Дипломная работа: Влияние минерального состава питательной среды на процесс регенерации груши в условиях in vitro

ВВЕДЕНИЕ

 

Среди плодовых культур ведущими, как у нас в стране, так в большин­стве стран мира, являются яблоня и груша. Главным направлением в разви­тии мирового плодоводства — закладка садов интенсивного типа. Важнейшим фактором, определяющим, продуктивность, долговечность и рентабельность интенсивных насаждений является исходное качество посадочного материа­ла. Уже доказано, что невозможно добиться высокой продуктивности насаж­дений такого типа, не используя для его закладки конкурентоспособный оздоровленный посадочный материал, соответствующий мировым стандартам.

Особая роль в этом отводится комплексу мероприятий, среди которых большое значение имеет внедрение в питомниководство современных техно­логий, в частности, метода клонального микроразмножения. Внедрение этого метода в сельскохозяйственное производство позволит повысить морфогенетический потенциал маточных и плодоносящих насаждений и эффективность отрасли садоводства в целом.

Однако в условиях ухудшения экологической ситуации актуально* соз­дание растений с необходимыми хозяйственно-ценными признаками, полу­ченных с использованием биотехнологических методов, в частности, методов генной инженерии, позволяющих вносить изменения в конструкцию наслед­ственного вещества организма. Решение этой проблемы, применительно к плодовым растениям, может стать реальным после разработки надежных ме­тодов регенерации растений из изолированных соматических тканей. Разви­тие этого направления является многообещающим, т.к. позволяет создать вы­сокоадаптивные формы растений, значительно ускорить селекционный про­цесс, что особенно важно как для селекции, так и для питомниководства в целом [1].

Эффективность методов in vitro при выращивании безвирусного поса­дочного материала многолетних растений позволяет рассматривать их серь­езной альтернативой традиционным технологиям размножения (Высоцкий В.А., 1989). Метод клонального микроразмножения начинает постепенно вы­теснять традиционные способы вегетативного размножения. В США, Ита­лии, Великобритании, Голландии, Новой Зеландии, Франции имеются произ­водственные лаборатории, работа которых по выпуску оздоровленного поса­дочного материала плодовых и ягодных культур поставлена на промышлен­ную основу, очевидна тенденция увеличения выпуска такого посадочного материала и в дальнейшем. По мнению И.М. Куликова, В.А. Высоцкого (2005), методика культивирования изолированных меристем достаточно раз­работана применительно к 2400 видам растений [17].

Однако метод клонального микроразмножения у нас в стране не полу­чил такого широкого промышленного распространения в системе производ­ства оздоровленного посадочного материала. Это связано с тем, что на прак­тике воспроизводимость результатов весьма низка, а размножение многих видов растений in vitro остается в основном на лабораторной стадии. При размножении in vitro индивидуальная реакция генотипов проявляется значи­тельно сильнее, чем при традиционных способах размножения. Условия, культивирования, разработанные для одних форм и сортов, не всегда могут быть использованы для размножения других. Остаются нерешенными такие проблемы, как низкая регерационная способность отдельных генотипо витрификация тканей, ингибирование ростовых процессов фенольными соеди­нениями, борьба с микроорганизмами, особенно бактериями, паразитирую­щими в тканях, а также отсутствие знаний о закономерностях процессов ре­генерации. Большие капитальные и текущие расходы на оборудование и не­обходимость использования высококвалифицированного персонала являются также ограничивающим фактором использования этого метода размножения. Поэтому разработка эффективных способов регенерации из изолированных соматических тканей, повышение уровня регенерационного потенциала на основных этапах микроразмножения, поиск общих закономерностей морфо­генеза актуальны в настоящее время и позволят повысить практическую зна­чимость данного метода размножения, как в системе производства оздоров­ленного посадочного материала, так и селекции [4].

Целью исследований явилась оптимизация отдельных этапов техноло­гии клонального микроразмножения сортов груши при применении регуляторов роста, и разработка эффективных методов регенерации из соматических тка­ней.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) разработать наиболее эффективные приемы регенерации растений из меристематических верхушек;

2) определить возможность длительного хранения эксплантов in vitro;

Среди моделей микроклонального размножения заслуживают внимание следующие:

-индукция развития пазушных меристем;

-развитие адвентивных побегов из тканей эксплантов;

-индукция органогенез или соматического эмбриогенеза из каллуса тканей растений.

Наибольшее распространение получила первая модель размножения, основанная на индукции пазушных меристем за счет снятия апикального до­минирования с помощью цитокининов, либо за счет удаления верхушки и микрочеренкования. Впервые эта модель была разработана была на землянике. При этом риск получения неоднородного потомства ми­нимален, частота появления мутаций не больше, чем при традиционных спо­собах размножения. Первая модель нашла широкое распространение для производства оздоровленного безвирусного посадочного материала, боль­шинства сельскохозяйственных культур, в том числе и плодово-ягодных: яб­лони, груши, вишни, сливы, винограда, земляники, малины, смородины, крыжовника и др.

Вторая модель микроразмножения основана на формировании адвен­тивных почек из меристематических тканей экспланта, взятых из различных частей и органов растений. Индукция адвентивного органогенеза может быть использована для размножения аспарагуса, хризантемы, фрезии, герберы, земляники, большинства луковичных культур и других видов растений. Раз­работка этой модели микроразмножения в настоящее время особенно акту­альна в связи с развитием метода генной инженерии, возможности которой в настоящее время ограничены из-за отсутствия эффективных способов реге­нерации из соматических тканей. У многих видов плодовых и ягодных куль­тур регенерация растений из соматических тканей носит спонтанный харак­тер. Применение этой модели может быть весьма эффективно для тех куль­тур, которые слишком медленно формируют пазушные побеги. Регенерация адвентивных почек и побегов in vitro позволяют исключить повторную стерилизацию тканей, зна­чительно увеличить коэффициент размножения и тем самым наиболее полно реализовать потенциал растительного организма к размножению.

Третья модель микроразмножения основана на дифференциации из со­матических клеток зародышеподобных структур, которые получили название соматического эмбриогенеза, и на формировании адвентивных побегов в кал- лусных тканях. Используют для размножения большинства растений из се­мейства Orchidaceae и Rutaceae, а также для некоторых представителей зла­ков.

При микроразмножении с использованием развития адвентивных почек из тканей экспланта и индукции эмбриогенеза в каллусе и суспензии клеток вероятность возникновения генетических отклонений возрастает [5].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 

• Особенности введения экспланта в стерильную культуру

 

 

Происхождение экспланта. Это в первую очередь связано с местопо­ложением вычленяемой части на растении, а также с источником происхож­дения эксплантов (сеянцы в ювенильной фазе, взрослые деревья.

Многочисленными экспериментами установлено, что экспланты растений, находящихся в ювенильной фазе, имеют гораздо большую способ­ность к массовому формированию побегов и их укореняемости у большинст­ва плодовых культур, в том числе у яблони и груши по сравнению с эксплан- тами взрослых деревьев.

Большим регенерационным потенциалом обладают терминальные поч­ки, по сравнению с боковыми. Это явление можно объяснить специфическим содержанием эн­догенных регуляторов роста (ауксиноподобных веществ) в терминальных почках.

Сроки изоляции. Большинство исследователей счи­тают, что лучшим сроком введения в культуру in vitro является фаза выхода из покоя и активный рост. Качество подвоев яблони и вишни, полученных методом in vitro, зависит от сроков их изоляции

Проявление регенерационной способности экспланта обусловлено его физиологическим состоянием и во многом зависит от фазы развития исход­ного маточного растения.

В то же время, для вишни и некоторых подвоев яблони успешное вве­дение эксплантов в культуру с последующей пролиферацией побегов было осуществлено, когда в качестве исходного материала использовали растения, находящиеся в состоянии покоя [8].

Размер эксплантов. При введении в культуру важное значение имеет размер эксплантов. Более крупные экспланты легче регенерируют. Однако высокая их инфицированность бактериальной и другой микрофлорой приво­дит к значительным выпадам. С увеличением размера экспланта в пределах от 0,1 до 10 мм от апикальной меристемы до почки, включающей примордиальную  зону и часть наружных листьев) инфицированность при обычных ме­тодах стерилизации увеличивается и достигает 80-90% Свободными от инфекции оказались экспланты размером 0,1 мм (собственно меристема), регенерация же их затруднена и для нее не­обходимо более продолжительное время.

Считается также, что чем меньше размер изолируемого экспланта, тем больше вероятность оздоровления. По данным у систематически заражаемых растений концентрация вируса в побегах уменьшается к периоду вегетации. Это дает возможность посредством экс­плантации (отсечения) меристематической ткани размножать в стерильной культуре in vitro свободные от вирусов и патогенов растения. Так как внутри точки роста побега собственно меристема образует только небольшое коли­чество слоев клеток размером менее ОД мм, то в зависимости от технических возможностей отсекаются кусочки ткани длиной от 0,2 до 0,4 мм, которые состоят из меристемы и смежных слоев ткани с 1-2 листовыми зачатками. Таким образом, минимальная концентрация или полное отсутствие вирусных частиц характерны для точек роста. Причина этого явления до конца не ясна. Можно предположить, что пониженная концентрация вирусных частиц в. ак­тивно делящихся меристематических клетках связана с отсутствием в по­следней развитой проводящей системы. Кроме того, это можно объяснить и физиологическими особенностями клетки, в частности, специфическим ба­лансом биологически активных веществ (например, ауксинов), а также про­ницаемостью стенок меристематических клеток. Нельзя также исключать возможное ингибирующее влияние на репликацию вирусных частиц отдель­ных компонентов питательной среды — ауксинов, цитокининов и др [9].

Элиминация вирусных болезней методом культуры меристем является по-прежнему одним из главных направлений применения метода клонально- го микроразмножения. Одной из основных причин, позволяющих оздоровить растения от вирусных инфекций, также объясняют наличием в тканях градиента концентрации вирусных частиц.

Однако при использовании апикальных верхушек размером 0,1-0,2 мм без листовых примордиев приживаемость их бывает очень низкая и состав­ляет 1-10% Поэтому, если не ставится задача оз­доровления, для массового размножения предпочтительно использовать экс- планты размером 0,5-2,0 мм, состоящие из конуса нарастания и двух-трех листовых примордиев и подстилающего слоя ткани Такие экспланты до­вольно легко регенерируют и сравнительно слабо инфицированы. Использо­вание эксплантов большего размера быстрее приводит к успеху микрораз­множения, что, прежде всего, объясняется сокращением лаг-периода при введении в культуру и обусловлено влиянием окружающей ткани

Стерилизация. Часто для стерилизации растительных тканей яблони и груши используют двухступенчатую стерилизацию, когда растительные вер­хушки длиной 2-3 см стерилизуют сначала в течение 2 секунд в 70%-ном этиловом спирте, а потом в течение 15 мин в 0,2%-ной сулеме

Применение смеси 3 % перекиси водорода с 96 % этанолом и после­дующая обработка 0,01 % раствором сулемы обеспечивают практически пол­ное освобождение эксплантов груши от инфекции

Исследования O.A. Леонтьева-Орлова показали, что изучение стерилизующих препаратов — диацида, мертиолата и сулемы, при разных экс­позициях показало их неодинаковое влияние на контаминацию и состояние эксплантов яблони. Стерилизация диацидом в течение 5-10 мин обеспечивала освобождение от инфекции. Стерилизация мертиолатом не давала такого эф­фекта, к тому же препарат действует на апикальные верхушки яблони более жестко, чем диацид, вызывая повреждение отдельных тканей, а затем и нек­роз самого экспланта. Для полного освобождения от инфекции целесообраз­но стерилизовать экспланты диацидом не более 10 мин с предварительной промывкой водой не более 2 часов [12].

Кроме ртутьсодержащих препаратов используют также препараты, со­держащие хлор — гипохлорит натрия или кальция. В частности, сначала верхушки побегов подвоя яблони M 26 промывал в течение 1 часа в проточной воде, за­тем-на 40 мин помещал в 10%-ный раствор препарата доместос (гипохлорит натрия) и после этого 5 раз ополаскивал в стерильной воде предложили стерилизовать побеги подвоя яблони Оттава-3 сначала  bv  95%-ном спирте — 5-10 секунд, а затем 10%-ном Jivex -5 мин и 0,6% — ном. растворе NaOCl [19].

В отдельных случаях полезно проводить тест на зараженность эксплан­тов сапрофитной микрофлорой, при котором экспланты сначала помещают на среды без дорогостоящих добавок, а через 7-10 дней после выбраковки «чистые» экспланты пересаживают на среды с полным минеральным соста­вом для дальнейшего культивирования.

Исследователи рекомендуют использовать препараты, обладающие бактериостатическим действием, состав которых не расшифровывается. Очень часто для этих целей рекомендуют флороглюцин. По мнению В.А Вы­соцкого включение таких реагентов в питательную среду необосно­ванно, а иногда вредно, т.к. способствует размножению экземпляров; пора­женных патогенными микроорганизмами.

Максимальная эффективность при стерилизации, в частности побегов груши, может быть достигнута- при использовании белково-связывающего стерилизатора — нитрата серебра в концентрации 0,1-0,3%.

Выбор стерилизующего реагента зависит от источника изоляции экс- планта. Исследования, проведенные Н.И. Туровской с эксплантами, взятыми в фазу активного роста (май, июнь) и развившихся из почек одре­весневших побегов после хранения их при пониженных температурах в тече­ние зимы, показали их значительные различия в степени инфицированности. Так, было установлено, что гибель эксплантов-почек от сапрофитной микро­флоры после стерилизации их 0,1 % раствором диацида в течение 8 мин была в 3-4 раза больше, чем меристематических верхушек [1].

Солевой состав. Эффективность клонального микроразмножения в значительной степени определяется правильным подбором оптимального со­става среды, особенно на этапах введения в культуру и собственно микро­размножения.

Наибольшее распространение получила среда Мурасиге-Скуга для тканей табака. Эта среда содер­жит хорошо сбалансированный состав минеральных веществ, благоприятный для роста изолированных тканей многих растений.

Большинство исследователей считают, что среда Мурасиге-Скуга является наиболее приемлемой для культивирования эксплантов яблони и груши на основных этапах микроразмножения.

Н.И. Туровская при введении в культуру in vitro подвоев яблони 54-118 и 62-396, кроме среды Мурасиге-Скуга, испытывала и другие среды — Гамборга и Нича-Нича.  Было установлено, что к концу второго месяца куль­тивирования преимущество в развитии принадлежит эксплантам, культиви­руемым на среде Гамборга, где количество их, достигших фазы розетки в 4,5­5 раз больше по сравнению со средой Мурасиге-Скуга. После трех субкуль­тивирований (через 3 месяца) экспланты на среде Уайта погибли все, на сре­де Hura-Hura отставали в развитии.

Также в исследованиях с плодовыми культурами Н.И. Туровской кроме сред Мурасиге-Скуга и Гамборга, на этапе собственно микро­размножения была использована среда Ллойда-Маккауна установлено преимущество последней. В другом опыте с подвоями яблони 62-396 и 54-118 лучшей сре­дой оказалась среда Гамборга. Через 6 недель культивирования на ней все побеги подвоя 62-396 достигли оптимальных для клонирования размеров у подвоя 54-118 — 83%. На контрольной среде Мурасиге-Скуга у обоих подвоев образовалось по 67% таких побегов.

Проведенный анализ литературных данных позволяет сделать вывод о том, что нет единого мнения в использовании той или иной среды. По всей вероятности такой разброс полученных данных связан с генотипической ре­акцией сортов груши в условиях in vitro [5].

Биологически активные вещества. Существенную роль в регуляции морфогенеза при клональном микроразмножении играют регуляторы роста. Это обширная группа природных и синтетических соединений, которые в малых дозах активно влияют на обмен веществ высших растений, что приво­дит к значительным изменениям в их росте и развитии.

Закономерности действия регуля­торов роста обусловлены различием их химической природы и функцио­нальной ролью вещества. Эффективность воздействия их зависит от концен­трации и направленности действия. При низких концентрациях происходит стимуляция ростовых процессов, при средних — торможение, а при высоких полная их задержка.

Из природных регуляторов роста наиболее известны фитогормоны (ци- токинины, гиббереллины, абсцизовая кислота, этилен). Являясь продуктами жизнедеятельности самих растений, фитогормоны участвуют в регуляции процессов метаболизма, в значительной мере определяя характер и темпы формообразовательных процессов [2].

Наиболее часто при введении в культуру in vitro и на этапе собственно микроразмножения используют цитокинины: природный — зеатин, синтети­ческие — 6-бензиламинопурин (БАП), 6-фурфураминопурин (кинетин), 2- изопентениладенин  и его синтетические аналоги — индолил -3-масляную кислоту (ИМК), 1-нафтилуксусную кислоту (НУК); гиббереллины (ГК); витамины: аскорбиновую кислоту, пиридоксин HCl, никотиновую кислоту, тиамин HCl, и другие [3].

По мнению одних авторов, считают оптимальным набором для регенерации меристематических верхушек яблони и груши введение в среду ИМК, БАП, ГК в концентрации от 0,1 до 0,5 мг/л. Разработанная для плодовых культур сре­да включала не только БАП, ИМК, ГК, но и флороглюцин. Установили, что флороглюцин может оказывать стимули­рующее последействие на ризогенез яблони, а также усиливать пролифера­цию у подвоев яблони M 7 и M 26.

Однако позже экспериментально было доказано, что введение в среду флороглюцина,  ИМК и ГК не обязательно. В исследованиях X.S. Shen, при микроразмноже­нии груши сортов Вильяме, Триумф, Пакхема и Бере Боск также было уста­новлено, что введение дополнительных добавок в среду (ИМК, НУК, ГК) способствует образованию 1-2 дополнительных побегов на апикальных эксплантах, при увеличении концентрации ИМК до 15. Также определено, что для каждого сорта оптимальная концентрация ИМК индиви­дуальна.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод о том, что нет единого мнения о влиянии регуляторов роста на первых двух этапах микро­размножения.

 Ученые подчеркивали, что коэффициент размножения яблони зависит, в основном, от соотношения ауксинов и цитокининов в пита­тельной среде. Были определены их концентрации. Для подвоя яблони М’4 установлено, что на среде содержащей 1,15 мг/л БАП и 0,15- 0,20 мг/л ИМК, образуется максимальное количество хоро­шо развитых побегов.  Неделчева  и др. считают, что при микроразмножении  груши оптимальное содержание  БАП 1,0 мг/л и ИУК 0,01 мг/л. М. рекомендует на этапе введения в культуру при микрораз­множении яблони наряду с 2,0 мг/л БАП использовать НУК в концентрации 0,4 мг/л. По данным Ю.Г. изучение содержания БАП, кинетина, ИМК, ИУК, НУК, ГК в концентрациях от 0,1 до 10,0 мг/л в раз­личных комбинациях на меристематических верхушках вишни показало, что наибольшим морфогенетическим потенциалом обладает БАП. При высокой гормональной насыщенности питательной среды происходит угнетение про­цесса морфогенеза вплоть до гибели растительной ткани.

По мнению О.А. Леонтьева-Орлова, введение в среду только БАП на этапе введения в культуру in vitro положительно влияло как на рост побегов яблони, так и ризогенез. Совместное введение ГК и ИМК в концентрациях 0,1 и 10,0 мг/л в присутствии БАЛ привело к ингибированию ризогенеза на среде с 1,0 мг/л ИМК, независимо от концентрации ГК, отме­чено зарастание меристематических верхушек каллусом. Переход экспланта к каллусогенезу может быть объяснен нарушением эндогенного химического баланса под влиянием факторов питательной среды. Зарастание каллусом апекса может быть вызвано нарушением процесса образования проводящей системы, в результате меристема оказывается изолированной от корней. Клетки этой ткани, лишенные продуктов питания, теряют свои меристематические свойства и начинают неорганизованно делиться. Процесс охватывает весь эксплант и завершается его гибелью. Кроме того, раневая поверхность экспланта яблони и прилегающие к ней клетки, видимо, обладают высокой чувствительностью к регуляторам роста.

Необходимость использования только БАП при культивировании яб­лони и груши на первых двух этапах микроразмножения подтверждается большинством. На этапе введения в культуру in vitro ими была установ­лена оптимальная концентрация БАП (0,5 до 1,5мг/л). А на этапе собственно микроразмножения рекомендуется увеличить содержание БАП до 1,5- 3,0 мг/ Использование более высоких кон­центраций БАП (с выше 3,0 мг/л) на этапе пролиферации приводит к форми­рованию эксплантов с очень короткими побегами красноватого цвета, кото­рые не пригодны для укоренения [2,7].

Другие авторы рекомендуют вместо цитокининов пуринового ряда ис­пользовать цитокинины ряда дифенилмочевины, в частности- тидиазурон (М-фенил-N-1,2,З-тидиазолил-5-мочевину), который обладает большей ак­тивностью. Механизм действия тидиазурона пока не изучен.

Высокие кон­центрации тидиазурона уменьшали высоту побегов и изменяли морфологию листьев. Присутствие тидиазурона на этапе пролиферации побегов усиливало ризогенез на этапе укоренения.

Использование различных цитокининов (кинетина, БАП, зеатина) на этапе собственно микроразмножения у сортов яблони Еллоуспур, Старкспур Голден и Голден Делишес показало, что наиболее быстрое размножение обеспечивал БАП, зеатин ускорял рост побегов.

Введение в среду для размножения 2-изопентиладенина не стимулиро­вало процесс пролиферации у Vitus vinifera L [10].

И.М. Фартизинова предложила в качестве стимулятора роста при микроразмножении груши использовать настойку лимонника (15-20 ка­пель/л). Предложенный прием обеспечивал сокращение сроков получения полноценных регенерантов, увеличение коэффициента размножения, сниже­ние себестоимости питательной среды [2].

Известно, что при изоляции эксплантов, особенно у плодовых культур, в результате травмы активизируются ферменты, окисляющие фенолы расте­ний, в особенности полифенолоксидаза. В результате интенсивной деятель­ности этого фермента в тканях плодовых культур накапливаются полифенолы в виде гидролизованного или конденсированного танина и продукты дальнейшего окисления полифенолов – хиноны. При этом продукты окисления фенолов не только вызывают потемнение ткани и питательной среды, но и могут подавлять деление и рост эксплантов). Это послужило основании.        

Существует предположение, что тидиазурон способствует превращению ци- токининовых рибонуклеидов в биологически более активные рибонуклеоти- ды установили, что тидиазурон в концентрациях 0,1 и 1,0 оказывал на микроразмножение побегов яблони такой же эффект, как в концентрации 4,4 мл. Высокие кон­центрации тидиазурона уменьшали высоту побегов и изменяли морфологию листьев. Присутствие тидиазурона на этапе пролиферации побегов усиливало ризогенез на этапе укоренения.

Использование различных цитокининов (кинетина, БАП, зеатина) на этапе собственно микроразмножения у сортов яблони Еллоуспур, Старкспур Голден и Голден Делишес показало, что наиболее быстрое размножение обеспечивал БАП, зеатин ускорял рост побегов: Из изучаемых сортов наибо­лее чувствительны к действию цитокининов был сорт Старкспур Голден.

Введение в среду для размножения 2-изопентиладенина не стимулиро­вало процесс пролиферации у Vitus vinifera L.

И.М. Фартизинова предложила в качестве стимулятора роста, при микроразмножении груши использовать настойку лимонника (15-20 ка­пель/л). Предложенный прием обеспечивал сокращение сроков получения полноценных регенерантов, увеличение коэффициента размножения, сниже­ние себестоимости питательной среды.

Известно, что при изоляции эксплантов, особенно у плодовых культур, в результате травмы активизируются ферменты, окисляющие фенолы расте­ний, в особенности полифенолоксидаза. В результате интенсивной деятель­ности этого фермента в тканях плодовых культур накапливаются полифено­лы в виде гидролизованного или конденсированного танина и продукты дальнейшего окисления полифенолов — хиноны При» этом продукты окисления фенолов не только вызывают потемнение ткани и питательной среды, но и могут подавлять деление и рост эксплантов Это послужило основани­ем к изучению возможных способов, препятствующих выделению фенолов и продуктов их окисления в питательную среду.

Предложенная еженедельная смена питательной среды предупреждает почернение и гибель эксплантов. Однако этот прием трудоемок и требует дополнительных затрат. Согласно выдерживание эксплантов в течение нескольких часов в воде способствует выживанию верхушек побегов при посадке на питательные среды. Исследование Н.В. Катаевой не подтвердили значимость такой обработки.

Для снижения окислительной активности ферментов на этапе введения- эксплантов в культуру in vitro ряд исследователей рекомендует использова­ние антиоксидантов. По методике, разработанной для культуры ткани яблони сорта Макинтош, предлагается введение в среду по- ливинилпирролидона (ПВП) в концентрации 5-10 г/л. O.A. Леонтьев-Орлов также считает, что для снятия отрицательного действия фенольных соединений у яблони необходимо использовать ПВП в концентрации 50 г/л, хотя ПВП отрицательно влияет на прирост побегов [8,11].

В.М. Бурдасов и др. отмечают, что окисление эксплантов яблони снижалось при культивировании их в течение первых 3-5 дней при темпера­туре 3-5° С. Поливинилпирролидон (50 г/л) и 2-3 кратные пересадки эксплан­тов на свежие среды также уменьшали их гибель на 30-50%.

Согласно Р.Г. Бутенко существенно улучшить ситуацию можно отмывкой экспланта в течение 4-24 часов дистиллированной водой или сла­бым раствором аскорбиновой кислоты в концентрации 1 мг/л. Другие авторы рекомендуют экспланты после стери­лизации промывать в растворе аскорбиновой кислоты (1мг/л), либо вводить в питательную среду антиоксиданты: глютатион — восстановленную форму — 4-5 мг/л, дитиотриэтол — 1-3 мг/л, диэтилдитиокарбомат — 2-5 мг/л, поливи­нилпирролидон (ПВП) — 5000-10000 мг/л. Исследования Г.П. Атрощенко свидетельствуют о том, что включение антиоксидантной смеси (ас­корбиновая кислота + ДИЕКА + ЭДТА) в питательную среду существенно повысило выход эксплантов клоновых подвоев яблони на этапе введения в культуру in vitro. При этом процент прижившихся меристематических вер­хушек подвоев 62-396, 3-5-44, 3-3-72 оказался в 1,5 раза выше, чем при обра­ботке эксплантов антиоксидантами и в 2,5 раза выше при использовании пи­тательной среды без этих веществ [16,17].

1.2 Роль солевого состава среды и регуляторов роста на органогенез плодовых культур

 

Солевой состав. Существенное влияние на индукцию адвентивного- органогенеза оказывает солевой состав среды. При изучении солевого соста­ва питательной среды многие авторы уделяли внимание концентрации мак­росолей.  По мнению  Туровой измене­ние содержания NO3 и NH4⁺ в среде до соотношения 1:4 и 1:8 по сравнению с 2:1 при культивировании листовых эксплантов подвоя яблони M 26 показа­ло, что при соотношении 1:4 наблюдалась максимальная регенерация (100%). Уменьшение содержания макросолей в 1/2 и 1/4 раза способствовало адвен­тивному органогенезу груши. Однако эти среды оказались не пригодны для регенерации эксплантов других форм яблони

По данным В.М. Тюленева, для эффективной регенерации ад­вентивных побегов у яблони и груши оптимальное соотношение ионов NO3 : NH}⁺ — 2:1. Увеличение соотношений ионов NO3 : NH/ до 3:1, 4:1, 5:1 и 6:1 приводит к уменьшению индукции адвентивных побегов.

Многие использовали для регенерации плодовых культур среду №6.

Сравнительное изучение сред №6  и LS, проведенное  показало, что среда №6 превосходит среду

LS по регенерации адвентивных побегов. Среда №6 отличалась от среды LS более низким содержанием солей N, К, Р, Са и Mg [20].

Исследования И.В. Бартиша и В.И. Корхового также свидетель­ствуют о том, что уменьшение содержания макросолей в среде Мурасиге-Скуга  при культивировании клона яблони RF1 и сорта яблони Айда- ред способствует регенерации побегов из листовых эксплантов с высокой частотой. Среда №6 также была эффективна, как и среда Мурасиге-Скуга с половинной концентрацией солей. Однако в опытах  Высоцкого культивирование 14 генотипов яблони на средах Мурасиге-Скуга и №6 пока­зало, что полная среда Мурасиге-Скуга оказалась лучшей для индукции по­бегов без образования каллуса, чем среда №6 [14].

Регуляторы роста. Для индукции адвентивного органогенеза исполь­зуют следующие регуляторы роста: 6-бензиаминопурин (БАЛ), гибберелловую кислоуы (ГК), нафтилуксусную кислоту (НУК), индолилмасляную ки­слоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д).

По теории F. Skoog, о которой указано выше, обра­зование стеблей, корней или недифференцированный рост каллуса можно получить, изменяя относительное содержание ауксинов и цитокининов. Мно­гие авторы считают, что сочетание высоких концен­траций цитокининов с низким содержанием ауксинов являются одной из предпосылок для успешной регенерации адвентивных побегов из листовых эксплантов яблони. По мнению В.М. Тюленева, концентрация регуля­торов роста зависит от морфогенетического потенциала эксплантов. При сла­бом морфогенетическом потенциале эксплантов следует применять повы­шенное «давление» цитокининов и ауксинов, например 9:3 мг/л. При хоро­шем морфогенетическом потенциале исходных эксплантов следует давать низкое содержание цитокининов и ауксинов, а именно, 3:1 мг/л. Для каждого вида и сорта возможны другие оптимальные концентрации [2].

В опытах И.В. Бартиша и В.И. Корхового увеличение частоты регенерации происходило при повышении концентрации БАЛ до 5 мг/л у сортов яблони Айдаред (частота регенерации — 32%) и до 5-10 мг/л у сорта Флорина (частота регенерации — 55-70%). Повышение концентрации НУК от 0,05 до 1,5 мг/л также увеличивало эффективность регенерации, особенно значительно у сорта Айдаред (от 2 до 72%). По-видимому, выданном случае проявляются генетические особенности сортаСледует также заметить, что макси­мальная частота регенерации для сортов Айдаред и Флорина наблюдалась и другими авторами, работавшими с этими сортами, но использовавшие иные питательные среды и соотношения регуляторов роста. Возможно, регенерационный потенциал различных сортов и клоновых подвоев яблони обусловлен генетически и может прояв­ляться под воздействием внешних факторов только в определенных преде­лах.

В опытах И.В. Бартиша и В.И. Корхового, например, при работе с клоновым подвоем ММ 106 на среде с НУК удалось повысить частоту ре­генерации более, чем на 25%, тог.  наблюдали регенерацию до 47% того же клонового подвоя на среде с ИУК.

Исследования И.В. Бартиша и др. указывают на то, что у клоно­вого подвоя яблони ММ 106 солевой состав среды при оптимальных соотно­шениях экзогенных регуляторов роста действует на частоту регенерации сильнее, чем концентрация ауксина. Однако в отличие от концентрации НУК солевой состав среды не влиял значительно на средние значения числа побе­гов на прорегенерировавший эксплант [3,7].

Способность клеток к морфогенезу определяется не только уровнем эк­зогенных регуляторов роста, но и эндогенных, а также разной реакцией тка­ней на эти гормональные факторы. Одна из главных причин вариабельности в ответе тканей на внешние гормональные факторы определяется различной

способностью тканей синтезировать свои собственные эндогенные фитогормоны. Этим, возможно, объясняется влияние физио­логических факторов на регенерацию адвентивных побегов.

В последние десятилетия все шире для индукции морфогенеза стал ис­пользоваться тидиазурон (TDZ), который считается более активным и ста­бильным, чем адениносодержащие цитокинины. TDZ стимулировал регенерацию листовых дисков яблони и груши. Он более эффективен, чем БАП при концентрации 10 MМ и стимулировал обра­зование адвентивных почек у листовых пластинок яблони. Адвентивные по­беги, вызванные действием TDZ, были компактными, с короткими междоуз­лиями, и этот габитус роста сохранялся в течение нескольких субкультиви­рований даже при пересадке на среду с БАП [9].

Генетическая стабильность. По G. Hussey, В.А. Сидорову, генетическая стабильность растений-регенерантов зависит от многих факторов. Основное влияние на изменчивость растений может оказывать ге­нотип донора, от которого получен эксплант, и метод, используемый для размножения в культуре тканей.

Многие исследователи считают, что наиболее стабильное в генетическом и фенотипическом отношении потомство наблю­дается при размножении через культуру апикальных меристем. Так, напри­мер, было установлено, что при размножении малины из меристем возникало 0,68% отклоняющихся от нормы растений, а при культуре листьев и череш­ков через стадию каллуса — 4,1%. Использование каллусных и суспензион­ных клеток, а также протопластов приводит к широкой наследственной из­менчивости размножаемых клеток. В исследованиях В.Г. Лебедева и др. при регенерации груши из листовых эксплатов не было отмечено отклонений от исходных форм.

В.А. Высоцкий выделяет следующие изменения: генетические, затрагивающие плоидность, а также хромосомные или генные мутации; фенотипические, которые касаются различных морфологических или анатоми­ческих характеристик; онтогенетические, возникающие в результате дезорга­низации слоев ткани в химерных растениях и спонтанного смешения клеток или групп клеток в виде инициации адвентивных побегов из различных слоев ткани.

Существуют различные объяснения изменений в культуре тканей. Наи­более распространенное из них заключается в том, что при культуре in vitro могут происходить генные и хромосомные мутации, число которых возраста­ет в зависимости от длительности культивирования. По данным В.И. Деменко, М.И. Джигадло, Т.П. Огольцовой, М.И., Джигадло, В.Г. Трушечкина вероят­ность мутационных изменений у земляники резко возрастает после шестого пассажа. По мнению В.А. Сидорова, длительное пассирование клеток in vitro способствует повышению генетического разнообразия, как среди культивируемых клеток, так и полученных из них растений.

Часто длительно пассируемые культуры утрачивают способность к морфогенезу. Для предотвращения этих изменений некоторые исследователи предлагают ограничить число субкультивирований.

Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что состав пи­тательной среды и условия культивирования in vitro способны повлиять на последующий габитус, рост, развитие, вегетативную и генеративную продук­тивность растений in vitro.Также не следует отрицать мутагенного влияния ряда соединений, используемых при стерилизации при введении в культуру, стрессового эффекта при травмиро­вании и культивировании in vitro.

Отмечается также, что чем меньше размер экспланта, тем больше от­клонений от исходного типа, но механизм этого явления также убедительно не объяснен. Наиболее- полно объясняет возникновение мутаций, цитокло- нальная теория онтогенеза растений. Согласно этой теории, каждое растение представ­ляет собой совокупность клеточных клонов, в той или иной степени отли­чающихся друг от друга физиологически и генетически. Существует два ос­новных типа различий между клетками, которые связаны: с изменением состояния, их в процессе индивидуального развития растения и его тканей; с неточностью воспроизводства при делении [22].

Изменчивость регенерантов в культуре in vitro в разной степени опре­деляется этими типами различий, в зависимости от того, имеем мы дело с ор­ганизованной частью растения, с неорганизованным каллусом или отдель­ными клетками. В целом растении возникающие «небольшие» различия- как бы усредняются, а клетки с отчетливо отклоняющимся типом реакции вытес­няются или элиминируются совсем. В целом растении наиболее строго по­добный отбор осуществляется в меристемах, ответственных за формирование вегетирующего организма и его будущего потомства. Клетки, отклоняющие­ся от нормы, если не элиминируются полностью, то вытесняются во второ­степенные для воспроизведения покровных тканей, листьев, сердцевины и т.д. В случаях искусственного вегетативного размножения путем отделения той или иной части растения, чем большей оказывается эта часть и чем более жесткий был отбор клеток этой части в целом растении, тем более устойчива составляющая ее клеточная популяция. По мере уменьшения размера отде­ляемой части, а, следовательно, и объема общей клеточной популяции в та­кой же степени снижается способность клеток к нормальной реакции сдер­живать размножение клеток. Особенно «велика возможность» выхода из-под контроля физиологически и генетически отклоняющихся от нормы клеток там, где процент их повышен, т.е. при использовании не меристем, а других частей и тканей растения. В каллусе, где клетки располагаются по отноше­нию друг к другу без какого-либо определенного порядка и не соподчинены друг с другом, действие стабилизирующего норму отбора резко ослаблено. Количество отклоняющихся от нормы клеток не элиминируется, а возраста­ет, особенно по мере увеличения длительности культивирования каллуса.

На основе анализа исследований, проведенных у нас в стране и за ру­бежом, по изучению особенностей регенерации in vitro семечковых культур, можно сделать вывод о том, что сведения о размножении новых перспектив­ных слаборослых подвоев и сортов яблони средней зоны садоводства мало­численны. Размножение груши методом культуры тканей менее изучено, чем яблони и в производственных целях используется очень мало.

В связи с генотипической реакцией на состав питательных сред и гор­мональных веществ использовать уже разработанные технологии размноже­ния in vitro для вновь введенных подвоев и сортов проблематично. Поэтому существующие методики не всегда приемлемы. В частности, значительные трудности возникают уже на этапе введения в культуру in vitro, связанные с системным поражением тканей грибной и бактериальной инфекцией и слож­ностью стерилизации. На этапе собственно микроразмножения существуют такие проблемы, как низкая регенерационная способность отдельных гено­типов, образование верифицированных побегов, ингибирование ростовых процессов фенольными соединениями, получение коротких побегов (менее 1,5 см), непригодных для укоренения, отсутствие технологии длительного хранения. Серьезно осложняют разработку методов регенерации растений in vitro и такие проблемы, как низкий регенерационный потенциал соматиче­ских тканей, спонтанное образование адвентивных структур и плохая вос­производимость результатов. Все эти проблемы требуют дальнейшего изуче­ния и постоянного совершенствования. Поэтому поиск общих закономерно­стей и приемов получения растений-регенерантов из изолированных сомати­ческих тканей яблони и груши является по-прежнему актуальным [6].

 

• Биологические особенности груши

 

 

Груша – одна из распространенных из плодовых культур.

В настоящее время культура груши получила широкое распространение. Ее выращивают более чем в 80 странах мира. Мировое производство плодов груши в 2003 году составило 10-11 млн. т. Половина этого количества приходится на страны Азии, 1/3 часть — на страны Европы и 1/7 — на страны Америки [7].

В насаждениях груши до 50-х годов прошлого века широко был распространен практически один стародавний сорт – Лесная красавица, обладающая превосходным вкусом, ароматом, высокой урожайностью плодов, но совершенно не лежкоспособных.

Определенное место в насаждениях занимал сорт Любимица Клапа. В дополнение к этим не интенсивным сортам в районирование были включены стародавние сорта груши Ароматная и Талгарская красавица. Сорт Талгарская красавица характеризуется очень высокой урожайностью и хорошей лежкоспособностью плодов, благодаря чему районирован также в России и Белоруси [3].

За последние годы помологическим садом Казахского НИИ плодоводства и виноградарства выведены хорошие сорта груши различного срока созревания, с высокими товарными и вкусовыми качествами: Бостандык, Адеми,  Карындас, Нагима, Сувенир, Умит. Достоинством этих отечественных сортов является устойчивость к бактериальным заболеваниям, в частности бактериозу – опасному заболеванию груши в наших условиях. Культура груши представлена видами – груша домашняя (P. domestica Medik), груша уссурийская (P. ussuriensis Maxim). Селекционером С.П. Алексеенко выведены и переданы в ГСИ сорта – Айдана, Нагима, Нурай, Шыгыс и другие [8]. 

В Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в Республике Казахстан, включено 66 сортов яблони, 7 сортов груши [9]. 

Груша – культура умеренного климата. Она характеризуется требовательностью к теплу, от степени зимостойкости зависит урожайность, регулярность плодоношения, рентабельность промышленных насаждений [10]. В период вегетационного роста сорта груши повреждаются заморозками в 3°С, тогда как в период естественного покоя они могут переносить без вреда мороз до 30°С. В период покоя деревья груши наиболее чувствительны к морозам в ноябре и феврале. Критической температурой для молодых завязей груши являются поздневесенние заморозки до 1,5°С, а для распустившихся цветков – до 1,9°С [11, 12].

Дерево груши на протяжении всей своей жизни, имеет разные периоды роста. До начала плодоношения (первые 6-10 лет после прививки) проходит активный рост корней и надземной части дерева. Начало и полное плодоношение (возраст с 10 до 20 лет) – рост деревьев продолжается.  С  20  до  40  лет период наибольшего плодоношения и незначительный рост за счет обрастающих веточек. После 40–45 лет жизни наступает период снижения плодоношения и активного старения. В этот период деревья становятся малопродуктивными и экономически невыгодными для производства [11].

Цветки у груши отличаются по величине, длине, толщине и степени опущенности цветоножки. Большая часть сортов груши имеет средний размер цветка (2-3 см. в диаметре). Корневая система груши состоит из многолетних толстых скелетных корней нескольких порядков, обрастающих тонких коротких корешков, всасывающих или активных корешков. Вертикальные корни идут глубоко в почву, а горизонтальные находятся у её поверхности, сильно ветвятся и обрастают корешками [10].

Время вступления в плодоношение в значительной степени зависит от подвоя. Подвоями для груши служат дикие ее виды, а также айва, черноплодная (арония) и обыкновенная рябина, боярышник, ирга Лучшими семенными подвоями являются сеянцы культурных сортов и местных форм груши [12]. Сорта груши на айве ЕМА (А, МА, Анжерская – Cydonia oblonga) вступают в плодоношение на 4 год после посадки. В качестве слаборослого подвоя для груши применяют вегетативно размножаемые формы айвы типа А, В, С [12,13,14].

Согласно методических указаний, деревья груши на айве начинают плодоносить на 3-5 год. Айва Анжерская наиболее часто используется как подвой для груши. Она хорошо размножается вертикальными отводками, образуя среднее количество корней;  в засушливых условиях корней, нередко, образуется мало, но даже в этом случае пересаженные отводки приживаются удовлетворительно [14].

 

• Способы размножения растений груши

 

 

Выделяют несколько моделей клонального микроразмножения, в зави­симости от коэффициента размножения, надежности в отношении генетиче­ской стабильности растений, использования для определенного круга расте­ний по-разному классифицируют эти модели в зависимости от морфогенетических реакций в культуре изоли­рованной ткани. Среди моделей заслуживают внимание следующие:

• индукция развития пазушных меристем;
• развитие адвентивных побегов из тканей эксплантов;

   3) индукция органогенеза* или соматического эмбриогенеза из каллуса тканей растений. Иногда в отдельную модель выделяют культуру пыльников, хотя ее можно отнести ко 2 или 3- ей моделям:

Наибольшее распространение получила первая модель размножения, основанная на индукции пазушных меристем за счет снятия апикального до­минирования с помощью цитокининов, либо за счет удаления верхушки и микрочеренкования. Впервые эта модель была разработана Первая модель нашла широкое распространение для производства оздоровленного безвирусного посадочного материала, боль­шинства сельскохозяйственных культур, в том числе и плодово-ягодных: яб­лони, груши, вишни, сливы, винограда, земляники, малины, смородины, крыжовника и др.

Вторая модель микроразмножения основана на формировании адвен­тивных почек из меристематических тканей экспланта, взятых из различных частей и органов растений. Индукция адвентивного органогенеза может быть использована для размножения аспарагуса, хризантемы, фрезии, герберы, земляники, большинства луковичных культур и других видов растений. Раз­работка этой модели микроразмножения в настоящее время особенно акту­альна в связи с развитием метода генной инженерии, возможности которой в настоящее время ограничены из-за отсутствия эффективных способов реге­нерации из соматических тканей. У многих видов плодовых и ягодных куль­тур регенерация растений из соматических тканей носит спонтанный харак­тер. Применение этой модели может быть весьма эффективно для тех куль­тур, которые слишком медленно формируют пазушные побеги (хвойные, различные декоративные и луковичные). Регенерация адвентивных почек и побегов in vitro позволяют исключить повторную стерилизацию тканей, зна­чительно увеличить коэффициент размножения и тем самым наиболее полно реализовать потенциал растительного организма к размножению. Третья модель микроразмножения основана на дифференциации из со­матических клеток зародышеподобных структур, которые получили название соматического эмбриогенеза, и на формировании адвентивных побегов в каллусных тканях. Используют для размножения большинства растений из се­мейства Orchidaceae и Rutaceae, а также для некоторых представителей зла­ков.

При микроразмножении с использованием развития адвентивных почек из тканей экспланта и индукции эмбриогенеза в каллусе и суспензии клеток вероятность возникновения генетических отклонений возрастает.

В практике существуют три наиболее распространеннных биотехнологических методов сохранения плодовых культур. В  этом разделе мы  хотим раскрыть сущность этих методов, так как наша задача изучить сохранение генофонда груши с помощью биотехнологических методов. При изучении вышеуказанной задачи мы использовали  следующие методы:

Современные методы биотехнологии позволили значительно повысить  эффективность клонирования растений. Исследования в области культивирования соматических тканей привели к разработке принципиально новых методов размножения –  клональное микроразмножение. В сущности, эти методы аналогичны вегетативному способу размножения и различаются лишь тем, что весь процесс протекает в условиях in vitro [7].

Главное условие клонального микроразмножения – получение in vitro растений, полностью сохраняющих генетическую однородность. Поэтому для этих целей предпочтительнее использовать культуру апексов (меристематических верхушек), т.к. в условиях in vitro они являются генетически стабильными, и пролиферирующие ткани всегда остаются диплоидными. Клональное микроразмножение является эффективным способом вегетативного размножения, позволяющим быстро тиражировать отдельные генотипы, получать оздоровленный материал и, главное, сокращать сроки селекционного процесса [30].

В настоящее время все большую актуальность приобретают различные способы микроклонального размножения сельскохозяйственных культур (прежде всего вегетативно размножаемых) в системе in vitro: размножение пазушными и адвентивными почками, непрямой морфогенез, соматический эмбриогенез.  Использование этих методов дает возможность: получать за короткий срок оздоровленного, безвирусного материала, генетически идентичного материнскому растению; работать в лабораторных условиях и поддерживать активно растущие растения круглый год; размножать растения практически без контакта с внешней средой, что исключает воздействие неблагоприятных абиотических и биотических факторов; получать максимальное число растений с единицы площади; в короткий срок получать большое число растений трудноразмножаемых или вегетативно не размножаемых; длительно (1-3 лет) сохранять растительный материал в условиях in vitro. Для любого типа регенерации in vitro можно выделить четыре группы факторов, определяющих ее успех: генотип и состояния исходного материала, условия и методы культивирования, состав питательных сред, особенности введения экспланта в стерильную культуру [8].

Дерево груши об­ладает большой долговечностью; у него прочные скелетные ветви, подтянутые вверх и составляющие компактную пирамидальную крону. В молодом возрасте деревья имеют, по преимуществу, узко­пирамидальную форму; со вступлением в период плодоношения крона расширяется, а в период полного плодоношения становится еще шире. Ствол сохраняется в течение длительного времени и отмирает значительно позднее, чем у яблони. Он покрыт шероховатой корой темно-серого цвета с различными оттенками. У старых деревьев кора на штамбе и у основания скелетных ветвей покрыта глубокими продольными бороздками и поперечными трещинами. На попе­речных трещинах края чешуи не отворачиваются наружу, как у яб­лони. Древесина у груши белая с различными красно-бурыми от­тенками. На юге дерево достигает высоты 12… 15 м, в средней поло­се — 5…6 м.

Побеги у груши неопушенные; они бывают зелеными, сероваты­ми, коричнево-бурыми, оливково-желтыми, желтыми, розовыми, лиловыми. По направлению и толщине побеги бывают прямыми, коленчатыми, дугообразными, толстыми, средними, тонкими, по длине — короткими и длинными, по характеру окружности круг­лыми и гранеными. Кора на побегах у большинства сортов неопу-шенная, у некоторых сортов в молодом возрасте она опушенная, а во взрослом неопушенная.

Листорасположение у груши очередное. Перед распусканием почки каждая половина листа свернута в трубку. Листья простые; редко встречаются перисторассеченные или лопастные листья. Форма листовой пластинки варьирует от линейно-ланцетной до округлой. Поверхность листовой пластинки сверху блестящая, сни­зу опушенная. Края листа цельные или зазубренные. Соцветие — щиток из 4… 17 цветков (у большинства сортов в соцветии 5… 10 цветков). По диаметру выделяют крупные (3…4 см), средние (2…3 см) и мелкие (менее 2 см) цветки. Цветки сидят на от­дельных цветоножках или группами, по 3…4 на одной цветоножке. Цветки обоеполые, состоят из чашечки, венчика, тычинок и пести­ка. Лепестки белые, иногда с розовым оттенком, округлые, обратнояйцевидные или овальные. Тычинок 15…30; расположены они в 3 ряда. Пыльники красно-фиолетовые, двухгнездные.

Плоды бывают удлиненными, грушевидными, округлыми, обратнояйцевидными, коническими и др. Стенки семенных камер плода перепончатые, мягкие. Семенное гнездо часто окружено ка­менистыми клетками, которые снижают качество плода. Семена округлые или заостренные, различного размера, по преимуществу коричневой окраски.

Груша по характеру роста и плодоношения во многом сходна с яблоней, но отличается от нее более высокой пробудимостью почек и слабой или средней побегообразовательной способностью, ин­тенсивным ростом молодых растений и сильно выраженной стволовостью в результате естественного преобладания проводника. Вследствие этого у груши образуются высокие кроны, имеющие ко­нусовидные и пирамидальные формы. У некоторых сортов крона раскидисто-шаровидная. В целом крона довольно хорошо складывается естественно; она менее загущенная, светлая и более прочная, чем у яблони. Взрослое дерево обладает высокой побеговосстановительной способностью.

Строение надземной части дерева и корневой си­стемы груши имеет много общего с яблоней. Однако верти­кальные корни груши уходят значительно глубже в почву и меньше ветвятся. Корневые волоски слабо развиты.

Надземная часть дерева груши имеет резко выраженный ствол и более сжатую форму кроны. Широкая или поник­лая крона встречается редко. С возрастом она приобретает округлую, даже раскидистую форму.

У груши различают три типа плодовых образований: кольчагки, копьеца и плодовые прутики.

Биологическая возбудимость почек, особенно спящих, у груши выше, чем у яблони. По внутреннему строению и форме почки делят на вегетативные (листовые и ростовые) и цветковые. Листовые почки формируются в пазухах листьев однолетних побегов. Из них, как правило, формируются листья, иногда побеги или будущие кольчатки.

Ростовые почки закладываются на концах ростовых по­бегов, имеют более крупный размер и заостренную вер­хушку. истья у культурных сортов груши чаще бывают яйце­видные и широкояйцевидные, неопушенные, темно-зеленые, блестящие, цельнокрайные, плоские или с волнистыми края­ми. Иногда листовые пластинки вогнуты лодочкой.

Груша относится к перекрестноопыляющимся растениям.
Лепестки обычно бе­лые, а пыльники — красные. Плоды груши различают­ся по форме, величине и окраске. Плодоношение на­чинается на 6—9-й год пос­ле посадки. Фенологические фазы развития у груши та­кие же, как у яблони, и проходят в той же последо­вательности. Однако распускание почек и цветение у груши начинается на 5—7 дней раньше, чем у яблони.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

 

2.1 Объекты исследований

 

 

Объектами исследования служили отечественные сорта груши: Талгарская Красавица и Нагима из коллекции Помологического сада КазНИИ плодоводства и виноградарства. Верхушки побегов и черенки груш были собраны на участках Помологического сада.

Описание некоторых районированных сортов груши

Нагима – Сорт Казахского НИИ плодоводства и виноградарства. Крона дерева широкопирамидальная с несколько отвисающими ветвями. Плодоносит на простых и сложных кольчатках. В пору плодоношения деревья, привитые на сильнорослых подвоях, вступают на 6-7 год. Плоды выше средней величины. Основная окраска плодов зеленовато-желтая с ярким красивым румянцем на солнечной стороне. Мякоть желтовато-белая, сочная, маслянистая, кисло-сладкая высоких вкусовых достоинств. Съемная зрелость плодов наступает в конце августа, лежкость 15-20 дней. Урожайность высокая. Наиболее полно требованиям сорта Лесная красавица отвечают условия предгорной и нижнегорной зон Алматинской области (Карасайский, Енбекшиказахский, Талгарский, Талдыкорганский, Саркандский районы). Оптимальная схема посадки в сад сорта Лесная красавица, привитого на сильнорослых подвоях 8 х 6м.

Талгарская красавица — Сорт Казахского НИИ плодоводства и виноградарства получен из семян от свободного опыления сорта Лесная красавица. Районирован в Алматинской, Южно-Казахстанской и Кызылординской областях.

Сорт хорошо адаптирован к зимним условиям юго-востока Казахстана. Наиболее устойчив к заболеваниям такие как, мучнистая роса и парша. Крона дерева широкопирамидальная, средней густоты со свисающими ветвями. Преобладающий тип плодовых образований – кольчатки. В плодоношение деревья вступают на 4-5 год.

 Плодоносят выше средней величины, удлиненно-грушевидной формы. Основная окраска плодов светло-желтая с красным карминовым румянцем на солнечной стороне (рисунок 1). Мякоть кремовая, средней плотности, хрустящая, сочная, сладкая, хорошего вкуса. Съемная зрелость плодов наступает в середине сентября, Хранятся до января месяца. Урожайность высокая. Наиболее полно требованиям сорта Талгарская красавица отвечают условия предгорной и нижнегорной зон Алматинской области (Карасайский, Енбекшиказахский, Талгарский, Талдыкорганский, Саркандский районы). Оптимальная схема посадки в сад сорта Талгарская красавица, привитый на дикой лесной груше 8 х 6м, на айве 6 х 4м.

 

Рисунок 1. Сорт Нагима

 

Помологический сад КазНИИ плодоводства и виноградарства расположен в предгорьях Заилийского Алатау на высоте 1015 м над ур. моря. Климат района умеренно – континентальный.

Согласно среднемноголетним данным последний весенний заморозок, здесь приходится на 3 мая, первый осенний на 30 сентября. Продолжительность безморозного периода составляет 149 дней. Переход среднесуточной температуры воздуха через 10⁰С, весной 17 апреля, осенью 5 октября, период температурой выше 10⁰С составляет 170 дней (таблица 1).Переход среднесуточной температуры воздуха через 15⁰С приходится весной на 14 мая, а осенью на 14 сентября (продолжительность периода 122 дня). Среднемесячная температура июля +21,6, января +7,2⁰С. Абсолютный годовой максимум температуры воздуха равен +40. Абсолютный годовой минимум (- 37) отмечен в феврале месяце (таблица 2). Абсолютный годовой максимум отмечен в июле и августе (+40⁰С). Максимальная относительная влажность воздуха, согласно среднемноголетним данным отмечено в феврале, декабре (75%), а  низкая влажность воздуха в августе (44%).

 

Таблица 1

Дата последнего и первого заморозков в воздухе и продолжительность безморозного периода

Дата последнего заморозка весной	Дата первого заморозка осенью	Продолжительность безморозного периода, дни	Дата перехода среднесуточной температуры воздуха ±100С, ± 150С и продолжительность безморозного периода (дни) выше этих градусов
			100С		150С
3.V	30.IX	149	17.IV-5.X	170	14.V-14.IX	122

 

В зимний период преобладает ясная погода. В наиболее сухие и малоснежные зимы, почва может промерзать на глубине  1 м и более. Длительность периода с устойчивым снежным покровом, равна 75 дням. Установление снежного покрова по годам колеблется от 25 до 45 см.

 

Таблица 2

Среднемноголетние показатели климата (Помологический сад 1015 м над ур.моря)

Показатели	I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII	IX	X	XI	XII	За год
Среднемесячная температура воздуха, 0С	-7,2	-5,4	1.3	9,6	16	18,2	21,6	20,2	15,1	7,6	— 0,2	-4,5	7,7
Абсолютный min  температуры воздуха, 0С	33,0	-37	26	– 9	0	6	2	0,6	-1,6	-3,6	-15	-32	-37
Абсолютный max температуры  воздуха, 0С	17	19	26	32	35	38	40	40	33	31	23	18	40
Относительная влажность воздуха, %	74	75	73	60	56	50	45	44	47	58	71	75	61
Количество осадков, мм	32	34	72	107	109	66	42	28	30	52	65	38	675

 

Весна наступает рано, в начале марта и отличается небольшой продолжительностью 22-44 дням, максимум 52 дня, с быстрым подъемом температур солнечной радиацией. Однако весенний сезон не устойчив в мае  месяце, так как возможен вторжение холодных ветров или выпадением осадков в виде снега. Весна влажный сезон, в это время  ярко выражен максимум осадков (по среднемесячным показателям) выпадает в апреле  (107 мм) и в мае (109мм), самое наименьшее количество в сентябре.

Устойчивый теплый период, за исключением, бывающих в отдельные годы поздних радиационных заморозков начинается с апреля месяца и заканчивается в сентябре. Для лета, характерна жаркая погода, средняя температура воздуха в июль составляет +21,6 ⁰С, минимальная среднемесячная температура отмечена  в январе (– 7,2 ⁰С). Спад температуры воздуха осенью сначала идет медленно, затем усиливается. Во второй половине осени наблюдается увеличение облачности. Понижение температуры ощущается в октябре месяце.

Климатические условия года проведение опыта характеризовались затяжной, холодной, дождливой весной. В конце первой декады апреля, было выпадение снега (с 11 по 18 апреля) с пониженной температуры до -17 ⁰С. В летнее время наблюдались частые дожди, медленное нарастание тепла. В июле практически без дождей устанавливалась жаркая, засушливая  погода, которая продолжалась до конца августа.

В таблице 3 приведена сумма активных среднесуточных температур. В таблице 4 приведена среднемесячная  температура почвы (⁰С) на различной глубине.

Климатические условия 2014 года характеризовались не типичными условиями  (последний весенний заморозок был 7 апреля -10 ⁰С). В целом погодные условия благоприятствовали для закладки  опытов по плодовым культурам.

Территория Помологического сада расположена в полосе предгорий Заилийского Алатау. По устройству поверхности, территория  хозяйства относится к предгорной наклонной равнине.

 

2.2 Регенерация груши из пазушных меристем

 

 

Для вычленения меристематических тканей, использовали активно рас­тущие верхушки побегов. Отобранный материал мыли сначала хозяйствен­ным мылом, затем промывали в течение часа водопроводной водой, далее дистиллированной. Стерилизацию растительных тканей проводили;  6% рас­твором гипохлорита кальция в течение 3-6 минут или 0,4% раствором нитра­та ртути в течение 45-60 секунд. Затем промывали 4-5 раз стерильной дис­тиллированной водой 20 минут. Исходными эксплантами служили меристе- матические верхушки размером 0,5-1,5 мм.

На этапах введения в культуру in vitro и собственно микроразмножения использовали минеральную основу сред Мурасиге-Скуга, , Гамборга, Кворина- Лепуавра,  Ллойда-Маккауна с добавками, мг/л: мезоинозит — 100, сахароза — 30000, аскорбиновая кислота- 1,5, тиамин HCl,, пиридоксин HCl,, никотиновая кислота по 0,5, агар — 8000, рН-5,8.

Основными регуляторами роста на этапах микроразмножения служили, мг/л: БАП- 0,5-3,0; ГК — 0,02-0,5; ИМК — 0,02-0,1; ТЭг — 0,5; кинетин — 5-10; зеатин — 5; аденин-сульфат  — 50-100; антиоксиданты (аскорбиновая и лимон­ная кислоты — по 20; поливинилпирролидон -30).

Субкультивирование эксплантов на свежую питательную среду прово­дили через 4-8 недель.

Растения культивировали при температуре воздуха +24±2° С, освещен­ности 2-3 тыс. люксов, 16-часовом фотопериоде. Анализ этапа введения экс­плантов в культуру проводили по 4 фазам:

-слабое увеличение апексов в размерах;

-слабый линейный рост, раскрытие 2-3 примордий;

-образование розетки с листьями и почками;

-формирование конгломератов почек и побегов длиной свыше 1 см.

Погибшие и инфицированные экспланты учитывали отдельно. Оконча­тельная оценка опытов проводилась по количеству полученных клонов.

Этап пролиферации оценивали по количеству «клубочков», пригодных к клонированию, коэффициенту размножения, который подсчитывали путем деления количества побегов на количество исходных эксплантов, и количе­ству побегов >1,5 см [20].

 

2.3 Адвентивный органогенез груши

 

Основными эксплантами служили листовые пластинки культивируе­мых in vitro растений. У листовых пластинок с черешками делали попереч­ные надрезы жилок, адаксиально (верхней стороной) помещали на питатель­ные среды. В ряде опытов, кроме листовых пластинок, в качестве эксплантов использовали сегменты стеблей (междоузлий) и корней размером 5-6 мм. Экспланты культивировали на средах Мурасиге-Скуга (МС), Ллойда- Маккауна (WPM), Гамборга (В₅) с добав­ками (мг/л): тиамин НС1„ пиридоксин НС1„ никотиновая кислота по 0,5, ас­корбиновая кислота — 1,5, сахароза 30000, мезоинозит — 100, агар — 8000; рН- 5,8. Основными регуляторами роста служили: цитокинины — БАП (1,0-3,0 мг/л), тидиазурон (2,0 мг/л); ауксины — ИМК (0,1 мг/л), НУК (0,1 мг/л), 2,4-Д (0,1 мг/л). В течение первых 2 недель экспланты культивировали в темноте, потом переносили в обычные условия культивирования. У адвентивных новообразований отмечали начало формирования кал­луса и адвентивных побегов, по окончанию опыта — количество эксплантов с побегами, количество побегов на эксплант, расположение зон регенерации.

Эксперименты продолжались 8-12 недель.

Опыты проводили в трехкратной повторности, по 10-15 эксплантов в варианте.

 

 

 

 

 

 

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

3.1 Регенерационная способность изолируемого экспланта в зависимости от морфологических и биологических особенностей растений груши

 

 

Стерилизация растительного материала. Очень важно тщательно отстерилизовать исходный растительный материал от грибов, бактерий, ми- коплазм. Для этого используют растворы хлорсодержащих и ртутных препа­ратов таких, как сулему, диацид, гипохлорит кальция, калия, натрия и т.д. В связи с тем, что многие древесные растения содержат внутреннюю инфекцию, особенно бактериальную, которая может проявляться даже через 3 месяца культивирования  рекомендуют использо­вать антибиотики и системные фунгициды.

В наших исследованиях вычленение эксплантов проводили в фазу ак­тивного роста побегов. Для стерилизации сортов груши Нагима, Талгаркая Красавица использовали 6% раствор гипохлорита кальция в течение 3-6 минут и 0,4% раствор нитрата ртути в те­чение 45-50 секунд. Максимальное количество инфицированных эксплантов в течение первой недели культивирования было отмечено при использовании гипохлорита кальция (47,5%), тогда как при применении нитрата ртути это количество снизилось до 25,0% (таблица 3).

 

Таблица 3

Влияние стерилизатора на регенерацию меристематических верхушек

					Регенерировано, %
Cорт	Стерилизатор	Экспозиция	Инфицировано, %	Гибель, %	всего	из них дос­тигло 34 фаз раза
Нагима	6% гипохлорит кальция	Змин	17,5	75,0	7,5 е	66,6 bс
	0,4% раствор нитрата ртути	50с	0,0	40,0	60,0  аbс	100,0 а
Талгарская Красавица	6% гипохлорит кальция	Змин	17,5	65,0	17,5	38,5 с
	0,4% раствор нитрата ртути	50с	25,0	30,0	45,0	61,5сс

 

 

Немаловажное значение имеет такой показатель, как количество по­гибших эксплантов. Этот показатель зависит, как от технических возможно­стей экспериментатора, так от стерилизующего реагента. Максимальное ко­личество таких эксплантов наблюдалось при использовании гипохлорита кальция. Анализ регенерационной способности эксплантов через месяц после введения в культуру in vitro показал, что лучше всего морфогенез происхо­дил при использовании нитрата ртути, где больше всего эксплантов регене­рировало (до 80,0%) и достигло 3 и 4 фаз развития [13].

Сроки вычленения эксплантов. Для изучения сроков вычленения эксплантов груши сортов в наших исследованиях ис­пользовали вегетирующие-побеги (июнь — контроль), верхушки побегов, за­кончившие рост (август), и развившихся из почек одревесневших побегов после хранения их при пониженных температурах в течение зимы (март). В разные сроки проявилась различная регенерационная способность эксплан­тов, максимум ее наблюдался в фазу активного роста в июньский срок (табл. 4). При этом сроке вычленения происходил более интенсивный рост эксплан­тов, чем у вычлененных в фазы выхода растений из состояния покоя (март) и затухания роста (август). Скорость разрастания эксплантов июньского срока значительно опережает рост эксплантов мартовского и августовского сроков. При вычленении в июне уже через 3 месяца культивирования от 83,3 до 100,0% эксплантов, в зависимости от формы, достигало наивысшей фазы развития — формирования клубков, тогда как в августе их было 12,5 — 35,0%. Образования конгломератов совсем не было отмечено в мартовский срок.

Объясняется тем, что меристематические верхушки в фазу активного роста характеризуются большей оводненностью клеток, слабым развитием механических тканей, меньшим уров­нем лигнификации клеточных стенок, в балансе гормональных веществ (аук­синов и ингибиторов) преобладают ауксины. Все эти факторы и другие осо­бенности физиологического и биохимического характера положительно влияют на процесс роста эксплантов. По мере затухания роста побегов на ма­точных растениях регенерационная способность меристематических верху­шек проявляется слабее [20].

Местоположение вычленяемого экспланта на побеге также влияет на их приживаемость в начале культивирования и на способность к регене­рации в дальнейшем. Так, у малины было отмечено пропорциональное уве­личение, почти в два раза, количества образовавшихся побегов из верхушеч­ных почек.

Лучшей регенерационной способностью обладали верхушечные почки, которые все без исключения после 1 месяца культиви­рования достигли 3 и 4-ой фаз развития. Такое неодинаковое развитие можно объяснить как морфологической неоднозначностью почек, так и их различным физиологическим состоянием [22].

Размер экспланта. Одно из главных направлений использования ме­тодов in vitro является элиминация вирусных болезней. По мнению ученых, основной причиной возможного оздоровления от вирус­ных инфекций является наличие градиента концентрации вирусных частиц в тканях растений. По их данным, оздоровление возможно, когда выделяют апекс максимум с двумя листовыми примордиями размером 0,1-0,15 мм. Апикальные ткани практически не содержат вирусных частиц. Эффектив­ность оздоровления от вирусов связана с размером выделяемых эксплантов. Однако с практической точки зрения выделение такого апекса (0,1-0,15 мм) проблематично и, кроме того, они часто гибнут и плохо регенерируют. Круп­ные экспланты отличаются быстрым пробуждением, высоким коэффициен­том размножения уже в 1-2 пассажах и более простой манипуляцией при введении в культуру in vitro. Поэтому, если нет цели оздоровления, для мас­сового размножения при введении в культуру in vitro используют более крупные экспланты [23].

Проведенное нами сравнительное изучение регенерационного потен­циала эксплантов груши разного размера (0,5; 1,0; 1,5) свидетельствовало о том, что от размера экс­планта зависит не только степень регенерации, но и их инфицированность (табл. 5). Чем больше размер вводимых в культуру эксплантов, тем выше их инфицированность, но меньше гибель и тем выше регенерационная способ­ность, которая выражается в более быстром достижении ими 3-4 фаз разви­тия. При размере вводимого в культуру in vitro экспланта 1,5 мм клонирова­ние возможно уже в 1 пассаже через 4-6 недель культивирования. Более вы­сокая регенерационная способность эксплантов большего размера объясняет­ся тем, что такие экспланты имеют проводящие ткани камбия, состоящие из паренхимы, которые могут вне зависимости от гормонального состава пита­тельной среды спонтанно образовывать почки [19].

 

Таблица 4

 Регенерация эксплантов в зависимости от размера меристематических верхушек

	Размеры Эксплантов мм,	Инфици- ровано,%	Гибель, %	Получено в  пассажах,%			Коэффициент   размножения шт.
Сорт				всего	1	2		3
	0,5	5,0	65,0	30, с	0,0	3,0		97,0	4,0
Нагима	1,0	12,0 .	50,0	38, ab	0,0	55,0		45,0	4,5
	1Д	20,0	40,0	40, а	3,0	72,0		15,0	5,5
Талгарская Красавица	1,0	10,0	66,0:	14, q	0,0	5,0		95,0	4,5
	1,0	45,0	40,0	20, ef	0,0	70,0		30,0	53
	1,5	60,0	14,0	26, e d	12,0	80,0		8,0	6,5

3.2 Влияние химических компонентов питательной среды на меристематическую активность эксплантов

 

 

Регуляторы роста. В основе клонального микроразмножения растений лежит регуляция морфогенеза с помощью экзогенных регуляторов роста. Наиболее важны среди них цитокинины, ауксины, гиббереллины, абсцизовая кислота.

По литературным данным нет единого мнения о необходимости введе­ния того или иного регулятора роста. Одни авторы считают, что для каждого сорта и подвоя концентрация ИМК, на­пример, индивидуальна. По мнению других, обязательным компонентом среды на этапе введе­ния в культуру in vitro являются цитокинины. Их роль определяется как пер­востепенная, т.к. они снимают апикальное доминирование и индуцируют дифференциацию клеток.

>

В исследованиях, проведенных нами установлено, что лучше регенерация меристематических верху­шек проходила на контрольной среде, содержащей только БАП в концентра­ции 0,5 мг/л. Совместное введение на фоне БАП ИМК (0,02 мг/л) или ИМК и ГК (по 0,02 мг/л) не стимулировало морфогенез. Через 6 недель культивиро­вания на среде с 0,5 мг/л БАП образовывалось как максимальное количество эксплантов, достигших 3-4 фаз развития 62,5%, так и количество побегов на эксплант до 5,5 шт. (таблица 6).

 

Таблица 6

Регенерация меристематических верхушек в зависимости от содержания регуляторов роста

Сорт	Регуляторы рос­та, мг/л	Регенерировало через 6 не­дель, %		Коэффициент размножения, шт.
		Всего	из них достигло 3- 4фазразвигия
Нагима	БАП 0,5 (контроль)	100,0 а	57,1 b	5,5
	БАП 0,5+ИМК 0,02	100,0 а	40,0	3,8
	БАПИМК 0,02	100,0 а	40,е	4,5
Талгарская Красавица	БАП 0,5 (контроль)	913 bс	62fа	4,5
	БАП 0,5 +ИМК 0,02	92,8 b	45,5 сс1	3,4
	БАП+ИМК 0,02+ ГК 0,02	923с	47,5 с	3,8
НСР				Фак г<р1еср

 

На средах с ИМК наблюдалось формирование незначительного каллу­са, а при добавлении к среде помимо ИМК и ГК образование каллусной тка­ни было значительным. В результате чего происходило обрастание меристем и проводящей системы каллусом, прекращение доступа питательных веществ из среды, игибирование процесса морфогенеза меристематических тканей и как следствие, уменьшение количества эксплантов, достигших 3-4 фаз разви­тия [11].

 

3.3  Особенности  влияния биологически активных веществ на     морфогенез плодовых культур на этапе пролиферации

 

 

Основная цель этого этапа — получение наибольшего количества качественных побегов от каждого экспланта путем последовательного субкульти­вирования (через 5-8 недель) уже имеющихся побегов на свежую питатель­ную среду. В решении этой проблемы определенную роль играют такие фак­торы, как сортовые и родовые особенности растений, происхождение экс­плантов, ориентация их на среде, минеральный и углеводный состав пита­тельной среды, содержание биологически активных веществ, особенно цитокининов.

Цитокинины. Скорость размножения и степень пролиферации обычно контролируют типом цитокинина и его концентрацией. Цитокинины — это обширная группа природных и синтетических соединений, которые в малых дозах активно влияют на обмен веществ высших растений, способствуют снятию апикального доминирования и увеличению коэффициента размноже­ния за счет развития пазушных меристем.

Для плодовых культур чаще используют 6-бензиламинопурин (БАП), реже кинетин. В последнее время стали использовать тидиазурон, а также зеатин.

Изучение влияния БАП (2,0 мг/л)- контроль, кинетина (5,0 мг/л), тидиа- зурона (0,5 мг/л), зеатина (5,0 мг/л) на пролиферацию сортов груши показало, что реакция растений на цитокинин различна и зависит не только от его типа и концентрации, но и от породы, сорта, (табл. 9).

В этом опыте установлена зависимость между типом цитокинина и количеством побегов, пошедших на укоренение: Так, например, на среде с БАП

• 2,0 мг/л, происходило снижение данного показателя до 12%, а у отдельных на этой среде вообще не образовывались микропобеги длиной 1,5 см. В тоже время у сорта Нагима на этой среде наблюдалось фор­мирование значительного количества таких побегов (более 90%). Зеатин уси­ливал рост побегов и способствовал образованию их большого количества и оптимальной для укоренения длины. Кинетин, как более слабый цитокинин, вызывал удлинение побегов и, как следствие этого; образовывал наивысшее количество побегов, пригодных для укоренения (до 100%), но имел минимальный коэффициент размножения (1,0-1,5). Специфичное действие оказывал тидиазурон, который, хотя и уве­личивал коэффициент размножения (до 8,3), но способствовал образованию очень мелких побегов с видоизмененными листьями, которые не могут быть пригодны для укоренения. По-видимому, это связано с его высокой активно­стью, использовать тидиазурон возможно только в очень малых концентра­циях (менее 0,5 мг/л) [24].

Таким образом, было установлено, что выбор того или иного цитоки­нина зависит от генотипа. Однако в связи с тем, что на среде с БАП (2,0 мг/л) наблюдалось формирование максимального количество нормально развитых побегов на эксплант (до 7,2) в дальнейших исследованиях мы использовали в основном БАП, что соответсвует исследованиям других авторов [21].

Изучение различных концентраций БАП (1,0; 2,0 — контроль; 3,0 мг/л) показало, что пролиферация побегов в значительной степени зависит от концентрации цитокинина в среде и времени его воздействия. Повышение концентрации БАП от 1,0 до 3,0 мг/л приводит к увеличе­нию коэффициента размножения.

Изучение различных концентраций БАП (1,0; 2,0 — контроль; 3,0 мг/л) показало, что пролиферация побегов в значительной степени зависит от концентрации цитокинина в среде и времени его воздействия.

В то же время с увеличением содержания БАП в среде происходило уменьшение в 2 раза количества микропобегов оптимальной для укоренения длины. При длительном культивировании эксплантов на средах с высоким содержанием БАП наблюдалось образование очень коротких побегов. Такие побеги не могут быть использованы для укоренения. С целью получения максимального количества побегов пригодной для укоренения длины, был заложен опыт по длительности культивирования, когда экспланты через 3 недели пересаживали с БАП — 1,0; 2,0/л, 3,0 мг/л на среду без гормонов. При таком субкультивировании во всех вариантах опыта происходило уменьше­ние в 1,7-2,8 раза коэффициента размножения и увеличение количества побе­гов, пригодных для укоренения по сравнению с вариантами, содержащими в среде БАП 2,0 — 3,0 мг/л постоянно.

Кроме того, постоянное присутствие в составе среды повышенных концентраций БАП вызывает образование витрифицированных побегов, со­стояние известное как стекловидность (рисунок 2).

 

 

 

Рисунок 2. Регенерация  побегов сорта Нагима

 

При этом не только нарушается технологический цикл получения растений-регенерантов, но и теряется растительный материал in vitro. К основ­ным признакам верифицированных побегов относят сильную обводнен­ность листьев и стебля, вследствие чего побеги становятся прозрачными. Листовые пластинки часто недоразвиты и скручены в трубочку, а основание стебля сильно разрастается. При субкультивировании витрифицированных побегов теряется способность к ветвлению и укоренению. Исследователи по- разному объясняют механизм этого процесса и предлагают возможные пути преодоления этой еще нерешенной проблемы. например, считает, что на уровень витрификации влияют NH цитокинины и этилены, присутствующие в избытке. На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

— влияние цитокининов на этапе собственно микроразмножения явля­ ется основополагающим;

— правильный выбор цитокинина зависит от генотипа;

— целесообразно’для массового размножения использовать БАЛ в концентрации 2,0 мг/л;

— для решения проблемы витрификации необходимо снижать содержание БАП в среде до 0,5 мг/л или вводить кинетин в концентрации 5,0 мг/л;

— перед укоренением необходимо использовать промежуточное субкультивирование на среду с БАП 1,0 мг/л.

        Введение такого промежуточного этапа позволяет увеличить количест­во микрочеренков, длина которых превышает 1,5 см. К тому же низкое со­держание БАП уменьшает его последействие на процесс ризогенеза на этапе укоренения [5,18].

Аденин-сульфат. Некоторые исследователи с при мик­роразмножении плодовых культур рекомендуют наряду с цитокининами вво­дить в состав среды и производные аденина — аденин-сульфат в концентра­ции 100-150-мг/л. Аденин, как известно, составляет основу молекулы цито­кинина.

Положительное влияние на пролиферацию побегов яблони и груши было отмечено в наших исследованиях при добавлении к среде с 2,0 мг/л БАП (контроль) аденин-сульфата в концентрациях 50 и 100 мг/л, которое так­же носило генотипический характер (рисунок 3).

 У сорта Нагима разница в коэффициентах размножения при добавлении аденин-сульфата была не существенной, но несколько выше, чем без него.         Кроме того, аденин-сульфат позволил повысить качество микрочерен­ков за счет увеличения длины побегов и количества листьев на эксплант у всех изучаемых форм, что в свою очередь может положительно влиять на ризогенез на этапе укоренения.

Гиббереллин. Наряду с цитокининами при микроразмножении яблони и груши на этапе пролиферации используют гиббереллины и ауксины. Из­вестно, что основным свойством гиббереллинов является стимуляция роста растений в высоту за счет повышения митотической активности меристематической ткани.

Механизм действия этого процесса до конца не изучен, однако уста­новлено, что гиббереллины повышают уровень ауксина, и, как следствие это­го происходит стимуляция клеточного деления и растяжение клеток. В литературе нет единого мнения о необходимости исполь зования гиббереллина (ГК) на этапе собственно микроразмножения. По мне­нию одних авторов, присутствие ГК, наряду с БАП, является обязательным. По мнению других наоборот, не следует вводить в состав среды ГК в сочетании с БАП.

 

Рисунок 3 — Влияние регуляторов роста на пролиферацию побегов груши

Нами был заложен опыт по изучению влияния ГК на регенерацию и удлинение побегов. Для этого на фоне 2,0 мг/л БАП — контроль и 5,0 мг/л кинетина вводили 0,5 мг/л ГК. Лучше всего формирование дополнительных пазушных побегов проис­ходило на среде с БАП 2,0 мг/л, где коэффициент размножения варьировал в зависимости от генотипа от 5,3 до 2,1 и был выше, чем в остальных вариан­тах опыта [15].

 Однако не все побеги на среде с БАП 2,0 мг/л имели оптимальную для укоренения длину. Максимальное количество побегов (до 72,0%), пригодных для укоренения, у всех изучаемых форм образовывалось на среде с кинетином в концентрации 5,0 мг/л. Однако в этом варианте происходило снижение коэффициента размножения в 1,1-1,6 раза по сравнению с БАП 2 мг/л.

В этом опыте также отмечена генотипическая реакция побегов. Так, например, низкой регенерационной способностью вне зависимости от состава питательной среды. Коэффициент размножения этой формы-варьировал от 1,3 до 2,1, а количество побегов, пригодных для укоренения, составило всего лишь 7,7 % даже на среде с кинетином, тогда как в остальных вариантах образовывались побеги, размером менее 1 см, ко­торые нельзя использовать на этапе ризогенеза.

Введение в питательную среду ГК в концентрации 0,5 мг/л в сочетании с БАП не способствовало увеличению, как коэффициента размножения, так и количества побегов, пригодных для укоренения у всех изучаемых форм.

Кроме гиббереллинов и цитокининов некоторые исследователи на эта­пе собственно микроразмножения используют ИМК  установили, что коэффициент размножения груши зависит от соотношения, ауксинов и цитокининов в питательной среде.

По мнению физиологов, воздействие ауксинов на разные ткани слож­ное. Классическое действие ауксинов — это усиление роста, которое обуслов­лено стимуляцией растяжения-клеток. Кроме того, ауксины участвуют в про­цессе клеточного деления. Воздействие ауксина на растение зависит от кон­центрации. Изменяя концентрацию фитогормонов и их количественное соот­ношение можно управлять морфогенетическими процессами. Соотношение цито- кинин: ауксин регулирует направленный морфогенез на уровне целого расте­ния [7].

Цитокининм, гиббереллины, ауксины.  При микроразмножении плодовых культур было отме­чено, что регенерация побегов в большей степени зависит от сортовых осо­бенностей, чем от содержания фитогормонов в питательной среде:

В наших исследованиях комплексное изучение: влияния; цитокининов, гиббереллинов и ауксинов; на удлинение микрочеренков проводили у 2 сортов груши: Нагима и Талгарская Красавица. Для этого использо­вали среды- с БАП 1,0 (контроль 1) и 2,0 мг/л (контроль 2), а также на: фоне БАП 2,0 мг/л в состав среды вводили 0,2 мг/л ГК и 0,1 мг/л ИМК. Было уста­новлено, что у всех форм и сортов максимальное количество побегов; опти­мальной для укоренения длины отмечено на среде с БАП 1,0 мг/л. При этом количество побегов,- пригодных для «укоренения, варьировало от 28,8 до 100,0% в зависимости от генотипа и превосходило более чем в 2 раза вариант с БАП 2,0 мг/л.

Введение ГК и ИМК совместно с БАП 2,0 мг/л не оказывало сущест­венного влияния на коэффициент размножения и даже приводило к его не­значительному снижению по сравнению с контролем (БАП 2,0 мг/л). Коэф­фициент размножения при этом больше зависел от генотипа; чем от содер­жания регуляторов роста. У сортов он варьировал от 1,1 (сорт Талгарская Красавица) до 7,3 (сорт Нагима).

Кроме того, добавление к среде; содержащей БАП 2,0 мг/л, ГК и ИМК способствовало снижению количества микропобегов оптимальной для укоренения длины у большинства генотипов. Лишь только: у сорта; Нагима такого снижения не было отмечено, что скорей всего связано с прояв­лением генотипической реакции растений на гормональный фактор среды.

На основе проведенных исследований было установлено, что перед этапом ризогенеза микрочеренки груши целесообразнее культиви­ровать на среде с БАП 1,0 мг/л, чем вводить ГК и ИМК на фоне БАП 2,0 мг/л [3,9,20].

 

 

Охрана труда

 

Охрана труда – система обеспечения безопасности жизни и здоровья работников в процессе трудовой деятельности включающая правовые, социально — экономические, организационные, технические, психофизиологические, санитарно — гигиенические, реабилитационные и иные мероприятия и средства.

В связи с этим плодоовощевод должен знать: законодательство по охране труда; организацию и контроль за состоянием охраны труда, психофизиологические возможности человека, правила обеспечения работающих спецодеждой и другими средствами защиты, требования по обеспечению санитарно-гигиенического состояния сельскохозяйственных объектов, технику безопасности в растениеводстве и пожарную безопасность на сельскохозяйственных объектах.

Специалисты сельского хозяйства по интенсивным садам должны уметь организовать работу по безопасности труда с использованием новейших достижений науки и техники, самостоятельно и грамотно разрабатывать практические мероприятия по созданию здоровых и безопасных условий труда, своевременно обнаруживать и анализировать различные производственные опасные и вредные производственные факторы и принимать меры по их устранению. Такие задачи могут оказаться под силу только специалисту, обладающему глубокими теоретическими знаниями и практическими навыками в области охраны труда и пожарной безопасности в сельскохозяйственном производстве.

Особенности условий труда в сельскохозяйственном производстве по интенсивному саду

Современное сельскохозяйственное производство не­прерывно оснащается разнообразными сложными машина­ми, орудиями, агрегатами, безопасная работа па которых требует соответствующих знаний. Широкое применение электрической энергии в сельском хозяйстве требует обя­зательного ознакомления рабочих, служащих и колхозни­ков с вопросами электробезопасности. Химизация сельско­го хозяйства вызывает необходимость тщательного обуче­ния приемам безопасной работы с ядохимикатами и удоб­рениями, так как неумелее использование их может при­вести не только к отравлению, но к взрыву и пожарам. Сложность сельскохозяйственного труда и производства в целом заключается в необходимости постоянно следить за непрерывным изменением развития растений и животных и вовремя принимать меры, способные поддержать их про­дуктивность на заданном уровне. Часто из-за погодных ус­ловий механизаторы не могут окончить запланированную работу, но в погожие дни им приходится работать больше нормальной продолжительности смены. Так создается есте­ственная неритмичность рабочих смен. Здесь исключитель­ную роль играет способность администрации четко органи­зовать труд механизаторов.

Таким образом, для предотвращения травматизма и за­болеваемости в сельском хозяйстве необходимы разносто­ронние знания по охране труда, умение выявлять и устра­нять потенциальные опасности и вредности, учитывать влияние меняющихся внешних условий на безопасность тру­да, умение владеть приемами оказания первой доврачеб­ной помощи и методами тушения пожаров.

Организационные основы охраны труда.

Изучая систему обучения и инструктажа работников сельскохозяйственного производства, необходимо знать «Положение об обучении, инструктаже и проверке знаний работников по вопросам охраны труда в хозяйствах, на предприятиях, в учреждениях и в организациях Минсельхозпрода».

Управление охраной труда является составной частью общей системы управления хозяйством и осуществляется с целью обеспечения безопасных и здоровых условий труда, предотвращения воздействия на работающих опасных и вредных производственных факторов, сохранение высокой и длительной работоспособности трудящихся.

Цель обеспечивается решением следующего комплекса взаимосвязанных задач:

• организацией профессионального отбора;
• организацией обучения работающих охране труда;
• пропаганда охраны труда;
• обеспечением безопасности зданий, сооружений, помещений;
• приведением эксплуатируемого оборудования и технологических процессов в соответствие с требованиями безопасности труда;
• нормализацией санитарно-гигиенических и психофизиологических условий труда;
• организацией обеспечения работающих средствами индивидуальной защиты (СИЗ);
• организацией лечебно-профилактического обслуживания работающих;
• нормализацией санитарно-бытовых условий для работающих;
• обеспечением оптимальных режимов труда и отдыха.

Основы производственной санитарии.

«Санитарные правила по хранению, транспортировке и применению минеральных удобрений в сельском хозяйстве» и СанПиН 1123-73 «Санитарные правила по хранению, транспортировке и применению пестицидов (ядохимикатов) в сельском хозяйстве»; ГОСТ 12.1.005-88 «Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и др. норм и ГОСТов, относящихся к технологическим процессам, осуществляемым в хозяйстве.

Необходимо иметь понятие о санитарно-защитных зонах, их размерах, о расположении и устройстве бытовых помещений. Следует уяснить, как влияют вредные производственные факторы, неблагоприятные метеоусловия на организм человека, безопасность и производительность труда. Выявить основы инженерно-технического обеспечения нормируемых метеоусловий при  помощи  отопления и вентиляции.

Необходимо обратить внимание на порядок подбора и выдачи работающим средств индивидуальной защиты, спецодежды, спецобуви в соответствии с «Правилами обеспечения работников средствами индивидуальной защиты». Нужно знать, что понимается под предельно допустимыми концентрациями (ПДК) и летальными дозами (ЛД) вредных веществ.

Следует изучить назначение вентиляции, её типы и способы организации воздухообмена в складах удобрений и пестицидов, в хранилищах картофеля, корнеплодов, овощей и плодов, и другой сельскохозяйственной продукции.

Необходимо изучить вредные вещества, их классификацию по ГОСТ 12.0.0.07-76. Особое внимание обратить на правильное решение организационных вопросов охраны труда при работе с удобрениями и пестицидами: допуск людей к работе, учет метеорологических условий работы, соблюдение режима труда, роль питания, наличие и исправность средств индивидуальной защиты, спецодежды, спецобуви, соблюдение личной гигиены.

Необходимо изучить действие шума и вибрации на работающих в сельском хозяйстве и меры борьбы с этими вредными факторами. Общие требования безопасности. Действие на работающих ультразвука и инфразвука. Знать коллективные и индивидуальные средства защиты и классификацию защиты работающих от вредных и опасных производственных факторов согласно ГОСТ 12.4.011-89.

Основы техники безопасности.

Следует научиться выявлять опасные и вредные производственные факторы, характерные для плодоводства, знать основные пути и технические средства обеспечение безопасных условий труда. Следует ознакомиться с ГОСТ 12.4.026-76. «Цвета сигнальные и знаки безопасности», ГОСТ 12.3.002-75. «Процессы производственные. Общие требования безопасности», ГОСТ 12.2.003-91 «Оборудование производственное. Общие требования безопасности». Следует помнить, что совершенствование сельскохозяйственного оборудования должно обеспечивать переход от техники безопасности к безопасной технике.

Изучение этой темы должно базироваться на знании вопросов конструкции и эксплуатации сельскохозяйственной техники, изученных ранее в специальных курсах.

Студенту следует уяснить особую опасность работ с электрооборудованием. Изучение этой темы нужно начать с документов: ГОСТ 12.1.009-76. «Электробезопасность. Термины и определения», ГОСТ 12.1.019-79. «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты». Необходимо изучить воздействие электрического тока на человека, причины поражения электричеством, знать методы безопасной работы с электрооборудованием, машинами и инструментами. Следует усвоить современные методы и средства защиты от статистического и атмосферного электричества.

Изучение требований безопасности к грузоподъемному оборудованию (ГОСТ 12.3.009-76), сосудам, работающим под давлением, следует начинать с ознакомления с документами: «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением», утвержденными Министерством по чрезвычайным ситуациям и Министерством труда Республики Казахстан. Нужно знать требования безопасности к погрузочно-разгрузочным площадкам и к складированию материала. Уметь разрабатывать безопасные маршруты движения и перегона сельскохозяйственной техники, принять меры по предупреждению дорожно-транспортных происшествий [29].

Основы пожарной безопасности.

Нужно знать противопожарные требования к эксплуатации различных сельскохозяйственных сооружений, т.е. теплиц, сушильных, зерноочистительных, льноперерабатывающих пунктов, нефтескладов, складов минеральных удобрений и пестицидов, гаражей и площадок хранения автомашин и сельскохозяйственной техники. Следует рассматривать вопросы обеспечения противопожарного режима в период уборки урожая, при выполнении полевых и транспортных работ с использованием сельскохозяйственной техники [24,25,26].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА

 

Для включения биотехнологических приемов в технологию производ­ства посадочного материала высших категорий качества целесообразно:

1. Оптимальный срок изоляции эксплантов в фазе активного роста рас­тений.
2. Культивирование эксплантов на этапе введения в культуру in vitro проводить на среде Кворина-Лепуавра с содержанием БАП не более 0,5 мг/л, постепенно доводя его концентрацию до 2,0 мг/л на этапе пролиферации.
3. Для увеличения количества побегов, оптимальной для укоренения длины, перед этапом ризогенеза необходимо: снижать содержание БАП в среде до 1,0 мг/л; или наряду с БАП 2,0 мг/л вводить производный цитокинина аденин-сульфат в концентрации 50,0 мг/л; или добавлять в зависимости от генотипа, антиоксидант (аскорбиновую кислоту и лимонную кислоту по 20,0 мг/л, поливинилпирроллидон- 30,0 мг/л).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВЫВОДЫ

 

Оптимизированы основные этапы клонального микроразмножения (введение в культуру и собственно микроразмножения) груши с учетом генотипических особенностей и изучены особенности адвентивного органогенеза их из соматических тканей.

Высокая степень дифференциации меристематических тканей на этапе введения в культуру in vitro обеспечивается в оптимальный срок вычленения (фаза активного роста побегов) с предпочтительным использованием апикальнах почек с размером эксплантов от 0,5 до 1,5 мм.

Наиболее эффективной при введении в культуру in vitro груши является среда Кворина-Лепуавра с добавлением БАП в концентрации не более 0,5 мг/л. Присутствие в питательной среде других регуляторов роста – ГК (0,02 мг/л) и ИМК (0,02 мг/л) является не целесообразным.

Высокий морфогенез груши на этапе пролиферации обес­печивается как при использовании среды Кворина-Лепуавра, так и среды Мурасиге-Скуга с 1/4 содержанием аммонийной формы азота и введением БАП в концентрации 2,0 мг/л.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

• Абраменко Н.М. Укоренение в нестерильных условиях побегов пло­довых, размноженных in vitro / Н.М. Абраменко, Р.В. Стаканова, A.M. Чер­нец // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. науч. конф. — Кишинев: Штиица, 1999. — С. 112.
• Агафонов Н.В. Применение регуляторов роста для укоренения, раз­множения и повышения продуктивности плодовых и ягодных культур / Н.В. Агафонов, З.Н. Алинтаев, К.В. Дмитриева, Л.А. Рабей, В.А. Высоцкий, Ф.Я. Поликарпова, Е.М. Устименко-Бакумовская, A.A. Борисова // Применение регуляторов роста растений в с.-х. производстве: Сб. науч. трудов ЦИНАО.- М., 2000.-С. 83-94.
• Атрощенко Г.П. Применение антиоксидантов в биотехнологии пло­довых и ягодных культур. / Г.П. Атрощенко, Г.М. Самохин, С.Ю. Орлова // Использование биотехнологических методов для решения генетико- селекционных проблем. Сб. докладов и сообщений XVIII Мичуринских чте­ний 27-29 октября 2000. — Мичуринск, 1998. — С. 25-28.
• Бартиш И.В. Микроклональное размножение груши (Pyrus communis L.) in vitro / И.В. Бартиш, C.M. Меркулов, В.И. Корховой, В.П. Копань // Фи­зиология и биохимия культурных растений. — 2002.- №1. — С. 84-90.
• Бартиш И.В. Состав культуральной среды и эффективность образо­вания побегов in vitro из листовых эксплантов яблони / И.В. Бартиш, В.И. Корховой // Физиология растений.- 2002. — Т. 44, №1. — С. 440-444.
• Бурдасов В.М. Особенности микроклонального размножения яблони / В.М. Бурдасов, Е.И. Ильина, Н.В. Коннова // Биология-культивируемых кле­ток и,биотехнология: Тез. докл. междун. конф. Новосибирск, 2001. — С. 360.
• Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфо­генеза/ Р.Г. Бутенко.- М.: Наука, 1999. — 272 с.
• Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений / Р.Г. Бутенко // Гормональная регуляция онтогенеза растений. — М.: Наука, 2000.-С. 42-54.
• Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике / Р.Г. Бутенко, С.Г. Муромцев, Т.И. Тихоненко; М.И. Прокофьев // Основы сельскохозяйственной биотехнологии. — М.: Агропромиздат, 2001. — 379 с.
• Вердеревская Т.Д. Получение и ускоренное размножение безви­русного посадочного материала плодовых и ягодных культур / Т.Д. Верде­ревская, Н.М. Абраменко // Садоводство, виноградарство и-виноделие Мол­давии. — 2003. — №6: — С. 26-28.’
• Верзилин A.B. Оздоровление и клональное микроразмножение слаборослых подвоев яблони: монография / A.B. Верзилин, В. А. Минаев, А. М. Тарасов. — Мичуринск: МГПИ, 2007. — 146 с.
• Вовк В.В. Оптимизация селекционного процесса и ускоренное раз­множение межвидовых, ремонтантных форм малины методом in vitro: Авто- реф. дис…. канд. с.-х. наук. — Брянск, 2000. — 20 с.
• Волгина М.А. Микроклональное размножение подвоев яблони и груши / М.А. Волгина, К.Г. Карычев, Г.Ю. Ковальчук // Научные достижения в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве: Сб. науч. тр. — Алмалы, 2004.-С. 11-15.
• Высоцкий В.А. Действие некоторых регуляторов роста на изолиро­ванные меристематические верхушки черной смородины / В.А. Высоцкий// Плодоводство и ягодоводство Нечерноземной зоны: Сб. науч. тр. НИЗИСНП. -М, 2005.-С. 101-107.
• Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход / К. Дер- флинг.- Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 304 с.
• Джигадло М.И. Микроклональное размножение и производство посадочного материала плодовых и. ягодных культур высших категорий ка­чества / М.И. Джигадло, А.Ф. Колесникова, E.H. Джигадло, И.З. Федотова, Л.В. Фролова // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: Тез.

• Докл. VIII Международной конференции 9-13 сентября. — Саратов, 2003. — С. 109.

22. Дмитриева H.H. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциа­ции в культуре клеток и тканей / H.H. Дмитриева // Культура клеток расте­ний.-М., 2007. — С. 113.
23. Долгих С.Г. Размножение и выращивание яблони в корнесобствен- ной культуре / С.Г. Долгих // Садоводство и виноградарство. — 2004. — № 5. — С.14-17.
24. Учеты, наблюдения, анализы, обработка данных в опытах плодовыми и ягодными культурами. Методические рекомендации под.ред. Карпенчука Г.К. и Мельника А.В. Умань. 2002.115 с
25. Пастухов С.Б. Основы рыночной агроэкономики и сельского предпринимательства. 1999 – 42 с.
26. Канарев Ф.М., Охрана труда М.2000– С.3-43.