Дипломдық жұмыс: Алматы облысы жағдайында алма сорттарын in vitro жағдайында көбейту

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ АУЫЛ ШАРУАШЫЛЫҒЫ МИНИСТРЛІГІ

                    ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ АГРАРЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

              КОММЕРЦИЯЛЫҚ ЕМЕС АКЦИОНЕРЛІК ҚОҒАМЫ

 

 

 

 

 

 

          5B080900 — Жеміс-көкөніс шаруашылығы мамандығы

 

 

Марат Көркем

 

ДИПЛОМДЫҚ ЖҰМЫС

                

 

Алматы облысы жағдайында алма сорттарын in vitro жағдайында көбейту

                       

                        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                   Алматы, 2018

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ АУЫЛ ШАРУАШЫЛЫҒЫ МИНИСТРЛІГІ

 

ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ АГРАРЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

КОММЕРЦИЯЛЫҚ ЕМЕС АКЦИОНЕРЛІК ҚОҒАМЫ

 

 «Агробиология» факультеті

 

«Жеміс-көкөніс және жаңғақ шаруашылығы»  кафедрасы

 

 

ДИПЛОМДЫҚ ЖҰМЫС

 

Тақырыбы: Алматы облысы жағдайында алма сорттарын in vitro жағдайында көбейту     

 

 

 

                                                               Беттер саны      51

                                                                                  Сызбалар мен көрнекі

                                                                      материалдар саны 15          

 

 

Орындаған: Марат Көркем

 

 

2018 ж. «____» ___________ қорғауға жіберілді

 

Кафедра меңгерушісі ___________________ а.ш.ғ.к., профессор Алексеева М.А.               

 Жетекшісі_______________________             PhD Жумагулова  Ж.Б.

 

 

 

 

 

 

 

 

                                             Алматы, 2018 ж   

                                                МАЗМҰНЫ

                                                    

І	КІРІСПЕ……………………………………………………………………………………….	5
1.1	|Алма дақылының биологиялық ерекшеліктері…………………………………………
1.2	Өсімдіктерді микроклонды көбейту әдістері мен артықшылықтары……………………………………………………………………………
1.3	Өсімдіктерді микроклонды көбеюіне әсер ететін факторлар……………………………………………………………………………………….
1.4	Алматы облысы жағдайының топырақ климаттық белгілері………………………………………………………………………………………..
1.5	Жасанды ортада өскен өсімдіктерін залалсыздандырылмаған топыраққа   бейімдеу әдісі……………………………………………………………
ІІ	НЕГІЗГІ  БӨЛІМ
2.1	Зерттеу нысаны және зерттеу әдістері……………………………………………
2.2	Өсімдіктерді асептикалық дақылдарға енгізу тәсілдері…………………….
2.3	Алманың микроклонды көбеюінің әдісі…………………………………………..
2.4.1	In vitro асептикалық дақылына енгізу……………………………………………..
2.4.2	Алманың  in vitro өскіндерін клондауға қоректік ортаның минералдық  құрамының әсері ………………………………………………………
2.4.3	Аналық өсімдіктердің жасы мен жағдайы, апикалды бүршіктерді оқшаулау мерзімі және оларды залалсыздандыру……………………………
2.4.4	In vitro жағдайында  төбебүршік меристемаларды өсіру ………………..
2.4.5	Алма дақылын микроклондық әдіс арқылы өсірудің экономикалық тиімділігі……………………………………………………………………………………….
ІІІ	ҚОРЫТЫНДЫ БӨЛІМ
	ҚОЛДАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ………………………………………..

 

 

 

 

 

АНЫҚТАМАЛАР

 

          Ғылыми жұмыста келесі терминдер анықтамасымен беріліп отыр:

          In vitro – тірі ағзадан бөлек шыныда (пробиркіде, Петри табақшасында немесе колбада).

          Биомасса – тіршілік ету нәтижесінде пайда болған жасуша массасы, мысалы, каллусты жасушалардың биомассасы.

          Эксплант – бастапқы каллусты алу үшін қолданылатын немесе өздігінен инкубацияланған ағзаның немесе ұлпаның көрінісі.

          Интродуценттер – өзінің табиғи таралу ареалынан тыс танапта өсірілген өсімдік.

          Клонды микрокөбею – жыныстық жолмен емес, керісінше in vitro жағдайында  алынған, бірақ өсімдіктің бастапқы данасына генетикалық ұқсас өсімдіктер.

           Жабық тамыр жүйесі – отырғызатын материалды контейнерде әр түрлі субстраттарды пайдалану арқылы өсіру.

          Өсімдіктің өсуін реттейтін реттегіштер – өсімдіктердің ең маңызды өсу кезеңінде олардың өсуін мақсатты түрде қолдау үшін пайдаланылатын табиғи қосылыстар мен олардың жасанды аналогтары, әр түрлі препараттардың қосылыстары.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

            КІРІСПЕ

 

Зерттеу жұмысының өзектілігі.

Қазақстанның ауыл шаруашылығы өндірісінің маңызды, ерекше мамандандырылған және қарқындатылған салаларының бірі – жеміс шаруашылығы. Қазіргі таңда, елімізде жеміс шаруашылығын дамытуға деген бет бұрыс өз үлесін тауып жатыр. Қазақстанның оңтүстік, оңтүстік-шығыс аймағының топырақ климат жағдайы жеміс дақылдарын өсіру үшін қолайлы болып келеді. Негізгі көлемін жеміс өсімдіктері, олардың ішінен шекілдеуікті дақылдар алып жатыр, соның ішінде айтарлықтай алма дақылы басымдылыққа ие [1].

2013-2020 жж. ҚР АӨК дамыту жөніндегі «Агробизнес -2020» бағдарламасында мемлекет халықты тұтыну нормасына сәйкес жеміспен өамтамасыз ету, жемістердің өңделуі мен экспорты үшін 2020 жылға дейін жеміс дақылдарының ауданын 75-80 мың га – ға жеткізу қарастырылып отыр. Отандық жеміс шаруашылығының бәсекеге өабілеттілігін жоғарылатудың басты шарттарына өндірістік бақтарға жоғары бейімді сорт –екпелер комбинацияларын таңдап алу, жемістерді өсіру технологияларын жетілдіру, бақ алқаптарын ғылыми негізделген түрде орналастыру және өндірілген өнімді сапалы, заманауи технологияларды пайдалана отырып сақтау.

Алматы облысы Қазақстанда алма дақылын өсіретін басты аймақтардың бірі болып табылады. Мұндағы табиғат пен ауа-райы жағдайы шетел өнімдерімен бәсекелестікке түсе алатын жоғары сапалы алма жемістерін өсіруге қолайлы. Осы жағдайда өсірілген жемістер жоғарғы тауарлы сапасымен ғана емес, ерекше дәмдік қасиеттерімен де ерекшеленеді.

Дүние жүзінің селекциялық практикасында микроклондық көбейту бастапқы материалдың өте аз мөлшерін тез арада, әрі эффективті түрде жаңа сорттарды,  бірегей формаларды жасап шығару үшін қоданылады. Қазіргі кезде микроклонды көбейту әдісімен алмұрт, алма, шие, шабдалы,  өрік өсімдіктерінің жаңа сорттары көбейтілген. Англия мен АҚШ та бастапқы материалы in vitro жағдайында өсірілген өсімдіктерден тамырланған дақылдар алынып, арнайы саябақтар өсірілуде.       Биотехнологияның заманауи тәсілдері өсімдіктерді клондаудың тиімділігін арттырып отыр. Соматикалық тінді көбейтуге қатысты жаңа зерттеулер жаңа тәсіл — клонды микрокөбею тәсілін ұсынды. Негізі бұл тәсіл  вегетативті көбею тәсіліне сәйкес келеді, айырмашылығы – барлық әрекет in vitro  жағдайында өтеді.

Сонымен, in vitro  жағдайында жасанды қоректік орталарда жеміс дақылдарының әртүрлі мүшелерін өсіру арқылы оларды көбейту әдісі-болашағы зор  тиімді әдіс ретінде кең қолдау тауып отыр.

 

 

 

 

      

 

1. Әдебиеттерге шолу

Қазақстанда жеміс-жидекке деген сұраныс артып келе жатқанымен ішкі өндіріс тұтынушылар қажеттілігін өтей алмай келеді. Мәселен, 2010 жылы бұл өнімнің жалпы көлемі 221мың тонна, оның ішінде сүйекті және шекілдеуікті – 147,8мың тонна, жүзім – 56,4 мың тонна, жидек- 16,8 мың тонна болды. Сондай-ақ 21мың тонна алма жиналды. Жақсы жылдары бұл көрсеткіш 190мың тоннаға дейін жетті. Соған қарамастан сырттан тасымалдау көлемі артып келеді. Республикадағы алма мен алмұрт өсірілетін маңызды аймақтар Алматы, Жамбыл және Оңтүстік Қазақстан облыстары. Бұл облыстарда өндірісті бақ шаруашылығы дамыған.  Соның нәтижесінде жеміс ағаштарының 70%-ы, жидектің 26%-ы, жүзімнің 99%-ы осы облыстардың үлесінде. Қызылорда облысы да республика бақ шаруашылығының оңтүстік аймағына жатқанымен мұнда жеміс түрлері көп емес. Алманың Апорт, Милтон, Пармен, Пестушка және басқалары ғана өседі.

          Алма мен алмұрт әлемнің 80 елінде өсіріледі. Дүниежүзі бойынша өндірілген алманың жалпы көлемі – 45-52млн.тонна, ал алмұрттың жалпы өнімі 10-11млн. тонна аралығында өзгеріп тұрады.

           Мәселен, «Қазақстан Республикасында пайдалануға рұқсат етілген селекциялық жетістіктердің мемлекеттік реестрі» және «Ауыл шаруашылығы өсімдіктері перспективалық сорттарының тізімі» негізінде Қазақстанның облыстары бойынша аудандастырылған алма мен алмұрттардың саны анықталған (алманың 60 және алмұрттың 7 сорты).

Республикадағы алма өсірілетін маңызды аумақтар Алматы, Жамбыл және Оңтүстік Қазақстан облыстары. Бұл облыстарда өндірісті бақ шаруашылығы дамыған. Соның нәтижесінде жеміс ағаштарының 70%-ы, жидектің 26 %-ы, жүзімнің 99%-ы осы облыстардың үлесінде.

    Еліміздің оңтүстігі мен оңтүстік-шығысының таулы аудандары далалы жерлеріне қарағанда жеміс дақылдарын өсіруге қолайлы. Мәселен, Іленің арғы жағы және Жоңғар Алатауының теңіз деңгейінен 1100-1600метр биіктегі құнарлы жерлерінде бақ шаруашылығы жақсы дамыған.    Еліміздің оңтүстігі мен оңтүстік-шығысында негізінен алманың мынадай сорттары өседі: Голден делишес, Заилийское, Заря Алатау, Мелба, Пеструшка, Салтанат және басқалары.

 Қазақстанда рұқсат етілген селекциялық жетістіктер реестріне Талғар және Мақсат алмасының қазіргі сорттары қосылды. Негізінен алманың орал және сібір-алтай селекциясының сорттары өсіріледі. Олар: Алтайское румынье, Таулы-алтайлық, Жебровкалық, Заветный, Орал шырыны (Уральское наливное) және басқалар. Аймақта алманың 16 сорты аудандастырылған. Ол сорт түрлері Қарағанды, Павлодар және Қостанай облыстарында өте аз. Солтүстік аймақтың өзге облыстарында алманың сорттары жеткілікті Жеміс шаруашылығы – ауыл шаруашылығының негізгі салаларының бірі. Алматы облысы – құрамында  адам ағзасына қажетті дәрумендер, органикалық қышқылдар, минералды тұздар кездесетін жеміс, жидек және жүзім өндіретін, республикамыздағы жетекші аудандардың бірі. Қазіргі кездегі экологиялық мәселелер кезеңінде жемістердің емдік қасиетінің маңызы өте зор, себебі адам иммунитетін, ағзасына тікелей терапиялық әсер көрсете алатын, жеміс-жидектерде кездесетін биологиялық белсенді заттармен қамтамасыз ету қажет. Жемістердің негізгі рөлі – түрлі аурулардың алдын алу. Көптеген жемістердің профилактикалық  қызметі ең алдымен олардың зат алмасудың поливалентті оң әсерлі әрекеттері мен өмірлік маңызы бар мүшелердің қызметінің   артуы арқасында жүзеге асады, мұның барлығы жиналып, адам ағзасының қоршаған ортаның жағымсыз факторларына төзімділігін арттырады.

Алма әлемдік жеміс шаруашылығында кең таралған  дәнді жеміс түрі.Таңқаларлық сыртқы түрі, тауарлық және дәмдік сапасының жоғарылығы, сақтауға және тасымалдауға қолайлылығы  алма жемістерінің,  жемістер  арасында жоғарғы орынға шығуына жағдай жасады.  

Биология ғылымдарының докторы М. Исиннің пікірінше, соңғы жиырма жылдықта, бұрын өте танымал болған сорттың деградациясы (тозуы) байқалуда: жемістері ұсақталуда, сыртқы түрін жоғалтуда, ең бастысы ерекше дәмдік қасиеті және иісі нашарлауда [1,2].

Алма Malus Mill  туыстығының  Rosaceae  тұқымдастығына жататын ең көп тараған жеміс өсімдігінің түрі. Ол әлемнің көптеген елдерінде өседі. Алма Ресейде жеміс екпелерінің ішіндегі жалпы бақтар көлемінің 60%  көлемін алатын жетекші жеміс дақылдарының бірі болып табылады (Кашин, 1995). Ол субтропиктен бастап Шығыс Сібір аймақтарына дейін өсіріледі. Алма өзінің көп сорттылығына қарай әр түрлі топырақты аймақтар мен  климаттық жағдайларға тез бейімделеді және қалпын тез өзгертеді.   Алманың жер шарына кең тарауын оның шаруашылық-биологиялық белгілерімен,  өсу барысында орта таңдамайтындығымен, сондай-ақ басқа жеміс өсімдіктеріне қарағанда сыртқы ортаға тез бейімделетіндігімен байланыстыруға болады.

Көбейту дегеніміз — жемісті өсімдіктерді жаңғыртуды бақылауда ұстау болып саналады.  Жұмыстың бұл түрі екі мақсатты көздейді: өсімдік санын көбейту және олардың бағалы белгілері мен қасиеттерін сақтау.    Көбейтудің өзара ерекшеленетін екі тәсілі бар — тұқымымен (жынысты) көбейту және вегетативті (жыныссыз) көбейту. Жемісті дақылдарды вегетативті көбейтудің бір әдісі қысқы телімелер болып табылады. Бұл әдіс қыс кезінде ғимарат ішінде дайындалған қалемшелерді арнайы көмілген және сақталған телінушілерге ұластыру арқылы жүргізіледі. Арнайы  режимде ұластырылған бөліктер өсе бастайды, көктемде телімелер отырғызылып сол жылы ұластырылған біржылдықтар алынады.

Нидерландтық  жеміс  шаруашылығы өкілдерінің ойынша, уақыт өте келе бақтардың өнімділігін арттыруда қазіргі таңда қолданылып жүрген интенсификация факторлары болашақта өз мүмкіндіктерін жоғалтады. Болашақта өнімділікті жоғарылату отырғызылатын материалдар сапасын арттыру, үлкен генетикалық біртектілікке қол жеткізу, көшеттерді жабық тамыр жүйесімен өсіруге көшу нәтижесінде болуы мүмкін [3].

Отырғызылатын материалдарды жабық тамыр жүйесімен өсіру — 100% ұласып өсетін ағашты және бұталы түрлердің көшеттерін алудың тиімді жолы.

Әсіресе, қысқы телімелерден алынған көшеттерді контейнерлерде, сонымен қатар тамыр жайған қалемшелерді жеке тамырлы дақылдарда ары қарай өсіру қолайлы. Жылытылатын жылыжайларда бұл әдіс арқылы көшеттерді мамыр-маусым айларына өсіріп шығаруға және оларды жаз кезінде вегетациялық күйінде ашық  танапқа отырғызуға болады [4].

Көшеттерді жабық тамыр жүйесімен өсіру технологиясы ағаш өсіруде, дендрологияда, жүзім шаруашылығында, гүл және жеміс шаруашылықтарында кең қолданыс тапты.

Алғаш рет контейнерлі көшеттік АҚШ-та елуінші жылдары пайда болды. Батыс Европада өсімдіктерді контейнерде өсіруге қызығушылық сәл кейін басталды, алайда олар  осы әдіспен белсенді айналысты. Мұндай бірнеше мыңдаған өсімдігі бар контейнерлерді алғаш рет 1955 ж. Данияда шығарды. Чехословакияға өсімдікті контейнерде өсіру әдісі 60-жылдардың соңында келді [5]. Көшеттерді әр түрлі контейнерлерде өсіру тәжірибесі Англияда 1962 ж. жүргізілді.

Көптеген елдердің орманшылары контейнерде отырғызылған материалдардың  өсу артықшылығын дәлелдейтін, бұлтартпас нәтижелер алды.

Қазіргі таңда Голландияда контейнерлерде жаңа жылдық шыршалар сәтті өсірілуде. «Рождество» мерекелері тойланып біткен соң көшеттік өсімдіктер  қайтарылады да   алдын-ала дайындалып қойған арнайы шұңқырға, тұрақты орнына отырғызылады [6]. Европа елдерінде бақ өсімдіктерін жабық тамыр жүйесімен өсірудің  үзіліссіз желісі дайындалған .

Латвияда көшеттерді «Брика» әдісі бойынша өсіру технологиясы белсенді  жүзеге асырылуда. Әдістің ерекшелігі — көшеттер 50 данадан бума ретінде шығарылады. Оларды ұзақ уақыт сақтауға  және өндіріске қажетті мерзімде отырғызуға болады .

Қоңыр күз мезгілі еді. Ағаштың жапырақтары түсіп, тек жабайы алма
ағашының басында жалғыз алма қалыпты. Осы кезде орман аралап жүрген
Қоян алманы байқап қалады. Оны қалай алуға болады? Алма өте биікте — се-
кіріп жете алмайсың!
Шырша бұтағында отырған қарға қоян қылығына сырттай күліп отырды.
— Қарқ-қарқ! Оны көрген қоян:

— Қарға, Қарға! Маған алманы үзіп алып берші! — дейді.
Қарға ағаш басына ұшып барып, алманы үзіп алады. Бірақ алманы тұм-сығымен қармап ұстай алмай, жерге түсіріп алады.
Рақмет, саған, Қарға! — деді де Қоян алманы жерден көтермек болды. Ал жерге түскен алма жаны бардай, дыбыс шығарып, қозғалып жүгіре жөнелді.
— Бұл қалай?
Қорқып кеткен Қоян ағаш алмасының түбінде ұйықтап жатқан кірпінің тікеніне құлағанын түсініп:
— Кірпі, кірпі! Тоқта, тоқта! — деп айғайлады. — Менің алмамды қайда алып бара жатырсың?
Кірпі кідірместен:
~ Бұл — менің алмам! Ол төбеден құлады, ал мен болсам оны ұстап алдым.
Қоян да қояр емес!
— Алмамды қайтарып бер. Оны тауып алған мен! Таласып жатқан Қоян мен Кірпіге Қарға қосылады.
— Босқа таласасыңдар, алма менікі! Мен оны өзім үшін үзіп алғанмын! -деді ол өтірік-шынын араластыра.
Олар бір-бірімен түсінісе алмай, алманы әрі тартып, бері тартып, орман .~: айғайдан у-шу болып кетеді.
Сол кезде қорбаңбай Аю келіп қалады.
— Бұл не деген айғай-шу! Мазамды алдыңдар ғой! Бәрі оған жақындап:
— Сен, Аю, біздің ормандағы ең үлкен, әрі ең ақылдысың. Сондыңтан бізге алманың кімдікі екенін айтып берші? — деп аюға оқиғаның қалай болғанын баяндап, төрелігін сұрайды.
Аю сәл ойланып, сұрады:
— Алманы кім тапты?
— Мен! — деді Қоян.
— Ал, алманы кім үзіп алды?
— Мен! — деп қарқ етті Қарға.
— Жақсы. Кім оны ұстап алды?
— Мен ұстап алдым! — деді Кірпі.
— Мінекей, бәрің де дұрыс айтасыңдар, өйткені әрқайсыларың алманы алу үшін еңбектендіңдер! Алма бәріңдікі!
— Мұнда бір алма ғой! — деді Кірпі, Қоян,Қарға түк түсінбей.
— Бұл алманы теңдей бөліңдер. Әрқайсың бір-бір бөлігін алыңдар! — деді аю. Мұны естіп бәрі қуанып кетті:
— Бағанадан бері біз бостан-босқа таласқан екенбіз ғой! Кірпі алманы төрт бөлікке бөледі. Қоянға бір бөлігін беріп:
— Бұл саған, Қоян — сен алманы бірінші көрдің! Екінші бөлігін Қарғаға беріп:
— Бұл саған, Қарға — сен алманы үзіп алдың! Үшінші бөлігін Кірпі аузына салып:
— Бұл маған, өйткені алманы ұстап алған — мен! Кірпі Аюға төртінші бөлігін беріп:
— Бұл саған, Аю!
— Маған, не үшін? — деп таңқалды Аю.
— Сен бізге ақыл айтып, татуластырдың! — деді ол, риза кейіппен. Әрқайсы өзіне берілген алманың бөлігін жеп риза болды, өйткені Аю ешкімді ренжітпей дұрыс, әділ шешім шығарған еді.
« Береке басы — бірлікте» деген осыдан қалған көрінеді.

Физикалық қасиеттері бойынша құрылысын ескере отырып, тамыр жүйесінің ұзындығын шартты түрде мынадай етіп бөлуге болады: ұсақ тамырлар -10 мм-ден үлкен, орташа — 20мм, ірі – 30 мм-ден үлкен. Ең жас өсімдіктер үшін қоректік заттар деңгейі жоғары емес, ұсақ құрылымды субстрат қолданылады, ал ересек өсімдіктер үшін – қоректік заттар деңгейі жоғары және ірі құрылымды субстрат қолданылады [8].

Контейнерлік дақылдардың топырақ қоспасы үшін құрамдасы ретінде көп жағдайда, үлесі 0-ден 100%-ға дейін ауытқып отыратын торф, сонымен қатар 20% — қорда (жапырақтар, бұталар, тұрмыстық қалдықтар), 10-20% — қабық, 30% — ағаш тіндері, 5-20% — балшықты материалдар және де кокос тіндері, күріш кебектері, құм, перлит және т.б.пайдаланылады.

Құрамдастар арақатынасы өсімдікке, контейнер өлшеміне және орналасқан орнына (температура жоғары болған жағдайда, ылғал сиымдылығы жоғары қоспа болғаны жөн) байланысты ауытқиды. Мысалы: 50-60% қабық, 30-40% кокос тіні немесе торф, 10% перлит. Қоспа бөлшектерінің ең кіші өлшемі 5-7 мм болуы керек .

Негода В.И. жүргізген зерттеулер алма мен алмұрт көшеттерін өсіру үшін ең жақсы субстраттар: торф, қарашірік және топырақ (1:1:1), сонымен қатар топырақ, қарашірік және ағаш үгінділері (1:1:1), торф, қарашірік және жер (1:1:1) және де құммен топырақ (1:1) болып табылатынын анықтады.   Субстратқа цеолиттер қосу (100 г. топыраққа 150 мг.) немесе ұсақталған сабан және тыңайтқыштар қосу жақсы нәтижелер береді [23].

Алма мен сүйекті дақылдардың отырғызылатын материалдарын бір вегетациялық кезеңде өсіру үшін әр түрлі қышқылды беттік торфқа NPK қоса қолдану ұсынылады [24]. Шырғанақ көшеттері беттік торфқа минералды мақта (1:1), құм (2:1, 1:1, 1:2) немесе перлит (2:1) қосып өсіргенде  ең жақсы нәтиже көрсетті, барлық субстраттар толық минералды тыңайтқыштар қосқанда өздерінің ең үздік нәтижелерін берді [9].

Таңқурайды контейнерде, жылыжайда өсіргенде әк немесе минералдық тыңайтқыштар қосылған торф (65%), көшетхана топырағы (20%) және перлит (15%>)  қоспасы ең жақсы субстрат болып табылады.

Көшеттік танабында көкбөрі жидек  көшеттерін сорттарына байланысты өсіргенде, отырғызылатын материалдар шығымы 71%-ға дейін жетсе, қорғалған танапта 100%-ға дейін болатыны анықталған .

Жылыжайларда сәуір айының екінші жартысынан бастап, төбесінің ашық болғанына қарамастан температура 35°С жоғары болады. Бұл өсімдіктің өсуін тоқтатуға алып келеді және де олар төбе бүршіктерін сала бастайды. Нәтижесінде шие мен өрік көшеттерінің биіктігі сәуір айының соңында 40 см. аспайды. Өсімдіктерді ашық танапқа отырғызғаннан соң барлығы ары қарай өсіп кетеді, алайда олардың белсенді өсуі келесі жылдың көктемінен басталады. Контейнердегі субстратта тамыр жүйесінің температуралық түзімін өзгерту, наурыз айының ортасынан қараша айының ортасына дейін ашық ауаға шығаруға болады. Осылайша контейнердегі өсімдіктерді көктемнің соңы мен жаз мезгілдерінде олардың жылыжайда қызып кетуін болдырмау үшін, ашық ауада өсіру ұсынылады.

Алманың жеміс алқаптарын жаңғырту және ерте өнім алу үшін, апикалды бүршіктері гүлді болып келетін, ерте шыққан бұтақтарынан бөрік басы қалыптастрылған әлсіз өсетін сортты-телітуші комбинациялы көшеттерді қолдану ұсынылады .

Мұндай түрлердің отрығызылатын материалдары жеміс шаруашылығы дамыған Голландия, Франция, Польша және т.б. сияқты мемлекеттерде өндіріледі .

Кейінірек фото геотропикалық реакциялардың дәнекері болып табылатын, осьті мүшелердің төбелерін қалыптастыратын үдеткіштерді зерттеуге көп күш жұмсалды. А. Пааля, Д. Леба, И. Бойсен-Йенсен, Ф. Вент, Н.Г. Холодный еңбектерінде ауксин (өсу заты) деген атау алған бұл үдеткіштің химиялық табиғаты дәлелденді. Ауксиндердің химиялық құрылымын Ф. Кегл қызметкерлері  анықтады. Кейінірек этилен ашылды, одан соң гиббереллиндер, цитокининдер және абсцизндер табылды.

Фитогормондар – өсімдіктің бір бөлігінде аз мөлшерде пайда болып, оның басқа бөлігіне ауысатын және өсімдіктің өсуі мен қалыпқа келуіне арнайы әсерін тигізетін қосылыс [10].

Фитогормондардың әр түрлі жіктелуі бар. Э. Либберттің  айтуы бойынша, «фитогормондардың үш класы бар, артықшылығы бойынша үдеткіштер ретінде әсер беретін (ауксиндар, гиббереллиндер, цитокининдер), және екі класс фитогормондар, басты өсу тежегіші әсерін тигізеді (этилен, абсциз қышқылы)».

М.К. Мананков төрт түрлі табиғи, яғни өсімдіктің өзі бөліп шығаратын өсу реттегіштерін бөліп қарастырады: ауксиндер, гиббереллиндер, кининдер және ингибиторлар.

Х. Дюринг «фитогормондар» түсінігін, өсімдіктен бөлінетін, оның ішкі бөліктерінде жүретін және аз мөлшерде индуцирияланатын немесе әр түрлі физиологиялық үрдістерді бақылауда ұстайтын бес заттар тобын қамтиды деп топшылайды. Осы жіктеуге сәйкес фитогормондарды келесі топтарға бөлуге болады: ауксиндер, гиббереллиндер, цитокининдер, этилен және АБК.

Т. Гудвин және Э. Мерсер өсімдіктерде бес басты гормондар (немесе гормондар тобы) болады деп жазды да оларды былай жіктеді: ауксиндер, гиббереллиндер, цитокининдер, этилен және абсциз қышқылы.

Эндогенді өсу реттегіштерін  зерттеумен қатар ғылыми зерттеулерде синтетикалық өсу реттегіштеріне де көп көңіл бөлінуде. Л. Дж. Никелл [38] ауыл шаруашылығы тәжірибесінде қолданылып жүрген, өсімдіктің жиырмаға жуық физиологиялық үрдісін реттеуде  әсері жоғары 175 препаратты анықтаған. Барлық өсу реттегіштері (табиғи және синтетикалық) аз мөлшерде өсу мен даму үрдістеріне айтарлықтай өзгерістер енгізуге, яғни олардың  өсуіне оң ықпал етуге  қабілетті. Өсу реттегіштерінің мамандандырылған ерекшелігі, олардың көпшілікке танымал агротехникалық шаралар мен реттеуге келмейтін үрдістерге әсер ету қабілеті болып табылады.

Өсу реттегіштерін қолдану жыл өткен сайын әртүрлі болып келеді. Олар өсімдіктің өсуін жеделдету немесе тоқтату, қалемшелердің тамырлануын жеделдету, ағаш отырғызғанда, көптеген дақылдардың өнімділігін көтеру, тұқымды тыныштық күйден шығару, дәнексіз жеміс алу, жапырақтары мен жемістерін түсіру, жинау алдында өсімдікті кептіру үшін қолданылады.

Өсімдіктің өсуі мен дамуын реттеу үшін физиологиялық белсенді заттарды пайдалану, олардың өсімдікке әсер ету шеңберінің кеңдігімен, өсетін ағзаның потенциалды мүмкіндіктерін жұмылдыру мақсатында дамудың жеке кезеңдерін белгілі бір бағытта реттеу мүмкінідігімен, сәйкесінше өсірілетін өнімнің сапасы мен өнімділігін арттыруға байланысты.

Бақ шаруашылығы синтетикалық өсу реттегіштерінің алғашқы тұтынушылары болып табылады.   Қазіргі таңда бұл салада, осы заттарды қолданудың кең тәжірибесі жинақталған, олардың ең жақсы әсер ету жағдайы, көптеген сорттардың реакциялық ерекшеліктері анықталған.

Қазіргі уақытта жаңа, экологиялық қауіпсіз, өсіру жағдайларына тамыр жаюы тұрғысынан және де тамыр жайған қалемшелердің тұрақтылығын жоғарылату жағынан тиімді, арзан қосылыстар шығару, экзогенді өсу реттегіштеріне сорт топтары мен түлерінің реакция мөлшерін бағалау және бұл қосылыстардың әсер ету механизімін зерттеу өзекті болып табылады .

Көптеген бақ өсімдіктерінің қайта қалпына келу қабілетінің айтарлықтай төмендеуін ескере отырып, аналықтарын 10-12 жылдық жасына дейін, ал жоғары сапа категориясын одан да ерте; мысалы,  бөріжидекті 6-7 жасында,  пайдаланған жөн [11].

Өсімдіктің өсуі, генеративті ағзалардың пайда болуы, қайта қалпына келуге деген қабілеттілігі, қоршаған ортаның қолайсыз факторларына төзімділігі, метоболика жүйесінің көптеген жұмыстарымен байланыстылығы кешенді белгілер болып табылады. Мұндай жүйелер фитогормондармен және реттеу әсері бар гормонды емес заттармен реттеледі.

Фитогормондар – өсімдіктің әртүрлі ұлпалары мен ағзаларында синтезделетін, төмен молекулярлы органикалық зат. Олардың басты айырмашылықтары, негізгі физиологиялық бағдарламалар мен үрдістерді (жасушаның бөлінуі мен өсуі, өсімдіктің тыныштық күйі, саңылаулардың ашылуы  және  жабылуы және т.б. ) реттеуші рөлді атқарып, өте аз мөлшерде әсер ететін қабілеті болып табылады.

Соңғы уақыттарға дейін фитогормондардың бес түрі ғана белгілі болды: ауксиндер, цитокининдер, гиббереллиндер, абсциз қышқылы және этилен. Қазіргі кезде реттегіш белсенділікке ие, брассиностероидтар, жасмин қышқылы, салицил қышқылы сияқты басқада қосылыстар табылды .

Заманауй деректер бойынша, ауксиндер тамыр қалыптастыруда басты орын алады. Олар дифференциальды өсуді, жасушалардың өсуі мен созылуын бақылауда ұстайды, камбий жұмысын белсендіреді, өсімдік бойымен пластикалық заттардың сіңірілуі мен жылжуын реттейді, бөліну қабатының пайда болуын, жапырақтардың қартаюы мен түсуін ингибирациялайды. Ауксиндер метоболизмнің (зат алмасудың   ) әртүрлі жүйелеріне: нуклеин қышқылын, ақуызды, көмірқышылын, майлардың алмасуына, синтездеуге, тыныс алуға, фотосинтезге, екіншілік заттар синтезіне әсер етеді.

Түрлер мен сорттардың тамыр құрау қабілетінің бірдей болмау себебі — ауксиндер мен өсу ингибиторлары мөлшерінің әртүрлігінен деген теория бар. Тез көбейетін өсімдіктерде тамыр құралу бастамашысы ингибиторларға қарағанда көбірек, орташа тамыр жаятын өсімдіктерде бұл арақатынас теңдей дәрежеде, ал тамыр жаюы қиын өсімдіктерде ингибиторлар көбірек.

Алайда қайта қалпына келу қабілеті тек ауксиндар белсенділігі мен олардың өсу ингибиторлары арақатынасы мөлшеріне тәуелді емес. Қазіргі таңда қосалқы тамырлардың өсуі мен дифференциациясына сонымен қатар басқа да көптеген фитогормондардың қатысатыны туралы біршама мәліметтер бар [12].

Цитокининдер, изопентениладеин туындылары, басқа фитогормондармен тығыз байланыста өсімдіктің өсуі мен дамуын реттейді, физиологиялық белсенділіктің кең ауқымына ие, өсімдіктің барлық мүшелерінде кездеседі. Тамырдың апикалды меристемаларында синтезделеді, ол жақтан ксилема бойымен нәр шырынмен акропетальды жылжиды. ЦТК-ң  айтарлықтай мөлшері камбийден табылған. Олар ауксиндерге қарағанда тұрақсыздығы төмен және жылдамдығы жоғарырақ. ЦТК белсенділігін жою аминқышқылдары мен сутегіні байланыстыру арқылы жүреді.

ЦТК және ауксиндердің жоғары мөлшері ұлпада этилен биосинтезін индуциялайды. Этиленнің жиналуы өз кезегінде ИҚС тасымалын тежейді, АБҚ мөлшерін көбейтеді және жасуша бөлінуінің тежелуіне алып келеді .

Гиббереллиндер (олардың жетпістен астам түрі белгілі) дитерпеноидтарға жатады. Олардың ішінде танымалдары гиббереллин – А3, гибберел қышқылы (ГҚ). Қазіргі таңда барлық белгілі гиббереллиндердің үштен бірі физиологиялық белсенділікке ие және олардың химиялық құрамы мен биологиялық әрекеті арасындағы байланыс белгісіз қалып отыр. Өсімдікте гиббереллиндер үнемі қозғалыста болады, олардың концентрациясы да өзгереді. Гиббереллиндер тасымалы полярсыз, олар ксилема және флоема бойымен базипетальді және акропетальді қозғалады, сол себепті тасымалдау жылдамдығы өте жоғары.

Гиббереллиндер өсімдіктің барлық мүшелерінде кездеседі, әсіресе  жас өсіп келе жатқан ағзалар оларға бай. Гиббереллиндер өсімдіктерде  бос қышқыл күйінде емес, олардың әртүрлі туындылары ретінде кездеседі. Гиббереллиндер байлаулы және төмен молекулярлы заттармен конъюгирленген болып бөлінеді. Соңғысының өзіндік ерекшелігі – төмен белсенділігі болып табылады.  Глюкозидтердің пайда болуы, тасымалдау және қордағы түрлер рөлін атқаратын гиббереллиндердің инактивациялық мехнанизімінің нәтижесі болып саналады.

Өсімдіктегі гиббереллиндер мен антигиббереллиндердің арақатынасы (этилен, АБҚ) өзгеріп отыратын қоршаған орта жағдайларына байланысты және онтогенез барысында үздіксіз өзгеріп тұрады .

Экзогенді гиббереллиннің жапырақтарға әсері, сабаққа әсер еткендей айқын байқалмайды. Көп жағдайда олардың пішіні мен өлшемінің, ал кейде олардың санының өзгерісі байқалады. Қос жарнақты өсімдіктерде көбіне жапырақ сабағы ұзарады, ал оңтайлы жағдайларда жапырақтың ауданы да ұлғаюы мүмкін. Гиббереллинмен өңделген жапырақ тақтасы ауданының ұлғаюын  П.Т. Болгарев М.К., Мананков, Е.К. Плакида, В.И. Габович, Дидух [47] сияқты ғалымдар байқаған.

Гиббереллиндердің тамыр жүйесін өсіруге әсері туралы мәліметтер кереғар. Көптеген зерттеушілер гиббереллиндердің тамыр жүйесін дамытуға кері әсер ететінін растайды, алайда питакты өсімдіктерді немесе олардың жекелеген мүшелерін өңдеу кейде тамыр қалыптасуын үдетеді.

Өсімдіктің қолайсыздықтарға төзімділігі үшін АБҚ рөлі өте маңызды, АБҚ-да ЦТК сияқты қолайсыздыққа қарсы тұратын ақуыздар синтезін индуцирлендіреді. АБҚ синтездеуге қабілетсіз өсімдіктер тез солып қалады. Этилен секілді АБҚ-да концентрациясының белгілі бір деңгейінде тамырдың қалыптасуын үдетуге әсер етеді .

Этилен өсімдіктің өмір шеңберінде өте маңызды рөлге ие. Ол тек қана жемістер мен қартайған өсімдік ұлпаларында емес, сонымен бірге ювениалдық өсімдік ұлпаларында да қалыптасады.  Этилен қоршаған ортаға тез бөлініп қана қоймайды, этиленгликольге ауысатын, этилен тотығын түзе отырып тотығуға ұшырайды. Соңғысы этаноламинге және СО₂ — ге (көміртегі) айналады немесе глюкозидирленеді. Этиленнің тотығуы оның қандай да бір физиологиялық белсенділігімен байланысты.

Жоғарғы өсімдіктерде этилен синтезі қарқынды онтогенездің екі кезеңінде  жүреді: өсімдіктің жасушалары бөлінгенде және жасушалар мен мүшелері қартайған кезде.

Физиологиялық белсенді заттарды толтырмалармен (тальк, ағаш, көмір) ланолин пастасы, сұйық шаруашылық сабыны қоспаларымен қолдануға болады.

Бір түрдің қалемшелерін өңдеу барысында өсу реттегіштерінің оңтайлы  мөлшері, бұтақтардың физиологиялық күйіне, олардың жасы мен сүректелу деңгейіне, сонымен қатар қалемшелеу мерзіміне байланысты өзгеруі мүмкін. Қалемшелер өсу реттегіштеріне тамыр бастамаларын салу кезінде айтарлықтай сезімтал келеді [13].

Жасыл қалемшелерді өңдеу кезінде тамыр қалыптасуын реттеудің басты рөлі ауксиндерге тиесілі.

Оқшауланған мүше су, минералдық заттар және гормондардың жетіспеушілігінен күйзеліске ұшырайды. Көбейтудегі қайта қалпына келтіру үрдісінде қосалқы тамырлардың пайда болуына алып келетін,  құрылымдық және метаболикалық үрдістердің қайта құрылуы жүреді. Транспирациялық ағыспен қалемшелерге енгізілген ИУК басында барлық қалемше бойына бірдей тарайды,  алайда төменгі бөлігінде тамыр қалыптастыру үрдісі белсенді бола бастағанда, ол меритемизацияның жаңа аймақтарына қарай бағыт алады және қалемшенің жоғарғы жағына толық көтеріледі.

Жасыл қалемшелердің бастамасын белгілі бір концентрациядағы ауксиндермен өңдеген кезде камбий және тамыр паренхима жасушалары су және қоректік заттарды сіңірудің орталығына айналатындығы анықталған. Бұл жасушалардың созылуына, цитоплазманың жаңадан қалыптасуына және олардан қосалқы тамырлар қалыптасатын, жасушалар бөлінуіне, жаңа меристемикалық ошақтың пайда болуына алып келеді.

Алайда көшеттіктерде өсу реттегіштерін қолдану, препараттар бағасының жоғарылығынан және қол жетімсіздігінен және де олардың улылығынан шектелген. Сондықтанда қол жетімді, пайдалы концентарцияның кең ауқымына ие, дұрыс араластырмаған жағдайда кері әсері болмайтын, улылығы жоқ, арзан және экологиялық қауіпсіз тамыр қалыптастырушы үдеткіштер қажет.

Крезацин

Крезациннің жұмыс механизімі, олардың мембрананы тұрақтандыру қасиетінде және майлардың тотығу-тотықсыздануын тежейтін, мембранадағы А және Е дәрумендері мөлшерін арттыруда болып тұр. Крезацин генеративті даму мен жануарлардың өнімділігін үдетеді.

Крезацин жүзімді өсімдіктердің төмен температураға төзімділігін арттырады [56],  жүзімнің және басқа да ауыл шаруашылығы дақылдарының өнімділігін және сапасын жоғарылатады. Крезацин препараты қызанақ және картоп дақылдарына тиімді әсер ету жағынан этанолды препарттардан қалыспайды .

Алма ағашының қарапайым Антоновка сортын жеке крезацинмен және дропп препаратымен қоспада өңдеген кезде, жеміс салмағын ұлғайтуға, дақыл өнімділігіне және жемістің тауарлық сапасына оң әсерін тигізген. Крезацинді қолдану жемістерді сақтау кезінде сақталғыштығын ерекше жоғарылатты. Крезациннің судағы 200 мг/л. концентрациясымен, өріктің «Скороплодная» және «Евразия-21» сорттарын жаппай гүлдеу фазасында бүрку, жеміс байлау мен өнімділікті арттыруға мүмкіндік берді.

Мивала

Мивала әсері арқылы жасушалар бөлінуі үдетіледі. Өсімдік мүшелерінің қосымша бүршіктері салынады немесе бар бүршіктердің өсуі күшейеді, өсімдіктің қоршаған ортаның қолайсыз факторларына төзімділігі артады .

Жаңа өсу реттегіштері әсерінің  ерекшелігі олардың өсімдіктердегі физиолого-биологиялық үрдістерді күшейтуі және бір уақытта аурулар мен қолайсыздықтарға төзімділігін арттыру болып табылады.

Соңғы кездерде фито реттегіш қасиеттерге ие, әртүрлі өсімдіктерден бөлінетін заттарды іздеу мен сәйкестендіру жүргізілуде. Әртүрлі жабайы және мәдени өсімдік түрлерінен алынған препараттарда онтогенезді басқаратын,  жасушалар бөлінуін, ақуыз синтезін, өсімдіктің өсуі мен дамуын үдететін, табиғи фитореттегіштер бар .

          Қазіргі уақытта адвентивті өркендердің дамуын үдету үшін қажетті  өсуді реттейтін тиімді концентрациялар (2,0мг/л 6-БАП+0,5 мг/л НУК) анықталды.  Өркендердің қалпына келу қабілетінің артуына   эксплант жапырақтарының қоректік ортамен жанасуы ықпал етті.

          M.R.Welander (1988), C.D.Onofrio, S.Morini (2003)  алма және алхоры жапырақтары сегментінің морфогенезін  тікелей және соматикалық эмбриогенез кезінде бақылаған.

          В.А. Долгов басқа ғалымдармен  авторлық бірлікте (1993) шиенің алты сортының  шінде тек «Комсомоьский» сортынан ғана жапырақ дискісінің 10-15 % ғана  қайта қалпына келу жиілігін байқаған. Риогенез арқылы регенерант алудың екі баспалдақты әдістемесі ғана адвентивті өркендердің дамуын 35% арттырды.

          В.А. Лебедев және басқалар (2004), С.А.Муратова (2005)  үй алмұрты пен алхорысының соматикалық жасушалары  қалпына келуінің тиімділігі өсімдіктің генотипі,  ортаның құрамы және экспланттың типі секілді негізгі фактормен және бірнеше  қосалқы факторлармен анықталатынын көрсетті.

1. Liu, Sanford (1988), Н.В.Соловых (2003) тікелей органогенез кезіндегі рқалпына келуге қабілеттілігі бүлдірген сорттарының генотипіне әсер ететінін  айтты.

          Жеміс дақылдарының соматикалық жасушаларынан болған тікелей органагенездердің стимуляция арқылы  осындай жетістіктерге жетуіне қарамастан, өте жоғары жиілікте in vitro  қалпына келуі ең сенімді өсімдік материалының алынуына қатысты мәселе шешілмеген.

 

          1.2 Микроклонды көбейтудің тарихы

          Табиғатта өсімдіктердің көбеюі екі түрлі жолмен жүреді: жыныстық (тұқым арқылы) және вегетативті. Екі әдістің де өзіндік артықшылықтары мен кемшіліктері бар.

          Тұқым арқылы көбеюдің кемшіліктеріне тұқым материалының генетикалық алалығы және ювенильдік мезгілдің ұзақтығы жатады.

          Вегетативтік көбеюде аналық өсімдіктің генотипі сақталады да, ювенильдік мезгіл қысқарады. Алайда, көптеген өсімдіктер вегетативтік жолмен көбейе алмайды,  мұндай өсімдіктердің   қатарына көптеген сүректі өсімдік түрлері жатады. Мысалы: ювенильдік мезгілінде де еменнің, қайыңның, шыршаның, жаңғақ жемістілердің көбею нәтижелілігі төмен болады. Бұдан басқа 10-15 жастан асқан ағаштектес өсімдіктердің көптеген түрлерін саптау арқылы көбейту мүмкін емес. Стандартты отырғызылатын материал алу өте қиын, себебі мұндай кезде  инфекциялардың сақталу және берілу мүмкіндігі бар. Екпе көшет көмегімен көбейту операциялары  қиын және ауыр.

          Клетка және ұлпа дақылдары саласындағы жетістіктердің бірі-  вегетативті көбеюдің жаңа әдісі — өсімдіктерді микроклональды көбейту пайда болды.

           Өсімдіктердің микроклональды  көбейту  — өсімдіктерді in vitro жағдайында жыныссыз жолмен көбейту.   Соның нәтижесінде пайда болған өсімдіктер   генетикалық тұрғыдан өзара  бірдей болады.

       Маманданған ұлпаның кез келген тірі клеткалары лайықты қоректік ортада өсіргенде, өздерінің тотипотенттік қасиетін жүзеге асырып,  қалпына келу арқылы бүтін өсімдікке айнала алады. Жеке клеткалардан сол түріне тән барлық белгілері мен қасиеттері сақталған бүтін өсімдіктің түзілуі микроклональды көбейту технологиясының негізін қалайды. Клон деген — жыныссыз жолмен, яғни вегетативті көбею жолымен түзілген организм (ағза). «Клон» терминін 1903 жылы Уебстермен  ұсынған ( klon-грек тілінен аударғанда саптау немесе өркен деген мағына береді). Ғылыми терминологиямен сәйкестендіргенде біркелкі клеткалардан бірдей организмдерді алу деген мағынаны береді [14].  

Микроклонды көбейтудің негізін салған француз ғалымы Жан Морель болып саналады. Ол ХХ ғасырдың 50 жылдары микроклонды көбейту  әдісін   регенерантты орхидеяны алуға пайдаланған. Ең алғаш эксплант ретінде қалампырдың, бақытгүлдің, күнбағыстың, бұршақтың, жүгерінің және т.б. шөптесін өсімдіктердің апикальді меристемалары алынған. Көршілес жатқан Ресейде микроклонды көбейту бойынша жұмыстар 30-жылдарда өсімдіктер физиологиясы институтының  дақылдар ұлпалары  мен морфогенезі лабороториясында басталған. Р.Г.Бутенконың басшылығымен картоптың, қант қызылшасының, қалампырдың, гербераның микрокөбейтілуінің жағдайлары зерттелінген. Ұлпа дақылдары  бойынша жұмыстар Қазақстанда (Алматыда) 1975 жылы Бас ботаникалық бақта басталды, содан соң Молекулалық биология және биохимия институтында, содан кейін  Әл-Фараби атындағы Қазақ Ұлттық Университетінің  өсiмдiктану институтында жалғастырылды.  Қазiргі кезде  бұл саладағы iргелi зерттеулер Өсiмдiктер биологиясы мен  биотехнологиясы институтында жүргiзiлуде. Қазақстанда биотехнологиялық мектептің негiзін салушылар И.Рақымбаев пен М.Айтхожин болып табылады.

       Дүниежүзілік сұрыптау тәжiрибесiнде микроклонды көбейту әдісін   жеке сорттардың тез және тиімді көбеюi үшiн, бастапқы материалдың ең төменгi мөлшерінен сирек кездесетiн формаларын көбейту үшін қолданады. Қазiргі кезде шеттетiлген ұлпалар әдiсiмен алмұрт, алма ағаштары, шие, қарақат, шабдалы, өрiк,  бүлдiрген, таңқурай, жүзiм сорттарын да екі-екіден көбейтедi.

 

       1.3 Өсімдіктерді микроклонды көбейтудің артықшылықтары

 

        Микроклонды көбейтудің мынадай артықшылықтырын атауға болады:

1. Көбею коэффиценті өте жоғары (шөптектес өсімдіктерде бұталарда, ағаштарда, қылқан жапырақтыларда анық байқалады).

Мысалы, гербера, бүлдірген, бақытгүл, раушанның бір өсімдігінен in vitro жағдайында бір жылдың ішінде 1 миллионнан астам клон өсімдіктер алуға болады. Алма ағашының бір бүршігінен 8 айдың ішінде 60 мыңнан астам өркен шығады. Таңқурайдың бір бұтағы меристемаларын бөліп алып өсіріп жылына 50 мыңға дейін өсімдік алуға болады. Сонымен микроклоналды көбейтудің  коэффиценті басқа вегетативтік көбею әдістерімен салыстырғанда мыңдаған есе артық.

2. Микроконалды көбейтумен қатар өсімдіктер вирустар мен патогендік микроорганизмдерден сауықтырылады.
3. Сұрыптау процесін жылдамдату. Жаңа сорттарды тез көбейтіп, оларды ауылшаруашылық өндірісінде пайдалану мерзімі едәуір қысқарады.
4. Вегетативтік жолмен көбейе алмайтын өсімдіктерді, мысалы, пальманы тек in vitro жағдайында көбейтуге болады. Осы әдіспен өнеркәсіп деңгейінде бірқатар өсімдіктерді көбейтеді.
5. Үнемділік. Арнайы бөлмеде стеллаждарда орналасқан пробиркаларда жыл бойы мыңдаған өсімдіктерді өсіру арқылы жылыжайлар алаңы үнемделеді.
6. Жас өсімдіктерді алу, яғни кәрі дарақтарды жасарту.
7. Өсу процесін жыл бойы үзбеуге болады, әсіресе бұл даму кезеңінде тыныштықта  болатын өсімдіктерді көбейтуге тиімді [15].  

 

                   1.4  Микроклонды көбейтудің әдістері

          Микроклонды көбейтудің түрлі әдістерін ғалымдар  ол кезде өтетін морфогенездің өзгешеліктеріне қарай жіктейді. Н.В. Катаева мен Р.Г. Бутенко микроклонды көбейтудің  әдістерін былай жіктеуді ұсынады:

а)  бұрыннан болған меристемалардан өскен өсімдіктер;

б)  жаңадан пайда болған меристемалардан өскен өсімдіктер.

         Бірінші типті өсімдіктер бүтін өсімдікте бұрыннан болған меристемаларды сабақтың апексі, қолтық пен тыныштық күйіндегі  бүршіктерді активтендіру жолымен пайда болады. Бұл меристемадан шыққан өсімдіктер генетикалық жағынан аналық өсімдікпен пара пар, өйткені апекстерді in vitro жағдайында өсіргенде олар генетикалық тұрақтылығын сақтайды. Өсімдіктердің меристемалары in vivo жағдайында үздіксіз белсенді пролиферациялық күйде болады. Олардың генетикалық тұрақтылығы ДНҚ- ның репарация жүйесінің  белсенділігі жоғары болғандықтан және де өзгерген  жасушалардың вегетативтік сұрыпталуына байланысты болады.

 

 

 

 

1 сурет — Алманың төбе бүршігінің көлденең кесіндісі. Белгілеу: M – апикальды меристема; Л – жапырақ.

 

          Екінші типті өсімдіктер in vitro жағдайында пайда болған бүршіктер мен эмбриондардан алынады. Бұл өсімдіктерде маманданған және каллус  жасушаларынан шыққандығына байланысты генетикалық өзгергіштіктер орын алуы мүмкін. Сондықтан, шыққан клондар бастапқы өсімдіктен біршама ауытқып кете беруі ықтимал.   Сөйтіп бұл әдісті тек каллустары тұрақты немесе регенеранттарда пайда болған өзгерістері табиғи өзгергіштіктен  аспайтын өсімдіктерге пайдалануға болады.

Бүршіктер мен эмбриондар былай пайда болады:

1) экспланттың маманданған клеткаларынан тікелей (көбейме мүшелері ұлпаларынан, эпидермистен, субэпидермис ұлпаларынан, жапырақ мезофилінен  т.б.)

2) экспланттан шыққан алғашқы каллустан

3) көшіріп отырғызылған каллустан немесе суспензиядағы клеткалардан [16].

 

          1.5 Микроклонды көбейту процесінің кезеңдері

 

          Микроклонды көбейту жұмысы төрт сатыдан тұрады:

          1- саты. Экспланнты in vitro жағдайында өсіру. Бұл кезде толығымен залалсызданған эксплантты алып, лайықты қоректік ортаға отырғызып, оның жақсы өсуіне қолайлы жағдай туғызу керек. Бұл сатының нәтижелілігі эксплантты дұрыс таңдап алуға байланысты. Ол үшін донор өсімдіктің әр даму кезеңінде ұлпаларынан немесе мүшелерінен экспланттар алынып, олардың in vitro жағдайында өсу және морфогенездік қабілеттері зерттеледі.

          2- саты. Микроклонды көбейту — бастапқы және жаңадан пайда болған өркендердің апикальдік басымдылығы жойылу арқасында экспланттың барлық қолтық бүршіктерінің дамуы.

-апикальдық басымдылықты көрсететін өркенді микроқалемшелеу

-жапырақ, сабақ, пиязшық қабыршықтары мен түбіртектері, тамырсабақ, гүлшоғыры бастамаларының ұлпаларынан адвентивтік бүршіктердің пайда болуын индукциялау.

         3- саты. Өркендерді тамырландыру және оларды сақтау. Жақсы тамыр жүйесі пайда болуына және дамуына жағдай туғызу. Ол үшін қоректік ортаға ризогендік факторы, яғни ауксин қосылады. Тамырлар өсіп жетілген соң өсімдіктерді топыраққа көшіруге дайындайды немесе салқын жерге қояды. Төмен температура өсімдіктердің дамуын тежеп, ұзақ уақыт сақтауға мүмкіндік береді.

        4-саты. Өсімдіктерді топыраққа отырғызу. Өсімдіктерді топыраққа отырғызу алдында оларды арнайы дайындайды, сол үшін ауаның ылғалдылығын және жарықтың қарқындылығын арттырады. Өсімдіктер гетеротрофтық қоректенуден автотрофтық қоректенуге өтеді. Бұл ұқыптылықты талап ететін ең маңызды саты. Осы сатыда өте сақ болу керек, себебі өсімдіктердің көбі бейімделе алмай шығын болуы мүмкін.

       Бірқатар өсімдіктерде технологияның бірінші сатысындағы негізгі қиындығы клеткалардың  өздері ортаға бөліп шығаратын улы заттардың экспланттың өсуін тежеуі. Эксплантты антиоксидантпен (мысалы аскорбин қышқылы) жуып тастау, тіпті оны қоректік ортаға қосу да қажет. Кейбір ағаш өсімдіктерді көбейту технологиясында қиыншылықтар 3 сатыға байланысты. Онда Мурасиге-Скугтың қоректік ортасының негізгі құрамын өзгертеді (тұздардың мөлшерін екі есе азайтып немесе Уайттың ортасына аустырады) сахарозаның мөлшерін 0,5-1% ке дейін төмендетеді, цитокининдерді шығарып тастайды, ауксиндерді қосады. Кейде тамырдың түзілуін хлороген мен ферула қышқылдары қоздырады [17].

 

 

1.6  Өсімдіктерді микроклонды көбеюіне әсер ететін факторлар

         In vitro жағдайында  қалпына келу жылдамдығы өсімдіктер түріне байланысты болады, яғни бұл ретте генотиптің әсері күшті болады. Мысалы, қос жарнақты шөп текті өсімдіктердің  дара жарнақты және ағаш өсімдіктерге қарағанда  қалпына келу қабілеті едәуір жоғары. Өсімдіктің әр түріне ең тиімді  қалпына келу әдісі іріктелініп алынады. Эксплант бөлініп алынатың өсімдіктер аурудан сау болуы керек. Жылыжайда өсіретін болса, жапырақтарына су шашыратпай өлшеулі суару керек, ауаның ылғалдылығы төмен болуы қажет. Мұндай әдісті жүзеге асырудағы ең   қолайлысы асептикалық ыдыстарда өсірілген залалсыздандырылған өскіндер болып табылады.

       Іс жүзінде жалпы алғанда, егер де эксплант жарамды даму кезеңінде алынса, өсімдіктің кез келген бөлігінен регенерант алуға болады.   Эксплантты таңдап алудың маңызы өте зор. Ең жақсысы, егер эксплантта меристемалық ұлпалары мен мүшелері пайдаланылса, атап айтқанда: өркеннің ұшын, қолтық бүршігін, меристемасын таңдап алу керек. Олар in vitro жағдайында жақсы өседі және тотипотенттілігі жоғары болады.

       Негізінде кез келген өсімдіктің түрі белгілі тәсілдерді қолданса, каллустан да регенерант ала береді. Эксплант алынатын  өсімдік неғұрлым жас болса, соғұрлым одан шыққан каллустың  қалпына келуге қабілеті жоғары болады. Ювенильдік кезеңдегі өсімдіктерден, яғни өркендерден алынған каллустың морфогендік потенциалы ең жоғарғы болады. Экспланттың физиологиялық жасы каллуста өтетің морфогенез жолына да әсер етеді. Мысалы, Echeveria elegans жас жапырағының экспланттарынан өскен каллустарда көбінесе тамырлар пайда болған, қартайған жапырақтарынан —  өркендер, ал орта жастағы жапырақтан – тамырлар мен өркенлер пайда болған.

        Микроклонды көбейту үшін  эксплант алынатын мүшенің де маңызы зор. Сонымен қатар, экспланттың морфогендік қабілетіне, оның көлеміне  ықпал етеді. Неғұрлым эксплант кішкене болса, соғұрлым оның органогенезге қабілеті төмендейді. Ірі экспланттардың генетикалық тұрақтылығы артады, бірақ бұл кезде олардың клеткаларында вирустар сақталып қалуы мүмкін. Сондықтан практикада экспланттың орташа көлемін іріктеп алады.

        Микроклонды көбейту технологиясында қоректік ортаның орны ерекше, әрбір өсімдік түрі үшін оның құрамы тәжірибеге сүйеніп іріктеледі. Ең жиі қолданылатың Мурасиге-Скугтың ортасы каллустың пайда болуына және оның өсуіне лайықты, яғни микрокөбейтудің бірінші  кезеңіне ыңғайлы болады. Егер де микроклонды көбейту қолтық бүршіктерін өсіру арқылы өткізілсе, каллустың пайда болуы ұнамсыз құбылыс болып табылады. Сондықтан бұл әдіске каллус түзілуін тежейтін басқа қоректік орталар қолайлы келеді.

        Көптеген өсімдіктер айтарлықтай мөлшерде фенолдық заттарды синтездейді. Эксплантты өсімдіктен бөліп алғанда зақымданған ұлпаларда фенолдарды тотықтыратын ферменттер (түрлі фенолазалар) активтенеді, ал фенолдардың тотығу нәтижесінде түзілген заттар эксплант клеткаларының бөлінуі мен өсуін тежейді. Бұл заттардан құтылу жолдары  каллустарды жиі-жиі жаңа ортаға көшіріп отыру немесе қоректік ортаға оларды өздеріне адсорбциялайтын заттарды, антиоксиданттарды қосу болып табылады [18].

 

        1.8 Микроклонды көбейту әдісін қолдану және оның болашағы

 

          Микроклонды  көбейтудің толып жатқан артықшылықтары болса да, ол өте көп еңбек пен қаржыны талап етеді. Дүние жүзінде клондық микрокөбейту әдісінің технологиясы лабораториялық деңгейде екі жарым мыңнан астам өсімдік түрлеріне дайындалған [20]. Сонымен бірге, бұл әдіс селекция мен негізгі ғылыми зерттеулердің мақсатымен  байланысты, атап айтқанда:

1. Өте құнды жеке генотиптер мен жаңа бағалы сорттарды жылдам және тиімді көбейту.
2. Гетерозистік будан тұқымды шығару үшін қажет линияларды алу және оларды тиімді көбейту.
3. Генетикалық жағынан біркелкі ұрпақты алу үшін, өте бағалы таңдаулы (элиталық) өсімдіктерді көбейту (мысалы, жалғыз жарым гаплоидтық өсімдіктер немесе клеткалық және гендік инженерия әдістерімен алынған өсімдіктер.
4. Вирустар мен патогендік микроорганизмдерден таза жеміс, көкеніс, өсімдік дақылдарының көшеттерін алу және оларды тез көбейту.
5. Сирек кездесетін және жоғалып бара жатқан  өсімдік түрлерін сақтап қалу. І. Рақымбаев әріптестерімен сирек кездесетін запран (шафран), әсия (унгерния), шөпжияр (иксилирион), бірнеше пияздар түрлерін, сонымен қатар лалагүл (лилия), баршынгүл (гладиолус), нәркес (нарцисс) өсімдіктерді in vitro вегетативтік өсіру әдістерін зерттеп дайындады. Бұл сирек кездесетін және жоғалып бара жатқан түрлерді сақтауға, ұдайы өндіруге мүмкіншілік туғызады және әсемдік гүлдердің бірегей сорттарын көбейтуге қолданылады.
6. Кейбір бағалы екпе және жабайы ағаш тұқымдарында көбею коэффиценті төмен болады, сонымен бірге тұқымдық ұрпағында кейбір қасиеттері сақталмайды. Ал әдеттегі вегетативтік жолымен олар өте баяу көбейеді (қылқанды өсімдіктер) немесе мүлдем көбейе алмайды (пальма).

          Ағаш түрлерін өсіру және олармен селекциялық жұмыс жүргізу көп уақытты керек етеді, себебі олардың жыныстық жолмен көбейуі өте ұзақ мерзімде өтеді. Бұдан басқа ағаштардың экономика жағынан маңызды көптеген түрлері ұрпақсыз болады, оларды жақсарту үшін әдеттегі селекция әдістері жарамайды. Даражарнақты пальмалар мен кейбір орман өсімдіктері тіпті әдеттегі вегетативтік жолмен де көбейе алмайды. Сондықтан ағаштар үшін in vitro жағдайындағы вегетативтік көбейту баға жетпес әдіс. Мысалы, Европа, Канада, АҚШ өндірістік лабораторияларында қолтық бүршіктерін  in vitro өсіріп жеміс ағаштардың телітушілерін көбейтеді.

          Көптеген жеміс ағаштары телінуші сорттарының қалемшелерін тамырландыру өте қиын процесс. Сондықтан in vitro жағдайында көбейтілген тамырлары бар алма, шие, қара өрік, алмұрт ағаштары өте бағалы. Көптеген ағаш тұқымдарын ювенильдік даму кезеңінін өзінде вегетативтік жолмен көбейту өте қиын (қылқан жапырақтылар, емен, жаңғақ жемісті өсімдіктер, т.б.).  Жасы 10-15 жылдан асқан ағаш өсімдіктерін қалемшелеу арқылы көбейту жалпы алғанда мүмкін емес. Ал тұқыммен көбейткен кезде қалаулы белгілері бар біркелкі популяция алынбайды. 

          Солай болғандықтан жаңа тез өсетін, жылдам пісетін, ауруларға төзімді линияларды алу үшін көбейтудің жалғыз тиімді жолы — ол in vitro жағдайында көбейту. Қазіргі таңда  40 тұқымдасқа жататын  200-ден астам ағаш түрлері in vitro көбейтіледі  (каштан, емен, қайың, үйеңкі, терек, көк терек, қарағай, шырша, тал, қандағаш, шетен, бозарша, апша, секвойя, эвкалипт т.б.) [21].

          Биотехнологияның заманауи тәсілдері өсімдіктерді клондаудың тиімділігін арттырып отыр. Соматикалық тінді көбейтуге қатысты жаңа зерттеулер жаңа тәсіл — клонды микрокөбею тәсілін ұсынды. Негізі бұл тәсіл  вегетативті көбею тәсіліне сәйкес келеді, айырмашылығы – барлық әрекет in vitro  жағдайында өтеді.

          Жасанды жағдайда бөлінген тіндер мен ағзалардан алынған  жасушалардан өте көп мөлшерде өсімдік-регенеранттар алуға болады. Жоғарғы коэфицентті көбею, өз прототипіне генетикалық толыққанды ұқсастық, регенеранттардың ювенильді кезеңнен дамудың репродуктивті кезеңіне жедел көшуі, төменгі температурада пробиркадағы өсімдіктердің ұзақ уақыт сақталу мүмкіндігі, өсіретін жер көлемін үнемдеу және т.б. басымдықтары бар in vitro  технологиясы жаңа, элиталық, бағалы  сорттарды алуға мүмкіндік береді. In vitro жағдайында өсімдіктерді көбейтуді дақылдардың жекелеген апекстерінің көмегімен, каллустан пайда болған  адвентивті өркендерден, соматикалық эмбриогенездердің бастапқы экспланттарының  тінінен алуға болады.

          Клональды микрокөбею тәсілінің басты шарты —  генетикалық бірізділігін толық сақтау. Сондықтан осы мақсатта  өсімдіктің  апексін (меристематикалық ұштары) пайдаланған дұрыс, себебі in vitro   жағдайында олар генетикалық тұрақты, диплоидты  болып қалады.

          Меристематикалық тәсілді ең алғаш рет орхидеяны  тез көбейту  мақсатында  G.M.Morel қолданғаны туралы біз айтып өттік.   Қазіргі уақытта осы процеске  генетикалық, физиологиялық, гормональдық және физикалық тұрғыдан ықпал ететін факторлар қарастырылған өте көп зерттеулер және соған сәйкес жарияланымдар жеткілікті.  P. Limasset және  P.Cornuet өсімдіктегі вирустың шоғырлануы меристиматикалық ұшына жеткенде төмендейді де біртіндеп меристимадағы вирустық инфекция жоғалады. Сондықтан да in vitro меристемаларын өсімдіктерді  вирустар мен  өзге де патогендерден ажырату үшін де пайдаланады Өткізілген зерттеулерге сәйкес, клональды микрокөбею дегеніміз — жеке генотиптерді жылдам көбейтудің, жаңа, ауырмаған дені сау материал алудың  және  ең бастысы селекциялық процесті барынша жылдам өткізуге мүмкіндік беретін вегетативті көбеюдің жаңа және тиімді әдісі болып табылады.

          Қазіргі уақытта клональды микрокөбеюге қатысты бірегей классификация жоқ. Ең алғашқы классификацияны Т.Мурасиге жасаған. Жасалушы экспланттар тінінде өткізілген морфологиялық реакциялардың негізінде  ғалымдар мынадай  тәсілдерді анықтады: 1) қолтық меристималардың белсенділігі; 2) адвентивті өркендердің пайда болу индукциясы; 3) соматикалық эмбриогенез.

1. Hussey каллусты (тіннен) ұлпадан пайда болған адвентивті өркендер мен  эксплант жасушаларынан  пайда болған өркендердің дамуы секілді екі  тәсілін қосты.
2. Hempel клональды микрокөбеюдің морфогенетикалық реакциялар мен өсіру кезеңдеріне нгізделген тағы да үш тәсілін сипаттайды: 1) өсімдікті эксплант жасушаларынан тікелей қалпына келтіру;

2) вегетативті дамыған, белсенді ұлғаю кезеңінде пайда болған бүршіктер;

3)  каллустың пайда болуы, оның ұлғаюы және одан өсімдік қалпына келуі.

          H.W. Kohlenbach өсімдіктің микрокөбеюі кезінде қолданылатын соматикалық эмбриогенездің үш типін бөліп қарастырады: вегетативті  ұлпаларды каллустың пайда болуына бағыттау (1-тип), репродуктивті ағзаларды содан соң соматикалық эмбриогенезді каллустың пайда болуына бағыттау (2-тип), каллустың пайда болу стадиясынан бөлек өсімдіктің ювенильді ұлпаларынан адвентивті эмбриоидтардың пайда болуы (3-тип).

          Н. Катаева және Р.Г. Бутенко клональды микрокөбею процесін екі  типке бөлуді ұсынады: 1) өсімдікте бар меристималардың (сабақтың  апексі, сабақтың ұйқыдағы  бүршіктері мен   қолтық бүршіктері) дамуын белсендендіру; 2)  үш әдіске бөлуге болатын de novo эмбриоидтары мен бүршіктердің пайда болу бағыты: а) экспланттардың арнайы  ұлпаларынан пайда болған құрылымдар (репродуктивті ағзалар ұлпасы, эпидермис,  қабыршақ пен  жапырақ  мезофилласы және т.б.); ә) эксплант жасушалардан пайда болған алғашқы каллустан; б) суспензиялы дақылда өсетін көшетті каллусты ұлпадан немесе жасушадан.

          Клональды микрокөбею келесі  кезеңдерден тұрады:

1. in vitro дақылына экспланттарды енгізіп, ары қарай өркендер мен бүршіктер пайда болғанға дейін өсіру. Бұл  кезеңге кіретіндер:

         — аналық өсімдіктерді таңдау;

         — таңдалып алынған өсіру материалын зарарсыздандыру;

         — зарасыздандырылған жағдайда эксплантты  оқшаулау және оларды  пробиркадағы қоректік ортаға орналастыру;

         — эксплантты  арнайы жарығы бар климаттық бөлмеде  өсіру.

2. Өркендер мен бүршіктердің ұлғаюы негізінде микрокөбею. Жаңа қоректік ортаға бір немесе бірнеше көшіріліп отырғызылған in vitro көбею көшеттерді шемен тастарға бөлумен жалғасады.
3. Көбейтілген микроөркендерді in vitro жеделдету.
4. Пробиркідегі өсімдіктерді зарасыздандырылмаған жағдайдағы ашық грунтқа бейімдеу.

          Алманың әр түрлі сорттары мен телушілерін клональды көбейту барысында алманың гетерозиготты туыстығының жоғарылығынан арнайы сорттарының көптігі аталып өтілді. Әрбір генотиптің тиімді көбеюі үшін олардың әрқайсысына жеке жағдай жасау керек.

          Бірінші  кезеңге алғашқы шығыс  өсімдігін таңдау,  зарасыздандыру, эксплантты  оқшаулау, қоректік ортада олардың өсіп, дамуына  барынша жағдай жасау әрекеттері кіреді.  Ал алма телімдерін шығыс материалы ретінде табысты көбейту үшін  белсенді өсу фазасындағы (мамыр-маусым)   және қысқы, ерте көктемгі ұйқыдан (ақпан — сәуірдің  басы) шығарылған өркендер пайдаланылады. Микрокөбеюдің осы этапындағы ең маңызды фактор шығыс материалының  зарасыздандырылуы, себебі ұлпалардың жоғарғы беттеріне әр түрлі микрофлоралар жұқтырылған.

          Зарасыздандыратын  заттар ретінде  көбінесе 0,1% диацид ерітіндісі, 6% кальций гидрохлориді ерітіндісі, 0,4% сынап нитраты ерітіндісі, 30% сутегі пироксиді ерітіндісі, әр түрлі концентрациялы «Белизна» ерітіндісі қолданылады.

          Микроклональды көбею процесінің әрбір этапында қоректік ортаның    құрамы  сол  кезеңнің міндетіне сәйкес болуы тиіс. Дақылдарға in vitro   енгізу   кезеңінде   Мурасиге-Скуга (МС) минералына 6-БАП концентрациясын 1 мг/л., сахарозаны 30г/л мөлшерде қосқан  ерітіндіде болған алма телімдерінің нәтижесі жоғары болды (Calamar Ana, de Klerk, 2004). Сондай-ақ көптеген авторлар жеміс, жидек, сәндік өсімдіктерге Мурасиге-Скуга (МС) ортасын модификациялау қолданылуда.  Дақылға енгізу кезеңіндегі тағы бір қиындық – өсу материалы ұлпасының фенол қышқылы өнімдерімен интоксикациялануы, ал ол өсімдіктің кесілген жеріндегі ұлпадан бөлініп шығады.

          Кейбір әдістемелік нұсқаулықтарда алма үшін (Мурасиге-Скуга (МС) ортасынан басқа) Гамбург ортасын (В 5), Кворина-Лепорье (QL) қоректік орталарын БАП-ты 0,3-тен 1,0 мг/л. концентрацияны қосып қолдануды ұсынады.

          Қоректік ортаның минералдық және гармональдық  құрамы ортадағы микрокөбеюдің әрбір кезеңіндегі қойылған міндетке сәйкес болуы тиіс. Бірінші кезеңде қоректік ортаның құрамына отырғызылған экспланттардың өлуі мен гидролитикалық ферменттердің белсенділігін ескертетін антиоксиданттарды енгізеді. Майер ұсынғандай экспланттарды оқшаулауға қатысты барлық операцияларды аскорбин қышқылы сіңірілген фильтр қағазда орындауға болады. Кейде экспланттарды қоректік ортаға отырғызу алдында фенолды қосылыстарды жою мақсатында дистильденген суға бірнеше сағатқа салып алған дұрыс.    Біразғалымдардың жасаған эксперименттерінің нәтижесі бойынша қоректік ортаға белсендірілген көмірді қосу эмбриоидтардың пайда болуы мен өркендердің жақсы өсуіне оң ықпал етеді. Олардың ойынша, белсендірілген көмір эксплант бөлетін улы заттарды сіңіреді. Сондай-ақ белсендірілген көмірдің биологиялық қосылыстарды ортадан сіңіріп алатындығы да анықталған. Сондықтан мұндай орталарға фитогармондардың ең жоғарғы концентарциясын енгізеді.

          Беачизненің пікірінше микрокөбеюдің алғашқы кезеңінде қоректік ортаға казеин гидролизатын, ашытқы экстратын, аминқышқылдарын қосудың маңызы зор.

          Екінші кезеңнің басты мақсаты  жаңа қоректік ортада бар өркендерден алынған әр экспланттан барынша көп өркендер алу. Микрокөбею кезеңінде апикальдың басымдығын  шешу маңызды. Қолтық меристемалардың ұлғаюына ықпал ету үшін қоректік ортаға цитокининді заттек топтарын егізеді: кинетин, 6-БАП, зеатин. Аталған цитокининдердің ішінде алмаға қатысты қолданатын түрі 6-БАП-ты 2 мг/л., кейде 3 мг/л. мөлшеріндегі концентрация. Самусь және басқа ғалымдардың  айтуы бойынша, адвентивті өркендердің  ең көп саны 5,0 мг/л 6-БАП; 0,2 мг/л ИМК және 0,5 мг/л ГА  концентрациясынан тұратын ортада байқалған. Ғалымдардың айтуы бойынша, in vitro  жағдайында  алманы  телу үшін алмаға жоғары сорттылық  тән болу керек. 

          Алманың телімдік клондарының  ұлғаю процесіне 6-БАП-қа аденин-сульфат концентрациясын 50-100 мг/л. көлемінде қосса, процестің жүруіне оң ықпал етеді. Аденин-сульфатты процестің өтуі 1,5-2,0 есе  жылдам өтеді және деңгейі 15-47%  жоғары болады. Алманың телімдік клондарының саны 11, әдетте 4-өсуден кейін өркендердің тамырлануы басталады.

          Кейбір жағдайда қоректік ортаның құрамы екінші кезеңде алғашқы қалпын сақтайды. Басқа жағдайларда ортаны өзге де заттектермен (әсіресе, фитогармондармен) байытып отырады. Олар in vitro морфогенетикалық реакциясына түрткі болып, қозғау салады. Үшінші кезеңде сабақтарының өсуі мен өсімдіктің тамырлануын қамтамасыз ететін орта қажет. Оның құрамы  өте қарапайым, фитогормонсыз, болмаса құрамында ауксині тым аз мөлшерде болады.

          Микроөрендердің тамырлануы микрокөбеюдің сәтті өтуіне тікелей қатысты  аса маңызды және көп еңбекті қажет ететін  кезең болып табылады. Тамырлану кезеңінде in vitro ұзындығы 1,5-3,0 см. өркендерді пайдаланады. Тамырлану  әрекеті екі бағытта жүргізіледі: 1) қоректік ортаға тамырлануға ықпал ететін ауксин тобындағы препараттарды қосу; 2) өркендердің базальдық бөліктерін тамырландыратын препараттармен  өңдеп, өсуді реттеуші препараттардан бос ортаға егу. Кейбір авторлар ауксинді қоректік ортаға енгізуден гөрі соңғы  бағытқа басымдық береді. Алайда ең қарапайым және қолжетімді  бағыт – тамырландыру үдеткішін 1,0-2,0 мг/л. ИМК немесе 3,0-5,0 мг/л. ИУК мөлшерде тікелей ортаға енгізу болып табылады.

          Ризогенез индукторы ретінде индолилмайды (ИМК), индолилосірке қышқылын (ИУК), нафтилосірке қышқылын (НУК) пайдаланады. Алайда, НУК- тің әсерінен білеуленудің пайда болуы  жоғары деңгейде болады, ал мұның өзі тамырдың өсуін қиындатады (Матушкина, Пронина, 2008). Минералды негіз ретінде көбеюді үдету үшін микроэлементтер,темір және дәрумендер  қосылған (Мурасиге-Скуга (МС), Кворина-Лепорье (QL) немесе Кнопп ерітіндісін пайдаланады.

2.9 Жеміс дақылдарын биотехнологиялық әдістемелермен сақтау

Жеміс дақылдарын сақтаудың ең көп тараған үш биотехнологиялық әдістемесі бар. Біздің міндетіміз алманың тектік қорын биотехнологиялық әдістемелердің көмегімен сақтауды зерттеу болғандықтан бұл тарауда сол әдістемелердің мәнін ашқымыз келеді. Жоғарыдағы міндеттерді зерттеу барысында біз үш әдістемені пайдаландық:

 Микроклондау арқылы көбею. Биотехнологияның қазіргі әдістемелері өсімдіктерді клондаудың тиімділігін едәуір арттыруға мүмкіндік берді. Мәселен, соматикалық тканьдарды (организмнің клеткалар тобын) өсіру көбеюдің принципті жаңа әдістемесін жасауға – клондау арқылы микрокөбеюге алып келді.

Бүгінгі таңда in vitro жүйесінде ауыл шаруашылығы дақылдарын (әсіресе, вегетативті көбейетін ) микроклондау арқылы көбейтудің әртүрлі әдістемелерінің актуальдылығы артты. Олар: қуысты және адвентивті бүршіктермен көбею, тікелей емес морфогенез, соматикалық эмбриогенез. Бұл әдістемелерді пайдалану тектік (генетикалық) жағынан аналық өсімдікке ұқсас сауықтырылған, вируссыз материалды қысқа мерзімде алуға; лабораториялық жағдайда жұмыс істей отырып, жыл бойы белсенді өсетін өсімдіктерді қолдап отыруға; өсімдіктерді іс жүзінде абиотикалық және биотикалық факторлардың жағымсыз әсерлері бар сырт дүниемен байланыссыз өсіруге; азғантай жерде барынша көп өсімдік алуға; қиын көбейетін немесе вегетативті көбеймейтін өсімдіктерді қысқа мерзімде арттыруға; өсімдік материалдарын in vitro жағдайында сақтауға мүмкіндік береді. Іn vitro жағдайында регенерациясының (қалпына келтірудің) кез келген типі үшін оны табысқа жеткізетін төрт факторлар тобын бөліп қарауға болады. Олар: генотип және негізгі материалдың жай-күйі, егудің жағдайы мен әдістемелері, қорегінің құрамы, стерильді дақылға зксплантты енгізу ерекшеліктері.

    Өсімдіктер клеткасына ықпал ету әдістемесін жасау мен жетілдірудің салыстырмалы түрде қысқа тарихы бар. Француз ғалымы Жорж Морель орхидеяны микроклонды көбейтудің ХХ ғасырдың 50 жылдарында тұңғыш рет жүзеге асырды. Өзінің жұмыстарында ол өсімдіктердің апикальді меристемасын қолдану техникасын пайдаланды. Осылай өсірілген өсімдікте вирустың инфекция болған жоқ.

    КСРО-да микроклонды көбейту 1944жылы К.А.Тимирязев атындағы өсімдіктердің физиологиясы институтында Н.А.Максимов пен А.А.Прокофьевтің басшылығымен басталып, одан әрі Р.Г.Бутенко жалғастырды. Қазақстанда (Алматыда) бұл жұмыс 1975 жылы Бас ботаникалық бақта басталып, қазіргі     Әль-Фараби атындағы Қазақ мемлекеттік университетінде, Молекулалық биология және биохимия институтында, Ботаника институтында жалғасты. Қазіргі таңда бұл саладағы іргелі зерттеулер Өсімдіктер биологиясы және биотехнологиясы институтында жүргізілуде. Қазақстандағы биотехнологиялық мектептің негізін қалаушылар И.Р.Рахымбаев және М.А.Айтхожин болып табылады.

   Өсімдіктердің клонды микрокөбею әдістемесінің негізгі тотипотенттік, яғни өсімдік клеткаларының белгілі жағдайларда екінші рет дифференциялану қабілеттілігі және сыртқы жағдайдың әсерімен морфогенездің белгілі бір жолын таңдай алуы.

    Бұл әдістеменің дамуындағы ең табысты кезең R. Gautheret (1932) пен F. White (1931) жұмыстарынан басталды. Бұл жұмыстар каллустер мен өсімдік ісіктері тканінің қоректі ортаға көшірілген жағдайда шектеусіз өсетінін көрсетті.

    Клонды микрокөбею тәсілдерін әртүрлі жіктеуге болады. T. Murashige ұсынған солардың бірінде процесті былай жүзеге асыруға болады: 1) қуысты меристемнің белсенділігін арттыру; 2) эксплант тканьдарының адвентивті өсу инициациясы; 3) каллустегі адвентивті өсудің пайда болу инициациясы; 4) эксплант клеткаларындағы соматикалық эмбриогенез индукциясы; 5) каллус тканіндегі соматикалық эмбриогенез индукциясы; 6) бастапқы соматикалық ұрық тканьдеріндегі үстеме эмбриоидтарды қалыптастыру инициациясы арқылы.

   Н.В.Катаева мен Р.Г.Бутенко клонды микрокөбеюдің екі принципті әртүрлі типін ерекшеледі. Олар: 1) өсімдіктің бойындағы меристемнің (сабағының апексі, сабақтардың қуыс және ұйқыдағы бүршіктері); 2) бүршіктердің немесе de novo эмбриоидтерінің пайда болу индукциясы. Бұл өз тарапынан мыналарды қамтиды: а) тікелей эксплант тканьдарының адвентивті өсуінің пайда болуы; ә) соматикалық эмбриогенездің тікелей және тікелей емес индукциясы; б) бастапқы және көшірілген каллус тканьдарындағы адвентивті бүршіктердің дифференциясы. Өсімдіктердің вегетативті көбеюінің дәстүрлі әдістемелерінің бірі – қуысты бүршіктер өсуінің белсенділігін арттыру және қуысты өсуді пайдалану. Ол апикольді үстемдікті болдырмауға негізделген. Бұған екі тәсілмен қол жеткізуге болады: 1) өсімдік сабағының жоғарғы меристемін жою және одан әрі гормонсыз ортада in vitro өсуін микрокелемшелеу. 2) қоректі ортаға 6-бинзиламинопурин (БАП) немесе 6-фурфуриламинопурин (кинетин) және зеатин секлді цитокинин типті қоспаларды үстемелеу. Эксплант ретінде өсуден оқшаулап, цитокининді қоректік ортаға орналастыратын жоғарғы және қуысты бүршіктерді жиі пайдаланады.

    Пайда болған бүршіктерді қажет болған жағдайда келемшелеп тың қоректік ортаға орналастыратын жеке тармақтарға бөледі. Тармақтардың қатары қажетті санға жеткенде коректік ортаға ауксин қосу арқылы in vitro тамырланып, нығая түседі. Содан соң оны өсімдіктің адаптациясына ықпал ететін жағдай жасалған топыраққа көшіреді.

   Клеткалардың негізгі қасиеттерінің бірі – регенерация (қайта келу,қайта өсу). Демек өсімдіктің зақымдалған және жоғалтқан бөлігін организмнің қалпына келтіруі. Бұл жерде кез келген органның бір вегетативті клеткасынан экспериментті жағдайда бүкіл организмді қалпына келтіруге болатынын атап өту керек. Өзінің генетикалық бағдарламасын толық жүзеге асырып, бүтін организмді қалпына келтіруге қабілетті. Қабілеттілігі – өсімдік клеткаларының тотипотенттігінің негізінде барлық жоғарғы организмдерге тән ядролардың омнипотенттігі жатыр. Бұл генетикалық бағдарламаны организмнің барлық клеткаларының толық сақтауы және қайта гендік экспресияға қатаң тиымның жоқтығы деген сөз. Аталмыш қасиеттің соңғысы сабақ немесе тамыр апепстерін, әлде эмбриоген құрылымын одан әрі дифференциация жасайтын меристематикалық күйге өтуге жауап беретін гендердің белседілігін арттыруға мүмкіндік береді. Оқшауландырылған клеткалар, тканьдар қалпына келтіру үшін экспланттың тегі, қоректік ортаның құрамы және күтіп-баптаудың физикалық жай-күйі сияқты біраз жағдайларды ескеру керек.

   Бастапқы эксплант

   Эксплант – тұқымның ішінде дербес дамитын немесе бастапқы каллусты алу үшін пайдаланылатын тканьнің немесе органның үзігі (фрагменті). Қалпына келтіру жұмысында эксплантты таңдау шешуші рөл атқарады. Ең алдымен эксплант меристемоидты клеткаларды немесе меристемоидтыға айнала алатын клеткаларды қамтамасыз етуі керек. Мұндай клеткалар көбнесе арнайы органдармен тканьдарда оқшауланғн болып келеді.

    Мәселен, апикальды және латеральды бүршіктерде жоғары морфогенетикалық потенциалға ие меристемалар бар. Олар шөптік, ағаштық және басқа өсімдіктерді көбейтуге пайдаланылады. Апикальды немесе латеральды меристемді темді пайдалану өсімдіктердің генетикалық көшірмесін алуға, яғни, клондауға мүмкіндік береді.

    Эксплант ретінде, әсіресе, каллусты дақылдарды индукциялау үшін жапырақтың үзігін пайдаланады. Жапырақты таңдау біріншіден, оның морфогенетикалық потенциалының жоғарылығына байланысты. Екіншіден, зерттеушілер үшін дамудың кез келген сатысындағы өсімдіктерді пайдалануға мүмкіндік ашылады. Өсімдік каллугенезсіз-ақ жапырақтан тікелей жолмен қалпына келе алады. Мәселен,  Pyrus communis сияқты.

   Сөйтіп, жаңа және сауықтырылған сорттар үшін микрокөбеюдің мүмкіндіктері ашылады. Сонымен қатар бұл өсімдіктерді түтіктерде және селекцияға пайдалану үшін криоконсервацияның әртүрлі әдістерімен (-196°С) ұзақ сақтауды ұйымдастыруға мүмкіндік береді.

    Суықта сақтау.

    Суықта сақтау тәсілі көп жылдардан бері жер шарының әрүрлі аймақтарында табысты қолданылып келеді. Әсіресе, төменгі жағымды температураны пайдалану арқылы in vitro жағдайында өсімдіктің дамуын баяулату тәсілі кең өріс алды.

    Гэзли жағымды температураны тұңғыш рет пайдалана отырып жүзімді күтіп-баптау жиілігін жылына бір ретке дейін қысқартты.

    Өсімдіктерді in vitro қолайлы жағдайында сақтау кезінде тың қоректік ортада жиі ұстау сақтаудың өзіндік құнын арттырып, қол еңбегін көп қажет етеді. Бұл жағдай сомакальді варианттардың пайда болуына ықпал етіп, жұқпалы ауру жұқтыру қатері де пайда болады. Сондықтан да өсімдік материалының сақтау мерзімін ұзартуға мүмкіндік беретін in vitro өсімдік клеткаларының коллекциясын қолдаудағы ең көп тараған тәсіл төменгі жағымды температураны пайдалану болып табылады.

    Ғылыми дерек көздерінде микроөскіндерді 4°С температурасында жарықты аз беріп сақтау, мұндай экспланттардан қалпына келтірілетін өсімдіктерге зиян келтірмейді. Пластикалық ауа өткізетін пакеттерде +4°С температурада асептикалық өсімдіктердің жеміс беретін түрлері жақсы сақталады.

   Сонымен, дереккөз әдебиеттерін сараптау  барысында биотехнологиялық әдіс тәсілдердің өзекті екендігіне мүмкіндік болып отыр.                                 

  2 Негізгі бөлім

 

     Зерттеудің мақсаты: Алма дақылын микроклондық әдіс арқылы көбейтіп өсіру. Алға қойған мақсатымызға жету үшін алдымызға төмендегідей міндеттерді қойдық:

1. Жасанды қоректік ортаға енгізу үшін залалсыздандыру тәсілдерін анықтау;
2. Микроклонды әдісті оңтайландыру;

  Зерттеу міндеттері:

1. Алма дақылын көбейтуде қолданылатын әдістерді салыстыра сипаттап, талдау.
2. Алма сорттарын микроклонды көбейтудің әдістемесін зерттеу.
3. Баяу өсетін алма сорттарын микроклонды көбейту әдістері арқылы көбейту.

    Зерттеу әдістері:  алманың микроөркендерінің өсуін жеделдететін in-vitro әдісі,  алманың микроөркендерінің өсуін жеделдету үшін топырақ субстратын пайдалану әдісі, алманың баяу өсетін клонды  микрокөбейту әдісі.  

       2.1 Зерттеу нысандары: Алма дақылының Айнұр, Голден Делишес сорттары.

   Голден Делишес – сорт АҚШ-тан шыққан, қысқа мезгілде піседі. Алматы, Жамбыл, Оңтүстік Қазақстан облыстарының қысқы жағдайларына жақсы бейімделген. Бірақта, Голден Делишес сортына Алматы облысының төменгі тау аймағы мен тау етегі жағдайлары қолайлы болып келеді.

    Ағаш биіктігі орташа. Жеміс салатын ағаштардың аумағы дөңгелек немесе кең дөңгелек, бұтақтануы тым тығыз және жапырақтануы жақсы. Жемісі орташа немесе одан жоғары, салмағы 140-170г, жұмыр-конусты, алтындай сары түсті. Ақұнтақ ауруына төзімді, тазқотырға төзімсіз. Жеміс еті жасыл, тығыз, өте шырынды, тәтті, десерттік дәмі хош иіспен ұштасқан. Жемістері қыркуйектің ортасы мен соңында піседі, наурыз-сәуірге дейін сақталады. Тасымалдауға өте қолайлы. Сорт өнімді және тез жеміс береді, баққа отырғызылғаннан кейін 3 жылдан соң жеміс салады.    Сорттың басты жетістіктері: тез жеміс салуы, өнімі мол және жемсінің тауарлық сапасының жоғары болуы.

    Сорттың кемшілігі: өнім көп болған жағдайда, жеміснің ұсақтауы, өнімді әлсін-әлсін беруі, тазқотырға төзімсіз болуы, сақтау кезінде жемісінің солуы. (2сурет)

 

 

                               2 сурет – Голден Делишес сорты

 

  Айнұр – қысқа төзімді, өнімділігі жағынан жоғары, ағашы тез өсетін биік сопақ-пирамидалы. ҚЖЖҒЗИ-ты шығарған. Жеміс салу типі аралас, жемісі тұрақты сақтағанда ғана жақсы. Биологиялық ерекшеліктері: отырғызылғаннан соң 3жылдан кейін жеміс береді. Жемістері орташа, негізгі түсі сары, жұмсақ кремді, тығыз, ұсақдәнді, өте шырынды, қышқыл-тәтті, күшті хош иісті. Тұтыну мерзімі: желтоқсан–сәуір айлары.

 

 

         2.2 Өсімдіктерді асептикалық дақылдарға енгізу тәсілдері

      In vitro дақылдарына енгізу екі кезеңде жүзеге асырылған. Біріншісі – алма шыбықшасының ұйқыдағы бүршігі өскіндерінің өсуін инициациялау(қаңтар және наурыз айларындағы ұйқыдағы кезең өткен соң). Бұған жиналған шыбықшалардан лабораториялық жағдайда өсірілген жасыл өскіндер пайдаланылады. Екіншісі – дақылдың белсенді өсетін мамыр-маусым айлары. Алма сорттарының бүршігіндегі өсуді инициациялау 1мг/л гибберолды қышқыл рН 5,6 қосылған МН расиге мен Скугу бойынша макро және микроэлементтер растворында 50% өсіру жолымен жүзеге асырылады. Меристематикалық аймақтағы белсенді өскіндердің ұзарған және жоғарғы жағын сабынды ерітіндіде жуып, тазартылған сумен шайып, әртүрлі қоспалар мен экспозициялардың стерильдеу агентіне салып қояды. Содан кейін стерильді,демек барлық микробтары өлтірілген сумен үш рет жуады. In vitro дақылына меристематикалық өскіндердің  0,2-0,4см ұшы енгізіледі. Олар жетіліп келе жатқан бүршіктерден оқшауландырылып, жамылғы тканьдардан босатылып, стерильдедің тиімділігін жеткілікті қамтамасыз етеді. Бұл жұмыс барысында өсімдіктерді асептикалық дақылға енгізу үшін стерильдеу агенттер мен тиімді тәсілдер таңдалды.

   In vitro дақылына енгізу барысында өсімдік материалдарын дезинфекциялаудың стандартты процедурасына диацид сияқты сынап құрамдас ерітінділерді пайдалану да жататындықтан залалы мейлінше аз стерильдеу агенттері іріктеліп алынды. Соған байланысты өсімдікті асептикалық мәдениетке ендіру барысында сапрофитті флораның өсуін ингибирлеу үшін әртүрлі стерильдеу заттарын пайдаланудың тиімділігі зерттеледі.

   Стерильдеу агенті ретінде НgCl₂ сынабының (Сулема) экспозициясы 3 және 4 минут 0,2% ерітіндісі, экспозициясы 3 минут арақатынасы 1:2 «Доместос» натриінің 5% гипохлориді, экспозициясы 15минут 1:5 арақатынастағы «Доместос», 1:2  «Белизна» натриінің гипохлорид ерітіндісі, экспозициясы 3минут 1:2 «Белизна», экспозициясы 5минут 1:5 «Белизна» 5минуттік  1% «Дсохлор», ажыратылмаған 15минуттік «Vanish» тазалау құралы, ажыратылмаған «Мистер Мускул» пайдаланылды.

    Бөлініп шыққан апекстер сапрофитті микрофлорадан стерильденгеннен кейін Мурасиге-Скуга қоректі ортасына отырғызылды. Бір мезгілде құрамы: сахарозасы 10г/л; гидролизат казеині 8г/л; ашытқы экстракты 4,0г/л; КН₂РО₄-2,0г/л; MgSO₄*7H₂O-0,15г/л; джелрайт 0,6г/л; рН ерітіндісі 6,9 VISS-ортада латентті инфекцияның бар-жоқтығын экспланттар тексерді. Өскіндердің базальды бөлігі ортасы жасалған Петри шыны аяғына салынып, 1-2 апта бойы 25°С температурада күтіп-бапталды. Экспланттарда эндофитті микрофлора болмаған жағдайда орта мөлдір күйінде қалады. Ал, ортаның лайлануы және оны мекендеушілердің пайда болуы өскіндердің жеткілікті инфекцияланбағанын көрсетеді. Олар, әрине, жарамсыз деп танылды. In vitro мәдениетіне енгізілген өсімдіктер апта сайын бақыланды. Бұл кезде өлген және инфекциясы бар экспланттардың саны анықталды.

 

                     2.3 Алманың микроклонды көбеюінің әдісі

   Стерильді өсімдіктер кварц шамымен стерильденген бокстағы дақылға сәйкес үстемелер мен Мурасиге және Скуга нәрлі ортасына отырғызылады. Микроклонды көбею жарықтытылығы 40 umol m⁻²s⁻¹, 16сағаттық фотокезең бойында +25°С температурада жүзеге асырылады.  Іn vitro енгізілген өсімдіктер апта сайын бақыланып, тірі, өлген және инфекция жұқтырған экспланттар саналып, есепке алынып отырды. Пайда болған өскіндердің жағдайы мен саны есепке алынды. 1қатардағы орташа көбею әрбір генотип үшін Р=a/b*s формуласымен есептелді. Мұндағы:

 a – жаңадан пайда болған өскіндердің саны;

 b – көбеюге отырғызылған өскіндердің саны;

 c – қатарлардың (пассаждардың) саны. Мурасиге мен Скуга құнарлы ортасы сынақтан өткізілді.

    Аталған зерттеу Талғар сұлуы сортына жүргізілді. Клондаудың шарттарын оңтайландыру ортада өскіндердің профилиациясына мүмкіндік туғызатын ауксин, цитокинин сияқты өсудің зерттеуіштерін іріктеу жолымен МС ортасының негізінде атқарылды. Микроөсімдіктер мен манипуляция кварцты немесе бактериялды лампалармен алдын ала стерильденген ламинарлы бокстарда жүргізілді.

    In vitro алманың микроклонды көбеюінің қоректік, нәрлі ортасының құрамын оңтайландыру үшін ортаның минералды құрамының өскіннің пайда болуына және өскіндердің пролиферациясына әсері зерттелді. Эксперименттер минералды тұздардың 5тобы негізінде жүргізіліп, Заря Алатау сынақтан өткізілді.

 1топ — (NH₄NO₃)

 2топ — (KNO₃)

 3топ — (CaCl₂, KH₂PO₄, MgSO₄∙7H₂O );

 4топ — (MnSO₄∙ 5H₂O, ZnSO₄∙ 7H₂O, CuSO₄ 5H₂O, Kl, CoCl₂∙ 6H₂O, H₃BO₃,   Na₂MoO₄∙ 2H₂O)

 5топ — (FeSO₄∙ 7H₂O, Na₂EДТА)

    Әрбір вариантта 5 өсімдік 3рет қайталаныа сыналды. Бағаланған факторлар – көбейген өскіндердің саны, биіктігі, жалпы сапасы, өскіндер мен жапырақтардың көлемі, физиологиялық ауытқуы. Есеп әрбір 3апта сайын жүргізіліп отырды.

    Ортаның барлық түрлерінің құрамында сонымен бірге 30г/л сахароза, 100мг/л мезоинозит, 2мг/л геицин, 0,5мг/л-ден В1,В6 және РР витаминдері, 0,1мг/л ИМК, 0,5мг/л БАП, 3,5г/л игар, 1,5г/л джелрайт, 5,7-5,8-рН болды.

    МС қоректік ортасының негізінде БАП,ИМК және ГК өсу реттеуіштерін оңтайландыру бойынша эксперименттер жүргізілді. Төмендегідей варианттар сыналды:

  БАП 0,5+ИМК 0,1; БАП1,0+ИМК 0,1+ГК 0,1; БАП2,0+ИМК 0,01+ГК 0,1; БАП 0,5+ИМК 0,5+ ГК 0,1.

   Нәрлі орта арнайы ыдысқа құйылып, автоклавта (ТЮМЕНЬ ВК-75-01) 0,8-1,0 атмосфералық қысымда 25минут бойы стерильденді. Пайда болған микроөскіндер пролифирация және көбею үшін тың қоректік ортада ай сайын тізілді. Сөйтіп инфекцияланған және дамыған өсімдіктердің есебі алынды. Одан арғы эксперименттер арнайы ортада тексерілген асептикалық өсімдіктермен жүргізілді. Эксперименттер мәліметтері статикалық өңдеуден стандартты әдістердің көмегімен өтті.

 

 

 

1.9 Жасанды ортада өскен өсімдіктерін залалсыздандырылмаған топыраққа   бейімдеу әдісі

 

           In vitro жағдайында өсімдікті көбейтудің үлкен проблемасы —  зарарсыздандырылмаған топыраққа көшіру. Осы кезеңде өсіру материалдарының біразы өліп қалады. Бұл ретте көшеттелген өсімдіктің даму күшін,  субстрат құрамын, ауаның ылғалдылығын және көшіру мерзімін ескерген дұрыс. Пробирка өсімдіктерін бейімдеу әдістері туралы біраз еңбектерде  сипатталған.

         Ашық танап жағдайына бейімдеу кезеңі in vitro жағдайында өсімдіктерді өсіру барысында алынған регенеранттар үшін ең қауіпті кезеңдердің бірі болып табылады, себебі осы кезеңде өсімдіктер күйзеліске түсіп, өлу қаупі жоғары болады. Мұны физиологиялық, биохимиялық, анатомиялық себептермен түсіндіруге болады. Осындай көшеттеп отырғызу кезінде өсімдіктер ашық грунт жағдайына бейімделу барысында маңызды рөл атқаратын белгілі бір эндогендік заттектерді жоғалтады.

         Пробирка өсімдіктері зарарсыздандырылмаған жерге көшеттегеннен кейін көптеген өзгерістерге тап болып, бірінші кезекте ауаның ылғалдылығы секілді өзгеріс, транспираторный шокқа (көшу күйзелісіне) ұшырайды. Егу топырағындағы ауаның ылғалдылығы 100% жуық болады, мұртша саңылаулары ашылады да жабылу қабілетінен айрылады. Осыған байланысты зарарсыздандырылмаған ортаға өсімдікті біртіндеп бейімдеуге бағытталған әр түрлі шаралар ұйымдастырылады. Осы мақсатта зарарсыздандырылмаған ортаға өсімдікті отырғызудан 1,5-2 апта бұрын пробиркалардын қалпағын алып тастайды . Сондай-ақ эмистим және экост секілді индуктор-препараттарды тамырдан тыс байыту  ретінде пайдаланады .

         Бейімделу кезеңінде өсімдікті миксотрофты қоректенуден автотрофтыға көшіру ең маңызды болып табылады. Осыған орай топырақ субстратын дұрыс таңдай білу маңызды. Біраз ғалымдар тамырланған in vitro өсімдігін  торф пен құмның 3:1  қатынастағы қоспасы салынған жәшіктерге отырғызуды ұсынады Е.Н.Джигадло басқа авторлармен бірге субстраттың шірінді мен торфтың 1:2  қатынастағы беті зарарсыздандырылған перлитпен жабылғанжәне макротұз сіңірілген қоспасын қолданады. Н.В.Кухарчик және басқалар субстраттың дәстүрлі түрлерін пайдаланады: перлит, жоғарғы жағы бір қабат құмнан тұратын торф, 3:1 қатынастағы құнарлы топырақпен қосылған торф, ірі түйірлі құм, торф пен құмның 1:1 қатынастағы қоспасы, сондай-ақ торф пен қоңыр көмірдің 1:1 қатынастағы қоспасы.

         Бейімделуді жақсартудың бір тәсілі  ионоайырбас субстраттары секілді жаңа  бейімдеу субстраттарын пайдалану болып табылады.  Олардың жеміс-жидек және сәндік өсімдіктерді өсірудегі басымдықтары туралы көп айтылған.

         Өсімдіктер жақсы бейімделу үшін  ИМК  әр түрлі концентрациялармен, әр түрлі уақыт аралығында, нақты генотипіне  байланысты су ерітіндісімен өңдеу жүргізеді.

         In vitro        жағдайында өсірілген тамырларды  өскен ортасымен бірге топырақ субстраттарына отырғызады.  Сондай-ақ өсімдікті зарарсыздандырылған субстратта  бейімдемей-ақ бірден жылыжайға отырғызу экономикалық тұрғыдан тиімді болып табылады. Осындай тәсіл қолданғанда қаңтардан наурызға дейін өсімдік белсенді түрде көбееді, содан кейін оларды тамырлану үшін көшеттейді, ал мамыр-маусымда танапқа.

         Өсімдікті зарарсыздандырылмаған жағдайға көшірудегі ең қолайлы кезең тыныштықтан кейінгі белсенді өсу кезеңі, сондықтан бейімделуі  баяу жүретін  формалар үшін тыныштық кезеңін жасанды түрде туғызатын техниканы пайдаланады. Өсімдіктерге мұндай жағдайды туғызу үшін оларды  тоңазытқыш камерасында  40-60 күн аралығнда +5…+6  ұстау керек. Осыдан  кейін топыраққа көшірілген өсімдіктер белсенді түрде өсе бастайды, транспирация жүйесін жылдам түзе бастайды, патогенді микрофлораға тәуелсіз болады. Топыраққа өсімдікті мамырдың екінші жартысы мен маусымның басында отырғызады. Осы кезеңде өсімдіктің жер бетіндегі бөлігі жақсы өседі,   қыста ашық танапта өсе алатындай деңгейге жетіп,  жазға қарай өркендері жақсы жетіледі.

 

        2.4 Зерттеу нәтижелері

        2.4.1 In vitro асептикалық дақылына енгізу

   In vitro дақылдарына байланысты биотехнологиялық зерттеулер жүргізгенде табиғи жағдайдан алынған стерильдеу маңызды кезең болып табылады. Өйткені, әдетте оның сырт қабаттағы тканьдары түрлі бактериялар жұқтырған болып шығады. In vitro дақылы бойынша жеміс және жидек ағаш-бұталары жапырақ экспланттарының зерттеулерінен соны көреміз.

   Бұл зерттеулер үшін алманың Заря Алатау, Голден делишес, Салтанат сорттарының ұйқыдағы бүршіктері мен белсенді өсіп келе жатқандарының жоғарғы өскіндері пайдаланылды.

    Біздің зерттеулерімізде In vitro дақылына ену екі кезең бойынша жүргізілді. Біріншісі – алманың бұтағындағы ұйықтап жатқан бүршіктерден өскіндердің өсуі бейнеленді. Мұнда жинаған шыбықтардан лабораториялық жағдайда өсірілген жасыл өскіндер пайдаланылды. (2 сурет)

            Екінші кезең – дақыл белсенді өсетін мамыр-маусым айлары. Бұған жоғарғы өскіндер пайдаланылды. Экспозициясы 3-4 минут HgCl₂ сынабының (Сулема) 0,2% ерітіндісі, құрамында 5% натрий гипохлориді бар «Доместос» кір кетіретін құралы (1:2 экспозициясы 3минут және 1:5 экспозициясы 5минут) құрамында белсенді хлоры бар «Белизна» ағартқышының ерітіндісі, экспозициясы 5 минут 1% «Деохлор» (хлорлы препарат), 15 минуттік аралыстырылмаған «Vanish» кір кетіретін құралы, араластырылмаған «Мистер Мускул» сияқты стерильдейтін ерітінділері  сынақтан өтіп, одан кейін стерильді сумен 3 рет жуылып, МС қоректік ортада күтіп-бапталды.

 

                              4 сурет — Залалсыздандырғыш ерітінділер

 

   Өсімдік материалдарын саңырауқұлақтан, бактериялардан стерильдеудің маңызы зор. Ол үшін сулему, диацид, сондай-ақ кальцийдің, калийдің, натрийдің гипохлориті секілді хлор және сынап құрамды препараттардың ерітінділерін пайдаланады. Жұмыс барысында өсімдікті асептикалық дақылға енгізу үшін өңдеудің тиімді тәсілдері таңдалады.

   Өсімдік материалын іn vitro дақылына енгізудің стандартты дезинфекциясында сынап құрамды HgCl₂ пайдаланатындықтан қауіптілігі төмен стерильдеу ерітінділерін таңдаған жөн. Соған байланысты, бақылау варианты ретінде HgCl₂ -нің 0,2%-ы 3және 4минут экспозицияда пайдаланылды.

    Іn vitro дақылына енгізген соң, 3аптадан кейін экспланттардың регенерациялық қабілетіне жасалған анализ ең жақсы регенрация бақылау вариантын (HgCl₂ -нің 0,2%) 5минуттық экспозицияда пайдаланғанда болатынын көрсетті. Бұл жағдайда экспланттардың 73%-ына дейін регенерацияланды. Ал, 4минут экспозицияда бүршіктердің регенерациясы 53% болды.(2 кесте)

 

2 кесте — Алманың қысқы бүршіктерін сапрофитті микрофлорадан          залалсыздандыру нәтижелері. (Айнұр сорты)

 

Залалсыздандыратын ерітінділер	Экспоз мин.	Отырғызылған өсімдіктер саны, дана	Тірілері, дана	Некроз, дана	Регенерацияланған, %
Бақылау HgCl2    ( 0,2%)	5	15	11	4	73%
HgCl2   (0,2%)	4	15	8	7	53%
Доместос 1:2	4	15	2	13	13%
Доместос 1:5	15	15	4	11	26%
Белизна 1:2	3	15	0	15	0%
Белизна 1:5	5	15	1	14	6%
Деохлор 1%	15	15	0	15	0%
Vanish араластырылмаған	15	15	0	15	0%
Мистер Мускул араластырылмаған	15	15	0	15	0%

 

  1:5 арақатынастағы Доместосты 15минут экспозицияда пайдаланғанда экспланттардың 26% инфекциядан  болды. Ал, 1:5 арақатынастағы Белизнаның ерітіндісін пайдаланғанда бүршіктің регенерациясы 6%-ды құрады. Өлген экспланттардың көрсеткіші де бұл жерде маңызды рөл атқарады. Бұл көрсеткіш эксперимент жасаушының техникалық мүмкіндігіне және стерильдейтін реагентке байланысты. Мәселен, 1:5 Белизнаның, 1%-ды Деохлордың, араластырылмаған Мистер Мускулдың, араластырылмаған Vanishтің стерильді ерітінділерінің тиімділігі аз болып шықты. Оларды пайдаланғандағы регенрация көрсеткіші 0% болды.

    Тіпті кейбір экспланттарда қоректік ортаның лайлануы сияқты саңырауқұлақ (таз ауруы) инфекциясының белгілері пайда болып, олардың өліп қалуына әкеліп соқты. Бәлкім, бастапқы экспланттарды стерильдеу оларды саңырауқұлақ ифекциясынан арылтқан болуы да мүмкін. Бірақ, оның бактериалды инфекцияға қарсы тиімділігі төмен болып шықты. Ал, көптеген ағаш өсімдіктеріндегі ішкі, әсіресе, бактериалды инфекциялар 3 ай күтіп-баптағаннан кейін де көрінетіндіктен оларға антибиотиктерді және системалық фунгицидтерді пайдалануға кеңес беріледі.

    Ұйқыдағы бүршіктерді залалсыздандыру нәтижесі 5минут экспозициядағы 0,2% сулема бақылау варианты қуатты стерильдеу ерітіндісі екенін көрсетті. Алманың асептикалық экспланты соны пайдаланғаннан кейін алынды.

    Өскіндердің ұшы белсенді өсетін екінші кезеңде оны жоғарыда аталған ерітіндімен стерильдеп, содан кейін 3рет стерильді сумен жуып, МС қоректік ортасына ауыстырылды.

    Стерильдейтін ерітінділерді сынақ барысы ең тиімдісі 1:5 қатыстағы «Белизнаның» 5минут экспозициясы екенін көрсетті. Онымен стерильденген экспланттардың 93%-ы өмірге қабілеттілігін танытты. (3 кесте)

 

3 кесте — Айнұр сорты өскіндерінің ұшын сапрофитті микрофлорадан залалсыздандыру

 

Залалсыздандыратын ерітінділер	Экспозиц.мин.	Отырғызылған өскіндер саны, дана	Тірісі, дана	Некроз, дана	Регенерация-ланғаны %
Бақылау HgCl2    ( 0,2%)	3	15	8	7	53%
HgCl2   (0,2%)	4	15	9	6	60%
Доместос 1:2	4	15	12	3	80%
Доместос 1:5	15	15	9	6	60%
Белизна 1:2	3	15	10	5	66%
Белизна 1:5	5	15	14	1	93%
Деохлор 1%	5	15	6	9	40%
Vanish араластырылмаған	15	15	0	0	0%
Мистер Мускул араластырылмаған	15	15	0	0	0%

 

   4 минут экспозицияда арақатысы 1:2 Доместоспен стерильденген экспланттар өскіннің өмірге бейімділігі 80% болды. 3 және 4минут экспозицияда сулеманың 0,2% ертіндісін өскіндердің ұшына ұйқыдағы бүршіктегідей тиімділік берген жоқ. Стерильді өскіндердің өнуі 3минут экспозицияда 53%, ал 4 минут экспозицияда өмірге дейін өскіндер 60%-ды құрады.

   Алма мен алмұрттың өсетін тканьдарына екі баспалдақты стерильдеуді жиі қолданады. Өсіп келе жатқан ұшының ұзындығы 2-3см болғанда алдымен 70%-дық этил спирімен 2секунд, содан соң 15минут бойы 0,2%-дық сулемамен стерильдейді.  3%-дық сутегі тотығын 96%-дық эталонмен қосып қолданып, артынан 0,01%сулема ерітіндісімен өңдеген жағдайда алманың экспланттары іс жүзінде инфекциядан толық тазарады. Әдебиет деректерінде 5,25% натрий гипохлоритін және 3% сутегі тотығын қолданып, бір жылдық сабақтың ұшын стерильдеу тиімді екенін көрсетіледі.  Ал, бұл зерттеуде алма өскінінің ұшын стерильдеу үшін экпозициясы 1:5 «Белизна» (5 сурет) және экспозициясы 4минут 1:2 арақатысты «Доместос» тиімді екені келтіріледі.

   Қалған 1%-дық Деохлор,  араластырылмаған Мистер Мускул мен Vanish сияқты стерильдейтін агенттерді пайдалану өскіндердің жансызданып, бактериалдың және саңырауқұлақтың инфекциясынан өлуіне әкеліп соқты.

    Сөйтіп, барлық сынақтан өткен агенттердің ішінде ең сапалы стерильдейтіні және қауіпсізі экспозициясы 5минут 1:5 арақатысты «Белизнаның» құрамындағы натрий гипохлориді болып шықты.

    Қазіргі таңда кллусты дақылдарды алу көптеген зерттеулердің маңызды кезеңі болып табылады. Өскінді дақылдарға қарағанда оның өсімдіктерді жеделдетіп көбейту мүмкіндігі жоғары. Өсімдіктің кез келген бөлігіндегі экспланттардан өсетін клеткалардан тез көбейетін массасын алуға болады. Ол үшін экспланттарды, әдетте құрамында өсу реттегіші бар жасанды қоректік ортаға орналастырады. Онда эксплант клеткалары дедиференцияланады және пролифериялана бастап, бұл каллустың пайда болуына әкеліп соғады.

   Каллус дақылдары арқылы көбейту тәсілін өскіндердің регенерациясын немесе олардағы соматикалық эмбриоидтарды жүзеге асырған жағдайда ғана қолдануға болады. Ал, каллус дақылдарының қабілетті, қабілетсіз екенін консистенция және түр-түс сияқты морфологиялық көрсеткіштерден ажыратуға болады. Мәселен, жасыл учаскелі өсімдіктердің барлық түрлерінің каллустері регенерацияға қабілетті. Ал, босаң, крем түсті каллустердің қабілеті аз немесе мүлдем жоқ.

   In vitro дақылындағы тканьдердің әртүрлі өсімдіктерге тән морфогенез блогының генетикалық және эпигенетикалық мінезін көрсетеді. Тканьдердің морфогенетикалық потенциясының детерминациясы бұл кезде оқшауландырылған дақылдардың қалыптасу кеңінде жүреді. Бұл турасында айтылған гипотеза бойынша эмбриогендік дақыл дамуының негізгі күйі деп аталатын айрықша дамуы пайда болады. Клеткалы дақылдар бұл жағдайға күтіп-баптаудың ең басында, тканьді дақылға кезінде ие болады. Олардың бұл күйі эмбриогенді потенциалдық индукциясымен сәйкес келеді. Эмриогендік дақылдарға негізінен тұрақтылық тән. Бірақ, ол тұрақтылықты регенерация процесін инициациялау кезіндегі сияқты түрлері сыртқы әрекеттер бұзуы мүмкін. Соның ішінде өсудің экзогенді реттегіші де жиі бұзуы ықтимал.

   Каллусогенездің индукциясы үшін пайдаланылатын өсу реттегіші регенерацияның жанама индукторы болып табылады. Әдетте жалпы қабылданған әдістеме бойынша дақыл клеткаларының өсуіне қажетті қосымша күтіп-баптау өз ортасында жүргізіледі. Тек регенерациялық процестердің индукциялағанда ғана ортаның гормондық құрамын күрт өзгертеді. Әсіресе цитокинин мен ауксиннің арақатысы өзгертілген ортаға каллусты қайта отырғызу арқылы жиі регенерацияланады. Органогенез  типіндегі регенерация негізіне цитокининдер арқылы бақыланады. Сондықтан ауксиннің құрамын азайта отырып, цитокининнің деңгейін көтеру каллус сабағындағы бүршіктерді жиі ыналандырады. Мәселен, Eucalyptus каллусіндегі өскіннің регенерациясы НУК қоспасы 1-ден 0,5м/л-ге дейін азайтып, БАП қоспасын 0,5-тен 1мг/л-ге дейін; көбейту арқылы өтті. Белсенділігі аз КН-ді  БАП –пен ауыстыру және цитокинин қоспасын 10есе (0,1-ден 1мг/л-ға ) көтере отырып, бір мезгілде 2,4 Д-ны НУК-қа ауыстыру және ауксиннің қоспасын 10есе азайту (1-ден 0,1мг/л-ға) ортасында Armeniaca vulgaris гибридтерінің каллусты дақылдарындағы өскіндердің регенерациясын индукцияланды. Каллусты дақылдағы морфогенез барысы қоспаның ғана емес пайдаланылған өсу реттегіші табиғатының да ықпалында болады. Бұл ауксинге де, цитокининге де қатысты. Galbergia sissoo ағаш өсімдігінің органогенезі каллустың тканьдарының өсуіне әртүрлі ауксиндерінің ықпалын зерттеу органогенездің ең дұрысы НУК және ИУК екендігін көрсетті. Ал, 2,4-Д мен ИПК-ның әртүрлі құрамдарын пайдалану тиімді болмады.

   Алайда соматикалық эмбриодогенезді табысты индукциялау үшін көп жағдайда күтіп-баптау жағдайын өзгерту қажет болады. Бұл ең алдымен қоректік ортаның құрамына қатысты кейбір өсімдіктер эмбриоидтар каллусогенездің бір ортада пайда болады. Бірақ одан дедифференциялық соацидтер аукционның қоспасын азайтқан немесе мүлдем алып тастаған жағдайда. Мәселен, Ranunculus serbicus  және Brassica campestris каллусты дақылдарындағы соматикалық эмбриоидогенезді индукциялау үшін каллусты гормонсыз ортағы түзу жеткілікті болды. Ал, Pйrsica vulgare каллусты дақылындағы соматикалық эмбриоидогенезді индукциялаудың негізгі факторы 2,4-Д қоспасын 1ден 0,1 мг/л-ге дейін азайту болып табылады. Oryza sativa сынды кейбір өсімдіктерде ауксин болмаса, эмбриоидогенез де болмайды. Басқа өсімдіктер үшін, мәселен Dioscorea екі түріне қоректік ортада цитокининнің 0,1-ден 2мг/л-ге дейінгі мөлшердегі азғантай құрамы болуы қажетті шарт. Кез келген бастапқы тканьдардан пайда болатын каллусты клеткаларды организмнен тыс қоректік ортада ұзақ өсіруге болады. Ол үшін пайда болған клеткалардың аз бөлігін әрбір 3-4 апта сайын тың қоректік ортаға қайта отырғызу қажет. Бірақ каллус тканьдары түзілу процесі барысында морфогенетикалық потенциясын жоғалтатындықтан ұзақ күтіп-бапталған регенеранттар алу қиын болады. мәселен Medicago sativa каллусты тканы 12-14 рет түзілгеннен кейін өзінің морфогенетикалық потенциясын толық жоғалтты. Бір типтегі тканьнің екіншісіне айналуы бір бағытта: морфогенетикалық компотенттіктен, компотенттік емеске қарай ғана мүмкін болатындығы каллус дақылдарын құрайтын клеткалардың жалпы заңдылығы болып табылады.

 

                         2.4.2 Алманың микроөскіндерін тестілеу

     Іn vitro дақылынан асептикалық материал алудың келесі қажетті кезеңі эндофитті микрофлораны анықтау. Іn vitro өсімдіктері тканьдерін микробтық контаминациядан қорғау, сондай-ақ инфекцияның алдын алу микроклонды көбеюді табысты жүргізудің сапрофитті микрофлорадан стерильдеген алманың өскіндерінің базалды бөлігі VISS ортасына отырғызылды.

    Өсімдіктердің клонды микрокөбеюі кезінде оларда ішкі бактериялық инфекция пайда болу қаупі туады. Мұндай жағдайда антибиотиктерді қолдану арқылы антибактериялық хемотерапия жасалады. Өкінішке орай өсімдік тканьдары әртүрлі антибиотиктерге сезімтал келетіндіктен бұл реакция өсімдіктің генотипіне байланысты. Негізінен хлоропластар мен митохондрияларзақымданады. Клеткалар мен тканьдардың антибиотикті қоректік ортада ұзақ болуы олардың бұл ортаға деген цитоплазматикалық мутациядан пайда болатын төзімділігін арттыруы мүмкін. Ортаның күтіп-баптау құрамы антибиотикте белсенділігі төмендеуіне әсер етеді. Сондықтан бактериялық инфекцияларда иденфикациялау қажет. Сонда кең әсер ететін немесе спецификалық тиімді антибиотиктерді іріктеуге мүмкіндік болады. Соңғы жағдайда, әсіресе,  синергиялық әсер жағдайында антибиотиктерге төзімділік қалыптасу мүмкіндігі төмендейді. Бірақ бұндай кезде кейбір антибиотиктердің химиялық тұрғыда үйлесе алмай, бір-бірінің әрекетін жойып жіберуі мүмкін екендігі ескерілуі керек.

   Жүргізілген эксперимент анализдерінің нәтижесі эндофитті микрофлорадан таза өсімдіктердің проценттік көрсеткіші олардың нақты сорттарына байланысты екенін көрсетті. Мәселен, алманың кейбір сорттарында эндофитті микрофлора тканьдарының контаминациясы төмен екені анықталды. Соған сәйкес асептикалық өсімдіктің өсуі жоғары – 80-100%. (6 сурет)

 

  Заря Алатау сорты тканьдарының эндофитті жұқтырмаған бөлігі 55%-дан асқан  жоқ. Өсімдік тканьдарының ішінде оқшауланып қалған бактериялық инфекцияны анықтау көп жағдайда қиын болып жатады. Мұндайда, контаминирленген өсімдіктердің ауырған симптомы көзге көріне қоймайды. Тек олардың көбею жылдамдығы бәсеңдейді. Бірақ, одан ары инфекция жұқтырған өсімдік материалы криоконсервация үшін және гермоплазманың криобанкін жасауға жарамсыз болып қалады.

    Эндофитті бактериялық инфекцияны Петри шыны аяғындағы арнайы қоректік ортаға экспланттың түйірлерін орналастыру арқылы анықтайды. Әңгіме етіліп отырған экспериментте бұл мақсат үшін VISS ортасы пайдаланылған.

    Эндофитті контаминациясының жоғарылығынан in vitro дақылындағы бұл сорттан асептикалық өсімдіктер алынбай, мүлдем жоғалды.

    Сөйтіп, жасырын бактериялық инфекцияға тестіленіп, асептикалық өсімдіктерге іріктелген алмалар бұдан әрі микроклонды көбейту үшін пайдаланылды.

 

2.4.3. Алманың  in vitro өскіндерін клондауға қоректік ортаның минералдық құрамының әсері

  Клонды микрокөбеюді табысты жүргізу үшін қоректік ортаны таңдаудың маңызы зор. Көптеген өсімдік түрлерінде микрокөбею кең қолданылатынына қарамастан, олардың тиімділігін төмендететін проблемелар бар. Ол проблемалар: in vitro морфогенезі процестерінің генотиптік мүдделілігі, өскіндердің күтіп-баптау кезіндегі каллустердің пайда болуы, өскіндердің витрификациясы, өскін ұштарының жансыздануы, жапырақтарға дақ түсуі және басқалар. [25,26]

   Сондықтан өсімдікті күтіп-баптау кезінде пайда болатын бірсыныра проблемаларды алдын алу үшін МС ортасында әзірленген минералды тұздардың 5 түрлі ерітіндісі зерттелді. Алманың өскіндері қоректік ортаға өткізілгеннен кейін 20 күннен кейін өз нышандарын белсенді көрсете бастайды. Бұл жерде негізінен өсімдіктердің фенологиялық нышандары бағаланды.

    Эксперименттер минералды тұздардың 5 тобы негізінде жүргізілді.

 1 топ – (NH₄NO₃),

 2 топ – (KNO₃);

 3 топ – (CaCl_2, KH₂PO_4,  MgSO₄ * 7H₂O);

 4 топ – (MnSO₄.5H₂O,  ZnSO₄.7H₂O, CuSO₄.5H₂O, KI, CoCl₂.6H₂O, H₃BO_3,  Na₂MoO₄.2H₂O);

 5 топ– (FeSO₄.7H₂O,  Na₂EDTA)

  Эксперимент нәтижелері  RI 25 мл NH4NO3, RI 50мл NH4NO3 2 нұсқасының зерттелген 5 тобы  ең дұрысы  25%, 50% азоты бар орта екенін көрсетті. (6 сурет). Бұл варианттарға қарағанда NH4NO3 75% вариантта өскіннің ұзындығы, тораптардың саны, сондай-ақ тұтастай алғанда өсімдіктің жансыздануының көрсеткіштері төмен болды.

     Азот – кең пайдаланылатын макроэлемент, өсімдіктің маңызды құрылыс материалы болып табылады. Ол өсімдіктің вегетативті көлемін және сол арқылы өнімділігін арттырады. Белоктың пайда болуына да қатысады. Маңызды құрам ретінде нуклеопротеидтерде және нуклеинді қышқылдарда болады, хлорофиллдер, дәрумендер, алколоидтер молекулаларының құрамында кездеседі. Жүргізілген зерттеулер өскіндердің ұзындығы, саны, тораптардың саны, жапырақтардың бояуы,дағы, жансыздануы сынды ортаны модификациялау бойынша оң нәтижелер көрсетті.

   Тәжірибенің үш вариантында (CaCl_2, KH₂PO_4,  MgSO₄ * 7H₂O) 25% және  50% мл  және 75 % мл кезінде жапырақтың дағы, өскін ұштарының жансыздануы байқалды, сонымен қатар өскіндер торабының саны және өскіндердің ұзындығы бойынша көрсеткіш төмен болды. Сөйтіп, бұл зерттеулер нәтижесінде қоректік орта минералдық тұздарының алма өскіндігінің дамуына және клонды микрокөбеюіне әсерлерінің ерекшеліктері анықталды. Ең дұрысы МС ортасындағы NH4NO3  азот құрамдас тұзының төмен мөлшерде (25%, 50%)  болғандығы екен. [27,28,29]

   Жүргізілген эксперименттер негізінде алманың клонды микрокөбеюі үшін ең қолайлы орта болғандығы белгілі болды. 

 

2.4.4 Алманың баяу өсетін бағана  формалы  генотипін  микроклонды  көбейту

 

         Микроклонды көбею – дәстүрлі әдістермен көбейтілуі  қиын өсімдіктерден  вируссыз отырғызу материалын алу барысында қолданылатын биотехнологиядағы басты бағыттардың бірі.  Осы әдіс  өсімдіктің көбею коэфицентінің ең жоғарғы көрсеткішін алуға, жыл бойы жұмыс жасауға, отырғызу материалына кететін  жер көлемін үнемдеуге мүмкіндік береді.

          Микроклонды көбейтуді жеделдету технологиясы  көптеген ауылшаруашылық, жеміс-жидек дақылдарына арналып  жақсы жасалған Алайда,   алмаға  байланысты клональды микрокөбею туралы   зерттеулер онша көп емес. Жасалған зерттеулер нақты бір генотипке қатысты, сондықтан оларды басқа формаларда қолданғанда нәтижесіз болып шығады.

          Алманың бағана формалы  түрлері алманың жалпы генофондында ерекше орын алады, себебі олардың өздеріне ғана тән биологиялық ерекшеліктері бар. Осындай ерекшеліктерінің бірі —  олардың  қаптал (бүйір) өркендерінің әлсіз болуы, кейбір жағдайларда олардың мүлдем болмауы. Мұндай ерекшелік олардың  екпе және көзсабақтау секілді дәстүрлі көбейту әдістерін пайдалану арқылы отырғызу материалдарын барынша көп алуға   қиындық туғызады.  Осыған байланысты осы топтағы өсімдіктер үшін клональды микрокөбею әдісін жасау  өзекті болып табылады.

2.4.5  Аналық өсімдіктердің жасы мен жағдайы, апикальды бүршіктерді оқшаулау мерзімі және оларды залалсыздандыру

Микроклональды көбейтуді сәтті жүргізу үшін бастапқы аналық материалдардың  жас  мөлшері маңызды рөл атқарады. Бағана формалы алманың даму ерекшелігіне байланысты (оларда қапталдық немесе бүйір  өркендер мен бүршіктер аз  қалыптасады) клональды көбейтуге арналған бүршіктерді олардың жалпы  жағдайына кері әсер етпеу үшін өсімдіктердің оңтайлы өлшемділерін таңдап алады. Бұл өлшем 4-5 жас мөлшері болып табылады. Өсімдік-донорлар саңырауқұлақ және вирустық аурулармен  ауырмаған болуы тиіс. Сондай-ақ бүршіктерді жинау мерзімі де маңызды болады. Біраз зерттеушілердің ойынша,  дақылға in vitro енгізетін ең қолайлы кезең — өсімдіктің тыныштықтан шығу кезеңі, яғни ақпан — наурыз айлары. Өткізілген тәжірибелердің нәтижесі бойынша бағана формалы алма үшін ең нәтижелі тәсіл — дақылға in vitro енгізуді өсімдіктің вегетациялық көбеюінің алғашқы кезеңіндегі  апикальды бүршіктер арқылы  жүзеге асыру. Ауа райының  жағдайына байланысты бұл кезең бүршіктердің табиғи түрде ісініп, бүршік жаратын кезеңі, яғни сәуірдің  ортасына немесе аяғына сәйкес келеді.  Наурыз айында теріліп алынған бүршіктердің меристемалары зарарсыздандырылған материалдың шығуы мен  олардың ары қарай дамуы тұрғысынан оң нәтиже бермеді.

In vitro   өсіруге  дамып келе жатқан бүршіктерден оңашаланған, сыртқы ұлпаларынан босатылған, зарарсыздандыруға оңтайлы 0,2-0,4 см. меристематикалық ұштар енгізілді    . Зарарсыздандырғыш ретінде 0,1% сынап (сулема) ерітіндісі қолданылды. Тәжірибеде 40 секунд пен 1 минутқа созылған екі  түрлі экспозиция сыналды (Кесте 1).

Зарарсыздандырылған экспланттардың жақсы нәтижелері барлық генотиптерде 1 минуттық экспозиция кезінде алынды. Нақты генотипке байланысты індеттену деңгейі (инфицированность) әр түрлі болды.

Зарарсыздандырылған экспланттардың ең көп мөлшері мына формаларда VII (75,0%), VI  (65,0%),  V (69,6%),  ал ең аз мөлшері мына формаларда  IV (46,4%) және  I (39,1%) анықталды.

40 секундтық экспозиция барлық генотипте зарарсыздандыратын материал алуға   жеткіліксіз болды, оның шығымы 0-ден 13,3% дейін болды. [30,31]

 

Кесте 2 — Бастапқы материалды 0,1% (сынап)  сулема ерітіндісінде залалсыздандыру үшін уақыттың әсері.

 

Форма	Экспозиция, минут	Залалсыздандырылған экспланттың шығуы %	Бүршіктердің өміршеңдігі %, (экспланттың бастапқы санынан есепт.)
VII	40 секунд	13,3	13,3
	1 минут	75,0	60,0
VIII	40 секунд	0	0
	1 минут	59,1	36,4
IV	40 секунд	0	0
	1 минут	46,4	28,6
VI	40 секунд	11,8	11,8
	1 минут	65,0	37,0
I	40 секунд	0	0
	1 минут	39,1	39,1
V	40 секунд	0	0
	1 минут	69,6	69,6

 

 Сонымен қатар  зарарсыздандырушы агент ретінде 1:1,5 қатынаста «Белизна» ерітіндісі  5 минуттық экспозицияда сыналды. Өңдеудің бұл түрі  жапырақты экспланттарға қолданылып, жақсы нәтиже берді. Алайда,  меристемаларды өңдегеннен кейін бүршіктердің өміршеңдігі мен залалсыздандырудан кейінгі шығымы  барлық генотиптерде сулемамен өңдегендегі көрсеткіштен әлдеқайда төмен болды (Кесте 2). I,V,VI формаларында залалсыздандырғаннан кейін барлық бүршіктердің өміршеңдігі  тоқтады (Сурет 7).

Кесте 3 — «Белизна» ерітіндісімен (1:1,5)   қатынаста 5 мин. экспозицияда   залалсыздандырудың   әсері.  

 

Форма	Залалсыздандырылған экспланттың шығуы %	Бүршіктердің өміршеңдігі %
VII	57,1	21,4
VIII	28,6	14,3
IV	42,8	7,1
VI	35,7	0
I	7,1	0
V	42,8	0

 

 

          7 сурет — Бүршіктердің өміршеңдігі  тоқтауы

 

Сонымен, микроклонады көбею кезінде бағаналы формалы баяу өсетін алмалардың  генотипінің апикальды бүршіктерін зарарсыздандыру үшін 0,1 % сулема ерітіндісін 1 минут экспозициямен пайдалану керек. Зарарсыздандырылған экспланттардың шығуы  генотипіне байланысты 39-75% аралығында, ал өміршеңдігі 28,6-69,6 % аралығында болды.[32,33]

 

 

 2.4.6  In vitro   өсіруге төбебүршік меристемаларды енгізу 

 

Оқшаулатылған төбебүршік меристималар  0,5 мг/л. 6-БАП (нөлдік пассаж) МС қоректік ортасына орналастырылды. Қоректік ортаға цитокининді енгізгенде бүршіктің  басымдылығын   бәсеңдетіп, қолтық бүршіктердің шығуын үдетті. Өсуді реттеуіш ауксиндер қосылған жоқ, себебі осы кезеңде олар морфогенез процесіне кері әсер етіп,  қажетсіз каллусогенездің қалыптасуына  жол береді. [34,35]

Апекстерді енгізу кезеңіндегі  өсіру шарттары  мынадай: t , 16 сағаттық фотокезең, жарықтандыру жеделдігі 2000-3000 люкс.

Алынған нәтижелерді талдау мынаны көрсетті: нөлдік пассаж кезінде апекстердің  дамуының ең жоғарғы көрсеткіші  бүршіктерден жапырақтар розеткасының пайда болуы (30%) МС қоректік ортасындағы VII  және  VIII формаларында байқалған (Сурет 8-9). Атаулы ортада VII формада қосымша өркен-регенеранттар пайда болды,  мұның өзі көбею коэфицентінің жақсы екендігін және  ары қарай осы формамен жұмыс селекциялық практикада  жалғасын табатынын білдіреді.

 

 

             8 сурет — Алма жапырақ эксплантынан бүршіктің пайда болуы

 

Сынаққа алынған басқа сорттарда экспланттың көлемінің  және 1-2 беттерінің даму әлсіздігі байқалды. Сыналған формалардың ішінде IV формасының морфогенетикалық қабілеттілігі  төмен екендігі сипатталды. I, II, III, V формалар үшін қоректік ортаның құрамын  экзогенді цитокинин концентрациясы немесе  ауксиннің синтетикалық ұқсас  басқа түрінің қосылысымен алмастыру есебінен біршама оңтайландыру керек.

 

 

           9 сурет — Бүршіктердің әлсіз түрде ашылуы

 

Сонымен,  морфогендік құрылымды дамыту ерекшеліктеріне қатысты  апекстердің нөлдік пассаждағы генотипті ерекшеліктері анықталды. [36]

 

 Алма дақылын микроклондық көбейту әдісі арқылы өсіру кезіндегі экономикалық тиімділік

 

Көрсеткіштер	Алма экспланттарын өсіру тәсілдері     In vitro жағдайында                    Дәстүрлі әдіс
Алынған материал саны 1м , дана	400	50
1м  көлемнен өсіп шыққан өсімдік саны, 1пассаж , дана	1400	35
Шығын, мың.теңге	159,600	268,311
Орташа сату бағасы, теңге.кг	150	150
Жалпы өнім құны, теңге/ 1га	467,000	227,50
Пайда, теңге/1га	346,486	148,800
Рентабельділік деңгейі,%	61,3	32,4

 

Жоғарыда көрсетілген кестеден көріп отырғанымыздай, дәстүрлі әдіс пен In vitro жағдайында  өсірілген алма дақылының экономикалық тиімділігі жағынан айырмашылықтары бар.     1м  кв.   жер көлемінен   In vitro жағдайында   400 дана өсімдік отырғызуға болатындығы есептелінді, ал дәстүрлі әдіс бойынша тек қана 50 дана алма ағашы өсетіндігі белгілі. Шығын деңгейі бойынша дәстүрлі әдісте 268,311 мың теңге болатындығы анықталды. Ал рентабельділік деңгейі бойынша  In vitro жағдайында өсірілетін әдісте  61,3%  көрсетті.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Қорытынды

 

1. Алма дақылының экспланттарын залалсыздандыру кезінде оңтайлы залалсыздандырғыш ерітінділердің ішінен Белизна 1:5 қатынасындағы ерітінді жоғары көрсеткішті көрсетті. Осы нұсқада өңделген экспланттардың өміршеңдігі 93% құрады.
2. Алма дақылының 1 сортына минералдық құрамы әртүрлі қоректік орталарына өсіру тәжірибелерін жүргізу нәтижесінде,  25%, 50%  мл қосылған қоректік ортада жақсы өсетіндігі байқалды.
3. Микроклонды көбею кезінде бағаналы формалы баяу өсетін алмалардың генотипінің төбе бүршіктерін залалсыздандыру үшін 0,1 % сулема ерітіндісімен өңдеу  1 минут аралығында екендігі анықталды.
4. Алма дақылын микроклондық көбейту әдісі арқылы өсіру кезіндегі экономикалық тиімділік деңгейін анықтау барысында шығын деңгейі бойынша дәстүрлі әдісте 268,311 мың теңге болатындығы анықталды. Ал рентабельділік деңгейі бойынша In vitro жағдайында өсірілетін әдісте  61,3%  көрсетті.

 

 

 

 

 

 

 

                  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                    

Қолданылған әдебиеттер тізімі

 

1. Lodhi M.A., Reisch B.I. In situ hybridization in Vitis vinifera L // Theor. Appl. Genet. – 1995.-V.90. -P.11-16.
2. Kashif Ali, Federica Maltese, Young Hae Choi, Robert Verpoorte. Metabolic constituents of grapevine and grape-derived products // Phytochem Rev.-2010.-V.38. — P. 357-378.
3. Агафонов Н.В., Аладина О.Н., Лесничева А.Н., Фаустов В.В., Дьяков В.М., Казакова В.Н. Состав для укоренения черенков ягодных культур. -М.: Издательство МСХА, 1991. -С.115.

4.Воронина А.И., Глебова Е.И., Поташова А.И. Размножение и выращивание оздоровленного посадочного материала ягодных культур. –М.: Колос, 1999. — С. 96.

5. Рябушкина Н.А., Жунусова Ж. С., Ерболова Л.С.,.Берестнева Л.В, Галиакпаров Н.Н. Микроклональное размножение перспективных сортов винограда, созданных в Казахстане // Биотехнология. Теория и практика. – 2011. -№5. -С.23.
6. Bertsch C, Kieffer F, Maillot P, Farine S, Butterlin G, Merdinoglu D, Walter B. Genetic chimerism of Vitis vinifera cv. Chardonnay 96 is maintained through organogenesis but not somatic embryogenesis // BMC Plant Biol. -2005. -V.5. -P.1-5.
7. Рябушкина Н.А., Галиакпаров Н.Н. Перспективы генетической трансформации винограда (Vitis vinifera L.) с целью улучшения полезных признаков культуры // Биотехнология. Теория и практика. –2006. –№3. –C.16-26.
8. Скалий Л.П., Самощенков Е.Г. Размножение растений зелеными черенками. — М.: Издательство МСХА, 2002. — С. 115.
9. Ермаков Б.С. Размножение древесных и кустарниковых растений зеленым черенкованием. -Кишинев: Штиинца, 1981. -С. 68-72.
10. Гартман Х.Х., Кестер Д.Е. Размножение садовых растений. -М.: Центрполиграф, 2002. — С. 362
11. Павлова Н.Ю., Павлова А.Ю. Создание культурооборота при зеленом черенковании // Тезисы докладов Всероссийского совещания «Молодые ученые – садоводству России. — М.,1995. — С. 125-127.
12. Тарасенко М.Т., Ермаков Б.С., Прохорова З.А., Фаустов В.В. Новая технология размножения садовых растений. -М.: ТСХА, 1998. -С.65
13. Audeguin L., Boidron P., Bloy P., Grenan  S., Leclair  P., Boursiguot  J.M. L’Experimentation des clones de vigne en France. Etats des lieux, methodologie et perspectives // Progres Agricole et Viticole. — Montpellier, 1999. — V.116. — P. 486-491.
14. Иванова З.Я. Биологические основы и приемы вегетативного размножения растений стеблевыми черенками. -Киев: Наукова думка, 1982. — С. 288.
15. Martelli G.P., Walter В. Virus certification of grapevines (in: Hadidi A., Khetarpal  R. K., Koganezawa  H. (Eds.): Plant Virus Disease Control). — 1998. — P.30.
16. Krake L.R., Steele Scott N., Rezaian  M.A., Taylor  R.H. Graft-transmitted Diseases of grapevines. CSIRO Publishing, — 1999.  -P.4-8.
17. Полевой В.В. Фитогормоны. — Л.: Издательство ЛГУ, 1982. -С. 459.
18. Zlenko V.A., Troshin L.P., Kotikov  I.V. An optimized medium for clonal micropropagation of grapevines // Vine. -1995. — V.34. — P. 125-126.
19. Zlenko V.A., Troshin L.P., Kotikov  I.V. Der Einfluss der Nahrmedienzusammensetzung bei der in vitro-Vermehrung verschiedener Rebgenotypen // Mitteilungen Klosterneuburg. — 2001. -V.51. -P. 15.
20. Муромцев Г.С., Чкаников 20. Кефели В.И. Рост растений и природные регуляторы // Физиология растений. — 1997.- № 3.- С. 471-480.
21. Stamp J.A., Colby Sh.M., Meredith C.P. Direct shoot organogenesis and plant regeneration from leaves of grape (Vitis spp.) // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1990. -V.22. -P.127-133
22. Авторское свидетельство №65377. N-(3-фенилпроп-2-ин-1-ил)- N-бутилдитиокарбамат натрия (АН-16). 15.10.2010, бюллетень №10.
23. Дьяков В.М. Средства защиты растений на основе органического кремния // Тезисы докладов V международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» 29 июня – 1 июля 1999 года. — М.- 1999. -С. 179-184.
24. Peros J.P., Torregrosa L. and Berger G. Variability among Vitis vinifera cultivars in micropropagation, organogenesis and antibiotic sensibility // J Exp.Bot. -1998. -V.49. -P. 171-179.
25. Гончарук В.М. Эффективность совместного применения фиторегуляторов и микроэлементов на картофеле // Тезисы докладов VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях». – М, 2001. -С. 227-228.
26. Pandey R.N. Hormones in hortivulture // Indian Farmer Times. -1990. — T. 7. — P.9-11.
27. Дьяков В.М., Корзинников Ю.С., Матыченков В.В. Экологически безвредные регуляторы роста мивал и крезацин. Регуляторы роста растений. -М., 1990. -С. 52-61.
28. Гуськов А.В., Ракитин В.Ю., Горденков А.В. Об участии этилена в ауксин-зависимом ризогенезе // Тезисы докладов III Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений 1997 года». -М., 1997. -С. 87-88.
29. Bertsch C., Kieffer F., Maillot P., Farine S., Butterlin G., Merdinoglu D., Walter B. Genetic chimerism of Vitis vinifera cv. Chardonnay 96 is maintained through organogenesis but not somatic embryogenesis //BMC Plant Biol. -2005. -V.5. -P.1-7.
30. Кефели В.И., Турецкая Р.Х., Коф Э.М., Буханова Л.В. Онтогенез. -М., 1970. -С.53.
31. Медведева Н.И. Особенности микроклонального размножения интродуцентов и клонов винограда // Научный журнал КубГАУ.- 2008. -№40(6).- С.1-17.
32. Дьяков В.М., Корзинников Ю.С., Матыченков В.В. Экологически безвредные регуляторы роста мивал и крезацин. Регуляторы роста растений. -М., 1990. -С. 52-61.
33. Forneck A. Plant breeding: Clonality – a Concept for Stability and variability during vegetative propagation // Progress in Botany. –2005. –V.66. –P.164-182.
34. Аладина О.Н., Ханжиян И.И. Качество укорененных черенков ягодных культур в зависимости от их обработки регуляторами роста в период корнеобразования // Тезисы докладов V международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» 29 июня – 1 июля 1999 года. — М., 1999. -С. 145.
35. Gray D.J., Jayasankar S., Li Z. Vitis spp.Grape.// in: Biotechnology of Fruit and nut Crops. Ed. Litz R.E. Biotechnology in Agriculture series. -1999. -№ 29. -P. 672-706.
36. Franks T., Botta R., Thomas M.R. Chimerism in grapevines: implications for cultivar identity, ancestry and genetic improvement // Theor. Appl. Genet. -2002. -V.104. -P. 192-199.