнальды тізбек бойынша фосфадты топтардың берілуіне әкеледі, ортада галактозаның кездесуінде  клеткалардың тірі қалуына жағдай туғызады. Мутанттардың тіршілік етуін қалыптастыру  қоректік ортаға  транс-зеатинді, изопентиниладенинді, 6-БАП-ты жәнеде дифенилмочевинаның  цитокининді активтілікті  тидиазуронаның  қосылуына әкеледі. Бұл тидиазурон CRE1 –ді қолдану қасиеті цитокининнің рецепторы ретінде, пуридиндік қатар тәріздес  фосфорилдік сигнальдық тізбек. Осымен қатар қос зеатин  активсіз транс зеатинді  аналогын ұсынады, галактозасыз ортада  Sln 1Δ  мутанты тіршілік ету қабілетін көрсетпеген. Содан соң физиологиялық  активті цитокининдер  ашытқы клеткаларында  CRE1  гистидинді киназаны активтендіреді, фосфатты топтардың тіршілік етуіне қажетті  галактозалардың қатысында белгілі мутант өткізу тізбегін   қосты. Консервативті гистидинді немесе аспарагин қышқылына қарай CRE1 геніндегі мутация, фосфатты топтың берілуіне  қатысатын, CRE1 белогын инактивирледі   және ашытқы тіршілігін ұстай алмайтын Sln 1Δ   берді. Осындайдан  ашытқы клеткаларында   CRE1 цитокининге тәуелді  гистидинді киназа функционирледі. CRE1 және A. Thaliana  клеткасында цитокининге тәуелді протеинкиназаны қамтамасыз етеді.  Ескеретіндігіміз crel-1 арабидосис мутантты CRE1 жарақаттанған генімен цитокининнің клеткасының және өркеннің дифференциациялануы  индукциясына жауап береді,  каллустардың жасылдануы  қажеттілікті белгілеген жөн, CRE1-дің үлкен генінің экспрессиясы тамырда анықталды. Ескерілгендей цитокинин  мембраналық рецепторы  япониядағы екі лабораторияда бір мезгілде бөлініп алынды. Ueguchi және басқалар[30,31] .  A. Thaliana-дан  сенсорлы гистидинкиназаның  3 генін бөліп алды: АНК2, АНК3 және АНК4 қолдануға тиісті  1176,1036 және 1080 амин қышқылының қалдықтарынан тұрады. Олардың әрбірі гибридті  гистидинді киназаны  инвариантты  гистидинді қалдықтарымен  трансмиттерлі сенсорлы домендегі  молекула бөлігіндегі және инвариантты  аспарагин қышқылы қалдықтарымен фосфатты  домендарды қабылдайды. N-соңындағы шектелген трансмембраналы домендерде анықталынды және олармен шектелген  клеткасыртындағы  консервативті сегменттер. Олардың әрбірі  сыртқы сигнальдарды қолдана алады. Мутантты ашытқылардың АНК3 геномдарының трансформациясы дәлелденді,  олар функциональды активті гистидинді киназаны кодтайды. Фосфатты топқа гистидинді және аспарагинді  қалдықтарымен берілуін қамтамасыз етеді. Мутантты ашытқы клеткаларында өздерінің осмосенсорлы гистидинді киназаларынан айрылған. Осы лабораторияда  сенсорлы гистидинді киназа   A. Thaliana АНК4 тің  цитокининге тәуелді фосфатты топтың берілуін E.coli клеткаларындағы АНК4  трансформацияланған  геномындағы фосфаттың қатары сигнал бойынша берілуін қалыптастыра алады. Осыдан цитокининнің  мембраналық рецепторы CRE1/АНК4 реттегіш тізбектерінде ашытқы және бактерия клеткаларында  тұруын және цитокининге тәуелді сигнальды фосфатты топтың берілуін орындайды.

    CRE1/АНК4 өсімдік клеткасындағы серіктерінің рецепторлы молекулаларының сигнальдық берілуі әзірше белгісіз. Мынаны ескерген жөн, ашытқы клеткаларында фосфатты  топтары рецепторлы  гистидинді киназамен фосфотрансмиттерге беріледі. Гистидинді фосфатты  тобы бар олардан сигнал соңғы нысанаға келіп түседі, бұлардан  тарнскрипция факторы  генетикалық бағдарламаларды қосып, өшірумен қамтамасыз ететін болуы мүмкін. Бұл байланыстан  A. Thaliana – дан АНР1-АНР5 – тің фосфотрансмиттерін кодтайтын 5 ген анықталды [32,33]. Олардың кейбіреулерінің (АНР1-АНР2)  цитоплазматикалық локализациясы бар, бірақ цитокинин олардың  ядроға орналасқанын дұрыс көреді. Кейін олар клеткадағы  цитокининдік сигналдың берілуіне қатысады. Бұның бәрі өсімдік клеткасында цитокинин мембраналық рецептордың фосфорланған каскада енуіне  рұқсат етеді, генетикалық  бағдарламаның өшуіне әкелетін осындай мутанттар, экзогенді  цитокининге жауап бермегені Corinne және оның қызметкерлерінен алынды.

    Гистидинді протеинкиназаны бөлшекті зерттеу онда екі доменнің бірі сигнальды  қабылдау домені, екіншісі іске асыратын доменнің бар болуын көрсетті .

    Аминқышқылды негізді цитокининді байланыстырғыш доменмен көптеген белоктарда және эукариоттарда негізгі мағыналы CHASE (cyclases/histidine kinases – associated sensory extracellular) анықталынды. Сонымен қатар анықталғандай  CRE1 ген WOL (WOODENLEG) генге ол өзектік жүйелердің қалыптасуына  және A. Thaliana-ның АНК4 гистидинкиназа гені цитокининнің мембраналық  рецепторы ретінде бөлінді.  WOI   мутанты цитокининді байланыстырушы доменді CHASE белоктарында бір амин қышқылымен алмасады.   His – белок    Wol – мутант клеткаларымен синтезделетін цитокининді байланыстырушы қасиетіне ие болмаған. Осындай мутациялы  өсімдік клеткаларды түзе алмаған ксилема алғы заттарды, яғни олар өсімдіктердің  жер үсті бөлігін түзбеген, олар тек тамырда түзген РНК ның  анализін көресетті, белоктың  Wol мутациясымен  жүретін синтезі тек тамырда жүреді. Клетка топтары немесе кейбір мүшелерде фитогормондар түзілуімен сипатталады. Сондықтан фитогормондардың мөлшерінің реттелуі тек интенсивті  синтездей бермеуінің үлкен маңызы бар, бірақ араласуымен сипатталады. Акусинді биосинтездеу орны ұштық және жас жапырақ болып табылады, одан ол өсімдіктердің төменінде орналасқан білігіне полярлы  транспорт жолымен түседі. Өсімдіктерде цитокининдер тамырда түзіліп, өсімдіктердің жоғары бөлігіне өтеді. Осындай оның тұтас өсімдіктердегі  транспорты өсімдіктердің  жерасты мүшесінде синтезделіп ксилема арқылы  қозғалып жер үстіне өтетін заттар сияқты жүреді.

  Өсімдіктердің сабағында екі қарама – қарсы бағытты ағыс болады: базипетальды ауксин және акропетальды цитокинин. Осы ағыстар сабақтардың түрлі бөліктерінде  фитогормондардың қатынасы бірдей емес. Фитогормондар заттар қатарының орналасуын өзгертеді: қанттар, N,Ф, және т.б. Кинетиннің жиналуы және олардың концентрациясы жылдамдыққа әсер етпейді, бірақ түрлі бағыттарда клеткалардың дифференциация типтеріне әсер етеді.

    Соңғы уақыттарда хлоропластағы цитокининдер жолының жолақтары кездеседі, және де  цитокининді байланыстырғыш белок, хлоропласт жүйесінің транскрипциялық арнайы реттелуі өсімдіктердің азотпен қоректенуіне әсер етеді. Барлық осы мәселелер соңғы уақыттары  туындаған еді.

    Барлық цитокинин байланыстырушы белоктар  тамыр клеткасында локализденген. Олар өздерінің функцияларын іске асырады. Осы уақыттың өзінде мүше нысананың цитокининмен байланысуы  тамыр емес, өсімдіктердің жер үсті мүшесі болып табылатындығын, алғаш рет 1998 жылы Sakakibara  жұмыстарында  көрсеткен еді [34,35] . Жүгерінің кесілген жапырағында ZmCip1 ген экспрессиясы транс-зеатинді индуцирлейді. 10^-9 дан 10^-7 М – ге  дейінгі транс – зеатиннің  жоғарылауымен жапырақтағы жапырақты цитокининмен өңдегеннен 30 минуттан  кейін ген экспресисы анықталды және цитоплазмадағы 80 S рибосомадағы рибосомалардағы белоктар синтезінің ингибиторы – циклогексимидпен төмендетеді. Клеткада цитокининнің   ZmCip1 генінің қосылуына қажетті транскрипция факторы және цитокининдік сигнальды қабылдайтынжүйесі бар.  ZmCip1 ген цитокининнің алғашқы жауабының гендеріне жатады. Белокты кодтайтын  ген құрылымынан бөлінген амин қышқылдары құрылымдары бактерияларда биокомпоненттік регуляторлы жүйесінің реттеу жауабының туысына жатады және олар үшін аспартат қышқылының  бактерияға жауабы фосфатты топ фосфорилденген гистидиннен сенсорлы гистидинкиназаға тасымалданады. Sakakibara жұмыстарында өсімдіктердің азоттық қоректенуінің  ZmCip1 генінің экспрессиясына әсері туралы маңызды мәліметтер алынды. Тағы да 1998 ж. Brandstater және  Kieber  цитокининнің A. Thaliana – дағы бактериялардың биокомпонентті реттеуші жүйесінің реттеуші жауап геномына  сәйкес гендердің экспрессиясын индуцирлейтіндігін тапты. A. Thaliana жапырақтарын  алдын-ала циклогексимидпен өңдесе, осы гендердің экспрессиясын ингибирлеген жоқ, және соған орай бұл өсімдіктерде бұларды цитокининге біріншілік жауап гендеріне жатқызуға болатындығын осы авторлар көрсеткен болатын.  A. Thaliana – ғы реттеуге жауап гендері АRR деп аталды. Зерттеу нәтижелерінде бірқатар авторлар  Arabidopsis – те  АRR гендерінің үлкен екі түрі бар екендігін (22 өкілі) 10 А тобының гендері  және 12 В тобының гендері  болып екі топқа бөлінеді. Олар құрылысы бойынша және реттелуі бойынша ерекшеленеді. Цитокинин тек А тобының гендерін индуцирлейді. А тобына АRR типті 10 гендер жатады. A. Thaliana-ның этиолирленген өскіндерінде АRR4 және АRR5 гендерін цитокининмен экспрессия индукциясында лаг кезең 10 минутты құрайды, жоғары экспрессия  30-60 минутттан кейін байқалады және тез төмендеді. Бұл жүйедегі дәлелдер тағы да  алынды. АRR4 және АRR5 цитокининге жауаптың біріншілік гендеріне жатады. БАП (5 мкМ)   АRR6 және АRR7 гендерінің тамырдағы, сабақтағы, гүлдегі, жапырақтағы экспрессиясын жоғарылатады.

    Маңызды    ақпараттар «run – on»  сынақтарынан алынды,  A. Thaliana-ның  жапырақтарын өңдеді, кейін олардың ядроларынан бөліп алып  және асқын    м РНК-ң синетезін анализдеді. Мұндай тәжірибелерден бөлініп алынған  ядроларда  РНК молекулаларының элонгациясы жүреді. Осы жолмен тағы дәлелденді: Цитокинин А тобындағы гендер транскрипциясын  5 минуттан кейін  активтендіреді. 10 минуттан кейін синтез  максимумға жетеді және тез төмендейді. Бұл тәжірибелер цитокининнің әсері транскрипционды  деңгейде жүзеге асатының дәлелі. Аталып өткендей, АRR типті белоктар, А және Р топтарының консервативті қабылдаушы домендері бар, оған тән аспарагин қышқылының қалдығымен ол рететгіш белоктарда бактерия жауаптарын  фосфатты топты сенсорлы гистидинкиназамен гистидиннен қабылдайды. АRR белоктарының А және В тобындағы ерекшеліктері молекуласының С-соңы бойынша байқалады. Ол қысқа (100 амин қышқылдарының қалдықтары) А-тобында, ал В тобында ұзын (500 амин қышқылдарының қалдықтарына дейін) Осы бөлімді қорытындылай келе: цитокининді байланыстырушы және гендер экспрессиясын бастайтын өте маңызды реттеуші белоктар табылса да, циткокининдердің сигнальдық трансдукциясында көптеген түсініксіз мәселелер туындауда. Бірінші орында, оның екіншілік гормоны – медиаторға байланысты.

 

1.4 Цитокининнің медиаторлары

 

Сигнальды трансдукция  жайлы пікірлерге сүйенетін болсақ цитокининнің өсімдік тұқымына әсері кезінде  азот ассимляциясына қатысатын, мысалы спецификалық НАДФ- глутаматдегидрогеназа тәрізді ферменттердің өсу процесіне  және метоболизм белсенділігіне әкелетін, ұрықтан шыққаннан кейін алейрон қабатына әсер ететін екіншілік гормон медиаторының синтезі басталады  [36].

     Қазіргі уақытта осы өсімдік  тұқымында синтезделетін екіншілік гормон, саңырауқұлақтардан бөлініп алынған фузикокцинге ұқсас болып келеді. Себебі фузикокцин цитокининнің екіншілік гормоны тәрізді метаболизм және өсу ферменттерінің активациясын шақырды. Кейінірек олардың бірі рецептор үшін бәкелестік қатынас болатындығы және бірдей реакция шақыратындығы туралы пікірлер дәлелденді. Нәтижесінде клетка мембраналарында  екіншілік медиаторларды байланыстыратын фузикокцин-байланыстырушы рецепторлар табылды. Цитокининдер тұқымға әсер еткен соң, оларда фузикокцинмен сәйкес келетін екіншілік гормонның пайда болуы жүреді. Кейінірек бұл медиатордың клетка ішілік кальций деңгейінің жоғарылауын тудыратындығы дәләлденді, нәтижесінде, түскен сигналдың әсерінен фосфорлануға жолымен жауап беретін С протеинкиназаның белсенділігі артады [37]. 

 

1.5 Цитокинин синтездеуші ген трансформациясы

 

Цитокинин өсімдік гормондарының маңызды бір тобы.олар кілетканың бөлінуін  жеделдетеді. Цитокинин молекуласының қаңқасы рибоза мен адениннен құралған аденозин. Адениннің азотты тобында бір изо пентенил тармақ тобы бар. Тармақ топтың гликолизациясы цитокининнің активтілігін төмендетеді. Арабидопсис амр1 мутанты бос цитокининді жинайды, ондағы себеп цитокининнің гликозилациялануында кемістіктер болуы мүмкін.

1. A. tumefaciens өсімдікке инфекцияланғаннан кейін, клетка ретсіз бөлініп нәтижесінде патша тәжісі (crown gall tissue ) қалыптасады, себебі; агробактерияның ti плазмидасындасындағы t- Dna аумағында ipt, iaah, iaam гендерінің болуында, t-dna өсімдік клеткасының хромосома dna –на орналасқан соң ipt, iaah және iaam гендерінен экспрессияланған белоктар цитокинин мен ауксинді көптеп түзіп өсімдік клеткасының шектен тыс ретсіз бөлінуіне әкеліп соғады. ipt iaah, iaam гендерінің промоторлары эвкариоттық , сондықтан өсімдік клеткасында активті бола алады. ipt гені изопентенил трансферазаны кодтайды, ipt гені экспресясы N⁶-(∆²-изопентенил) аденозин 5^‘— фосфат ([9R-5’P] ip)ң синтезделуімен байланысты. N⁶-(∆²-изопентенил ) аденозин 5^‘-фосфат тез арада өсімдік транс-гидроксилазасының әсерінде 9-рибоза зеатин 5^‘-фосфат( [9R-5’P)2]-қа айналады. 9 — рибозазеатин5′-фосфат өте күшті цитокинин болып табылады ,тетрациклинге тәуелді кинетин болып табылады. Тетрациклинге тәуелді 35S промотормен бақыланған ipt гені трансформацияланған темекі өсімдігінің ұлпалары мен мүшелерін тетрациклинмен өңдеп, ipt генін активтендірген соң, ішінара кейбір бөліктерінің цитокинин мөлшері 50 есеге артқан, бұл қосалқы бүршіктерінің өсуін күшейтеді. Жемістің арнаулы 2А11 промоторымен бақыланған ipt гені трансформацияланған помидордың қартаю мерізімі ұзарған, жемістің қызыл бөлігіндегі цитокининнің мөлшері жасыл бөлігімен салыстырғанда 6 есе көп болады [38].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. ТӘЖІРИБЕЛІК БӨЛІМ

 

2.1. Материалдар мен  зерттеу әдістері

 

  Цитокинин медиаторын бөліп алу және зерттеу үшін зерттеу обьектісі ретінде қолданылған материалдар: жұмсақ бидай өсімдігінің (Triticum aеstivum) «Арай», «Стекловидная-24», «Саратовская-29», «Казахстанская-10», «Надежда»,  күріштің «Ақ маржан» ( Oryzae sativa) сортының дәні мен өскіндері алынды, фасольдың (Phaseolus vulgaris) айлық өскіндері, бөлме өсімдігі  Impatiens balsamina, қалемшелер алынды.

  Температурасы 20⁰С термостатта  стерильді жағдайда тұтқыр қағазы салынған Петри табақшасында дәндер өсірілді. Бидайдың, асбұршақтың  өскіндері таза ағынды суда 1-2 аптаға өсірілді.

 «Қазақстан-10» сортты бидай және осы сорттың  тозаңқабынан in vitro жағдайында алынған әр түрлi типтi каллустар: морфогендi емес, ризогендi, геммогендi каллустар алынды. 

Цитокинин медиаторын бөліп алып зерттеу   барысында  төмендегідей әдістерді пайдаландық; Центрифугалау, экстракциялау және цитокинин медиаторын бөліп алу, тазарту әдістері, инкубация жасау,иньекция   жасау, гомогенизациялау.  Аталық тозаңқапты in vitro жағдайында өсiру

Аталық тозаңқабы алынатын бидай өсiмдiгiнен түптену кезеңiнде өркенiнiн кесiп алып,суда мұздатқышта сақтадық. Бидай 3-5 күн 5-7 градус суықта ұсталынды.Бидай масағын өзегiнен 1-2 см төменiрек  кесiп алып, жалауша жапырағы мен масақтың жоғарғы жағын алып тастадық, оны 70% этил спиртiмен 3-4 мин залалсыздандырып және де басқа қоспалармен натрий гипохлоридi, кальций гипохлоридi, диацид ерiтiндiлерiмен өңдедік.. Этанолдан басқа агенттермен өңделген масақты бiрнеше  қайтара дистильденген сумен жуу керек. Бидай тозаңқабын — эксплантты in vitro  жағдайында өсiру кезінде, каллус түзiлу үшiн экспланттар отырғызылған пробиркалар 25 градус қараңғы термостатқа  қойылды. Төрт апта уақыт өткен соң каллустардың қарқыды түзiлуi байқалды. Олардың арасында эмбриоидтар да  пайда болды. Бұл эмбриоидтар құрамында гормон қосылмаған Мурасиге мен Скуг ( MS) қоректiк ортасына көшiрiлдi. [37]. Сонымен қатар түзiлген каллустарды да құрамына өзгерiстер енгiзiлген MS қоректiк ортасына көшiрiлдi. Қоректiк орта 30 мин 0,8 атм температурасы 120 ⁰ С- да автоклавта өңдеуден өттi. Осы қоректiк орта залалсызданған ломинар бокста пробиркаларға 5мл мөлшерден құйылды. Каллустар климаттық камерада қараңғыда 27 ⁰ С -да температурада, 50 % ылғалды ортада өсiрiлдi. 4 апта уақыт өткен соң, каллустарда морфологиялық өзгерiстер байқалды, осы каллустар құрамы өзгертiлмеген қоректiк ортаға көшiрiлдi. Алынған каллустардың бiр бөлiгi биохимиялық зерттеуге пайдаланылды.

Мурасиге мен Скуг қоректiк ортасын пайдаландық.                                                          

 

2.2 Нәтижелер және оларды талдау

 

Сұлтанбаев және оның авторластары  цитокинин құрамын зерттемеді, оны зерттеудің қажеттілігі туындады. Цитокинин медиаторын зерттеу үшін тазартудың тиімді әдісін қарастыру қажет болды. Біздің  цитокинин медиаторын  тазартудың әдістері Сұлтанбаевтың әдістерінің негізінде жасалынды.  Бізідің жасаған әдісіміздің басты ерекшелігі сол алғаш рет цитокинин медиаторын жоғары дәрежеде тазартатын кері фазалы  хромотографиясы типті  бағаналы колонкасы еді, бұнымен біз басқа фитогормондармен ластанбаған цитокинин медиаторының препараттарын алуға қол жеткіздік 2 -сурет. Цитокинин медиаторын тазартудағы біз жасаған жүйе төмендегідей сатылардан өтеді: гомогенизация, центрифугалау,

    Ең алдымен біздің тазартылған биореттегіш препаратында   цитокинин немесе ауксин  қоспаларының бар жоғын анықтауға тура келді  сол мәселені шешу үшін  қазіргі заманға сай INXA-X-Ray analytical system  элементтердің ренгтген анализаторын қолдандық. Осы анализатор арқылы  құрамында қандай элементтер бары анықталынады. Біз өткізген биореттегіш препаратын рентген анализатормен зерттегенде осындай нәтижелерге жеттік. Құрамына кіретін тек қана  С 72,67 мен О 21,09 бар екендігі анықталды. Ешқандай азоттың ізі жоқ екендігі дәлелденді 3 — сурет. Ескерту: сутегіні рентген анализаторы анықтамайды. Осы құрамын анықтау арқылы келесі қорытындыға келуге болады. Элементтік құрамы бойынша тазартылған биореттегіш тек қана фузикокцинге жақындығын көрсетеді.Ең алдымен біздің препаратымызда цитокинин мен ауксин жоқ екендігі анық дәлелденді себебі олардың құрамына азот кіреді. Тазартылған препараттың  ультракүлгіндегі толқын ұзындығын Ultrospec 1100 pro Amersham Biosciences (Великобритания) спектрофотометрінен өткіздік. Нәтижесі 3-суретте берілген.

  3-Суреттен көргеніміздей сипатталған шыңдарда ауксин мен цитокиннің жоқтығына көз жеткіземіз.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2-сурет Кері фазалы хроматографиясы арқылы цитокинин медиаторын  бөліп алу

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3-сурет INXA-X-Ray analytical system  элементтердің ренгтген анализаторы

 

Енді  биопрепарат цитокинин мен ауксиннің жоқтығы дәлелденгеннен кейін біздің биореттегіштің нағыз морфогенездік қасиеттерін анықтауға жол ашылды.

Цитокинин әсерінің ерекшелігі апикальды доминантты тежейтін қасиеті бар екені белгілі.  Егер біз өсімдік сабақтарының ең жоғары бүршігін алып тастасақ, тек қана цитокинин әсерінен жаңа сабақтар мен жапырақтардың өсетінін байқаймыз. Басқаша айтқанда  осы жағдайда цитокининнің морфогенезге әсері анық байқалады. Осыған орай біздің медиатордың  осындай әсері бар ма екендігін анықтау керектігі сөзсіз. Сортқа жатпайтын үрмебұршақтың 4 апталық өскінінің апикальды доминирленуіне цитокинин медиаторы мен 6-БАП әсері. а – бақылау, гормонның әсерінсіз, б – (100 нг/мл) цитокинин медиаторымен өңделген декапитирленген сабақ, в – (23 мкг/мл) 6-БАП цитокининмен өңделген декапитирленген сабақ. Сабақ пен жапырақтарының қолтық бүршіктерінің  өсуіне  цитокинин медиаторының әсері сызықшамен көрсетілген. Нәтижесі 4-суретте көрсетілген.

Зерттеу үшін әр үйде өсетін әбден дамыған  «Impatiens balsamina» өсімдігін  және үрмебұршақ өсімдіктерін алдық.  Жақсы дамыған сабақтарының ұшындағы бүршігін кесіп тастадық және 0.1 мкг медиаторы бар ерітіндіден сабақтарды ылғалдандырылған паралонмен сүрттік. Осы әсерден жарты ай ішінде  жақсы дамыған  сабақтар мен жапырақтардың пайда болғанын көреміз.  Ал   цитокинин бензиламинопурин (6-БАП)  әсерімен 23 мкг/мл бар ерітіндімен сол операцияны жасағанымызда жарты ай ішінде  әрең дамыған  бүршіктерді көреміз. Нәтижесін 3-суреттен көруге болады.Осы  жүргізілген тәжірибеден келесі қорытындыға келуге болады. Медиатор цитокининге қарағанда  100 – 200 есе мөлшерде 2-3 есе морфогенезге әкелетіндігі анық.  Сол себептен цитокинин медиаторы ең алдымен медиатордың пайда болуына әкеледі, одан ары қарай медиатор өз әсерін жасайды. Қорыта айтқанда өсімдіктердегі морфогенез әсерін  цитокинин емес медиатор атқара алады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

а) 4 апталық декапитирленген өсімдік, бақылау

б) 4 апталық декапитирленген өсімдіктің, қолтық бүршіктері цитокинин медиаторымен өңделген

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

в) 4 апталық декапитирленген өсімдік бүршіктері 6-БАП өңделген

 

 

 

 

  4 — сурет Сортқа жатпайтын үрмебұршақтың 4 апталық өскінінің апикальды доминирленуіне цитокинин медиаторы мен 6-БАП әсер етеді.

 

«Impatiens balsamina» өсімдігі сабағының апикальды доминантылығына  6 — БАП пен цитокинин медиаторының әсері. 1-бақылау, сабақтың жоғарғы бүршігі кесілген. 2- тәжірибе, жоғары бүршігі кесілген сабақты күнделікті 6 — БАП  (23 мкг/мл) өңдейміз. 3 —  жоғарғы бүршігі кесілген сабақты 0.1 мкг медиатормен өңдейміз.                                    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1-бақылау, сабақтың жоғарғы бүршігі кесілген. 2- тәжірибе, жоғары бүршігі кесілген сабақты күнделікті 6 — БАП  (23 мкг/мл) өңдейміз. 3 —  жоғарғы бүршігі кесілген сабақты 0.1 мкг медиатормен өңдейміз.                                   

 

5 – cурет «Impatiens balsamina» өсімдігі сабағының апикальды доминантылығына  6 — БАП пен цитокинин медиаторының әсері

 

Өсімдіктердің тұзға төзімділігін арттыру мақсатында төмендегідей тәжірибе қойылды.  «Саратовская – 29» бидай сортының  бидай дәнінен 50 гр алып, оны сабынды сумен жуып 10 минутқа қойдық, содан соң КМnO₄ – тен 3-4 тамшы түсі қызғылтанғанша тамызып 15 минутқа қойдық, Осы қойылған уақыт өткеннен кейін жуылып тазартылған бидай дәнін 4 ыдысқа бөліп салып 1 нұсқасының үстіне 2% NaCI – дың ерітіндісін құйып, 2 нұсқаға 5 н/гр биореттегіш дайындап алып, осы дайындалған ерітіндіні құйдық, 3 нұсқаға 50 н/гр қатынасында биореттегіш дайындап алып, осы дайындалған ерітіндіні құйдық, 4 нұсқаға тазартылған су құйып, 3 сағат көлемінде бөктіріп қоямыз. Осы белгіленген уақыт аралығы өткен соң, әрбір жеке нұсқалардың суын төгіп, оларды тұтқыр қағазымен кептірдік. Содан соң 30 дәннен алып Петри табақшасындағы тұтқыр қағазының үстіне орналастырдық. Орналастырып болған соң бірінші  нұсқаға 2%  NaCI, екінші нұсқаға 2%  NaCI+ 5 нг/мл биореттегіш, үшінші нұсқаға 2%  NaCI + 50 нг/мл биореттегіш, 4 нұсқаға тек қана су құйып, тәжірибені бақылауға алдық. Бақылауға алынған тәжірибе нәтижесінде 2% NaCI + 5 нг/мл есе биореттегіш қосылған нұсқадағы бидайлармен тек қана су қосылған нұсқадағы бидайлардың өскенін көрдік. Осы алынған нәтижені 6 — суреттен көресіз. Осы суретте олардың сабақтары мен тамырларының өсуін биореттегіштің реттейтіндігі көрініп тұр.

Ал дамыған өсімдіктер сабағы мен тамыры бар өсімдіктер  тұзды стреске шыдап өсе береді. Сонымен біз зерттеуге алынған жаңа биореттегіштің тағы да бір қырынан аштық.

Өсімдіктердің тұзға төзімділігін арттырып қана қоймай олардың тамырлары мен сабақтарының дамуын реттейтіндігінде. Осыған ұқсас тәжірибе бірнеше рет қайталанды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

а) бақылау  2% NaCI                                      б) 2% NaCI + 5 нг/мл ЦМ

 

 

в) 2% NaCI + 50 нг/мл  ЦМ                                   г) Су

Cурет 6 — «Саратовская – 29» бидай сортының тұзға төзімділігін арттыруға  цитокинин медиаторының  әсері

 

Тұзды стресске бидайдың төзімділігін анықтау үшін бидайдың төзімді және төзімсіздігі бойынша ерекшеленетін бидайдың 3 сортын қарастырдық  нәтижелері 1-ші кестеде көрсетілген.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 кесте – Цитокинин медиаторы  бар орталарда өсірілген бидай дәндерінің  өсу көрсеткіші

Бидай сорттары	2 % NaCI	2% NaCI+ЦМ	Тұзданудағы өскіндердің өсуі % есебімен
Надежда	132±1,2	180±2,0	112
Қазақстан-10	109±0,8	142±2,2	129
Толқын	76±2,0	102±1,6	134

 

Осы кесте келтірілген нәтижелерден Толқын сортының өсу көрсеткіші  бойынша да Надежда мен Қазақстан-10 қарағанда төмен екені анық көрсетілген. Сонымен бірге, біз жаңа биореттегіш қосылған ортадағы бидай дәндерінің жақсы өнгенін көруге болады. Негізінен қалыпты жағдайға қарағанда жаңа биореттегіші бар ортадағы бидайлардың ары қарай дамуына да мүмкіндігі бар, себебі осы биореттегіш клеткадағы метаболизмді тездетіп, маңызды зат алмасуды іске қосады.  Зерттеуге алынған бидай сорттарының тұзды ортада өсуін бақылаған едік нәтижелері 2-кестеде көрсетілген.

2 кесте — 2% NaCl тұзы бар ортада өсірілген сорттардың биомассалық көрсеткіші

Бидай сорттары	Бидай өскіндерінің биомассасы	% есебімен
Вариант
Қазақстан-10  Н2О	3,995±0,06	100%
2%NaCl	1,507±0,07	43%
Арай  Н2О	3,287±0,019	100%
2%NaCl	1,103±0,06	33%
Дауыл  Н2О	3,461±0,01	100%
2%NaCl	1,486±0,09	38%

Осы келтірілген нәтижелерге қарағанда 2%NaCl тұздарында өскен Қазақстан — 10, Арай, Дауыл бидай сорттарының тұздарға төзімділігі әртүрлі болып келген. Мысалы: Қазақстан — 10 сортының 2%NaCl тұзында өскен өскіннің биомассасы бақылаумен салыстырғанда 43% — ке  төмендеген. Ал Дауыл сорты Қазақстан-10 сортымен салыстырғанда аса айырмашылық байқалмады. Тек Арай сортында Қазақстан — 10 сортымен салыстырғанда үлкен айырмашылық бар. Себебі мұнда 2% NaCl-да өскен өскіннің биомассасын бақылаумен салыстарса 33% — ке байқалған. Бұл нәтижеден  Қазақстан — 10 сорты төзімді, Арай сорты төзімсіз болды. Мәліметтер бойынша цитокинин медиаторы  қосылған 2% NaCl тұзды орталарға өскен Қазақстан-10, Арай, Дауыл бидай сорттарының биомассасының өзгерісіне жаңа биореттегіштің әсері анық байқалған. Бұл жерде біз жаңа биореттігіші бар тұзды ортада өскен дәндердің өсуіне әсерін байқадық (7 — суреттерде көрсетілген). Және де ол пайыз есебімен 40%-ке  жоғарылады. Алғашқы кестедегі өскіндердің биомассасы жаңа биореттегіш қосылған ортадағы өскіндермен салыстырғанда төзімділігі жоғары Қазақстан-10 сортында да және төзімсіз Арай, Дауыл сортында да тұзға төзімділік 2 есеге артқанын байқадық. Яғни, мұнда жаңа биореттегіштің әсерінен метаболизм процесі қарқынды жүреді.

 

 

 

                                                     — Қалыпты жағдайдағы орта

                                                         —   Жаңа биореттегіш қосылған орта

 

    Н₂О (бақылау)

Н₂О +жаңа биореттегіш

1. 2%NaCl 2%NaCl + 50 нг/мл жаңа биореттегіш
2. 2%NaCl 2%NaCl + 5 нг/мл жаңа биореттегіш

 

Сурет 7 — NaCl тұзы және жаңа биореттегіш қосылған ортада өскен Арай сортының биомассалық көрсеткіші

 

 

Цитокинин медиаторының in vitro жағдайында каллкс түзілуіне әсерін зерттеу үшін зерттеу обектісі ретінде “Қазақстан -10” сорты алынды. Осы сорттың тозаңқабын цитокинин медиаторы және осы медиатормен басқа гормон қосындысы бар ортада өсіп, әр түрлі типті каллустар: морфогенді емес,  ризогенді, геммогенді каллустар алынды. Нәтижесі  8-сурет пен 9-суретте көрсетілген

 

8-Сурет Тек Цитокинин медиаторы бар қоректік ортаға көшірілген мофогенді емес каллустан өскен геммогенді каллус 

 

 

 

 

 

 

 

 

9сурет. Қазақстан-10 бидай тозаңқабынан алынған МС қоректік ортасында 2,4-Д гормонында өсірілген ризогенді каллус

 

 

 

 

 

 

.  

 

 

 

 

Қорытынды

1. Цитокинин медиаторын кері фазалы хроматографияның көмегімен бидай дәнінен бөліп алдық.
2. Бөлініп алынған цитокинин медиаторының қасиеттеріне сипаттама берілді.
3. Цитокинин медиаторының өсімдіктердің морфогенезіне басқа                                                                                                                       фитогормондармен салыстырғанда  өте аз мөлшерде қолданылатындығы зерттелді.
4. Цитокинин медиаторының калустардырдың морфогенезіне әсері тексерілді.
5. Зерттеуге алынған цитокинин медиторын өндірісте және ауылшаруашылығында кеңінен қолдануға болатындығы зерттелінді.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Түйін

 

          Цитокининнің  әсерінен дән ұрығында екіншілік гармон түзілетіндігі анықталды.  Осы екіншілік гармон таза түрінде  бөлініп алынды. Бұл гармонның  физиологиялық әсері –ризогенез. 

 

Резюме

 

     Действие цитокинина приводит к образованию вторичного гормона  в зародыше.     Вторичный гармон был очищен.  Была показано,  что физиологическим проявлением активности вторичного  гормона является ризогенез. 

Summary

 

 

 Citokinins caused the fonation secondary hormone in embreo. The secondary hormone was purified it was shown the physiological action of secondary hormone is risogenes. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ

1. Полевой В.В.Фитогормоны. Ленинград: Ленинградский университет. 1982. С. 122-128.
2. Гормональная регуляция онтогенеза растений. Москва.Наука, 1984 С. 87-101.
3. Кучеренко А.А., Мамаева Г.Г. Регуляторы роста и развития растении // Тез. доклад 1 Всесоюной конференции. Москва: Наука, 1981. С. 115-125.
4. Anthoni Trewavas, Mare Knight. Mechanical signalling calcium and plant signals// Plant sciences, 1994.Vol.16.N.9. P.677-682.
5. Давоян Э.И. О гормональной регуляции морфогенетических потенций длительно культивируемых каллусных тканей риса//Сельскохозяйственная биология, 1986. N. 1 С. 92-99.
6. Гильманов М.К., Досмагамбетова Ш.С., Дильбарканова Р. НАДФ-специфичная глютаматдегидрогеназа пшеницы// Физиологические основы повышения устойчивости и продуктивности сельскохозяйственных растений. Алма-Ата: Наука,1988. С. 117.
7. Гильманов М.К., Дильбарканова Р., Досмагамбетова Ш.С. НАДФ-специфичная глютаматдегидрогеназа пшеницы: выделение и свойства // Докл. АН СССР. 1988. Т.3. N.4. С.987-989.
8. Keith A., Walker, Poli C.Yu. The hormonal control of formation in callus of Medicago sativa cultured in virto// Amer. J. Bot. 1978/P.25-32.
9. Дильбарканова Р., Гильманов М.К. Строение и функции сферосом растительной клетки. Алматы:±ылым. 1997. С. 75-133.

10.Гильманов М.К., Дильбарканова Р., Дарканбаев Т.Б. Латентная форма глютматдегидрогеназы, локализованная в сферосомаподобных структурах зерна пшеницы.//Доклад АН СССР. 1982. С. 737-739.

11.Гильманов М.К., Дильбарканова Р., Султанбаев Б.Е. Сруктура и функция сферосом растений.// Ботанические  ииследования в Казахстане. Алма-Ата: Наука.1988. С.108.

12.Berrige M.J., Irvin R.F. Inositol trisphosphotase, a novel second messenger in cellular transduction// Nature. 1984. V. 321. N.5992. P. 315.

13.Simon Gilroy,Tony Trewaves. A decade of Plant Signals.// BioEssays, 1994.Vol.16. N.9.September.P.677-682.

14.Гильманов М.К. Трансдукция сигналов цитокинина в зерне пшеницы.//Биотехнология, теория и практика. Алматы.1997. N.3. С.94.

15.Poovaiah B.W., Reddy A.S.N/ Calcium and signal transduction in Plants.//Plant sciences, 1993. P. 185-221.

16.Transgenic plant aeguorin reports the effects of touch and cold — shock and elicitors on cytoplasmic cficoum.//Nature, 1991. V.352. P.524-528.

17.M.D.Bazzy, G.L.Nelesestuen. Properties of membrane — inserted protein kinaseC.// Biochemistry, 1998. 27. P.7598-7593.

18.Berrige M.J. Inositol triphosphatatse and diacylglycerol: The interacting second messengers// Ann. Rev. Biochem. 1987.V.56. P.159-193.

19.Transmembrane signaling via phosphotidilinositoi-4,5-bisphosphote hydrolysis in plans.//Plant Physiol.,1990. V.93. P.361-366.

20.Физико-химические методы анализа. Практическое руководство. Ленинград:Химия. 1988.

21.Гильманов М.К., Фурсов О.В., Францев А.П. методы очистки и изучения  ферментов растений. Алма-ата:Наука,1971.

22.Маурер Г. Диск — электрофорез. Москва : Мир .1971.

23.Заиров С.З. Изменение активности и формирование изоферментного состава пероксидазы в процессе развития зерна //Накопление и обмен белков в зерне пшеницы . Алма-Ата: Наука,1987.с.176

24.Сафонов В.И., Кузеванов В.Я.,Котова Л.Г. Электрофоретическое изучение белков в морфогенных и неморфогенных каллусах яровой пшеницы //Филиология и биохимия культурных растений, 1995. Т.27. N.4. С.254-258.

суретте көрсетілген. 

25.Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений //М.: Наука 1985, c. 60.

 26.Дильбарканова Р., Гильманов М.К. Строение и функции сферосом растительной клетки. — Алматы: Гылым, 1997. — С.164.

 27.Miller C., Skoog F., Saltza M. von. and Strong F. Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid // J. Amer. Chem. Soc. — 1955. — Vol. 77. — P. 1392.

 28.Skoog F., Strong F. M., Miller С. Cytokintns // Science. — 1965. — Vol.148,  № 3669. — P. 532.

 29.Weiss C, Vaadia Y. Kinetin-like activity in root apices of sunflower plants // Life Sci. — 1965. – Vol. 4. — P. 1323.

 30.Guttman R., Back A. Effect of kinetin on Paramecium caudatum under vary­ing culture conditions // Science — 1960. – Vol. 131 — P. 986.

 31.Letham D.S., Shannon I.S., Mc Donald R. The structure of zeatin, a factor inducing cell division // Proc. Chem. Soc. — 1968. — № 7. — P. 230.

 32.Miller С.О. Zeatin and zeatin riboside from a mycorrhizal fungus // Science — 1967. — Vol. 157. – P. 1055.

 33.Brandes H., Kende H. Studies on cytokinin-controlled bud formation in moss protonemata // Plant Physioi. — 1968. – Vol. 43. — P. 827.

 34.Heide O.M. Interaction of temperature, auxins and kinins in the regenera­tion ability of Begonia leaf cuttings // Physiol. Plantarum — 1965. – Vol.18. – P. 891.

 35.Franco-Zorrilla J.M., Martin A.C., Solano R., Rubio V., Leyva A., Paz-Ares J. Mutations at CRE1 impair cytokinin-induced repression of phosphate starvation responses in Arabidopsis // The Plant J. — 2002. – Vol. 32, issue 3. — P. 353 -360.

 36.Brandstatter I.B., Kieber J.J. Two genes with similarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis  // Plant Cell — 1998. – Vol. 10. –  P.1009–1019.

   37.Шуй Зы Чин. Функционалдық геномика, ҚХР «Ғылым» баспасы, 2007 534-537 б.